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¿Cuál es el paso más crítico de la purificación de plásmidos?

¿Cuál es el paso más crítico de la purificación de plásmidos?


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Durante el proceso de purificación y cuantificación de plásmidos, ¿qué paso es el más crítico para el éxito del proceso?


Hay algunos pasos críticos (que suenan horribles si se escriben juntos, pero el método en sí es robusto y generalmente sin problemas):

  1. Resuspensión del gránulo: asegúrese de que esté realmente resuspendido y no flotando como una gran mancha. Si no se resuspende correctamente, los rendimientos se reducirán drásticamente.
  2. Lisis de NaOH / SDS: no lisar durante demasiado tiempo, ya que puede terminar con ADN de baja calidad. Esto desnaturaliza el plásmido y lo hace a menudo inútil para reacciones enzimáticas posteriores.
  3. Mezcla: no mezcle demasiado fuerte una vez que haya lisado las células, de lo contrario, puede romper el ADN genómico de las bacterias, que posteriormente permanece en solución y no se precipita durante la neutralización.
  4. Neutralización: asegúrese de mezclar bien aquí (invirtiendo los tubos 4-6 veces) pero no demasiado fuerte. Es fundamental neutralizar todo el lisado, de lo contrario, las proteínas pueden permanecer en solución.
  5. Secado: el secado excesivo de los gránulos puede causar problemas cuando intente disolverlos nuevamente.

¿Cuál es el propósito de la purificación de plásmidos?

Purificación de plásmidos. los purificación de plásmido El ADN de las células bacterianas es un paso importante en el flujo de trabajo de clonación. Durante purificación de plásmidos, las células bacterianas se lisan, liberando el ADN y otros componentes celulares de la pared celular.

Además, ¿cuál es el propósito del aislamiento del ADN plasmídico? Aislamiento de plásmidos. los aislamiento de ADN plasmídico de bacterias es una técnica crucial en biología molecular y es un paso esencial en muchos procedimientos como la clonación, ADN secuenciación, transfección y terapia génica. Estas manipulaciones requieren la aislamiento de alta pureza ADN plasmídico.

Posteriormente, también cabe preguntarse, ¿cuál es el propósito de la purificación del ADN?

Por purificación tu ADN muestras, reduce la probabilidad de que sucedan tales cosas y puede preservar mejor la calidad y pureza de sus ácidos nucleicos.

¿Cómo se purifica el ADN plasmídico a partir del ADN genómico?

Aislar ADN plasmídico, abre sus células y realiza una minipreparación, tratando de evitar contaminar ADN genómico. Para ADN genómico, abre sus celdas de una manera diferente y trata de aislar la mayor cantidad de contenido posible.


Dos y don y apostatos de la purificación de plásmidos

La purificación de plásmidos es una técnica común en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. Si bien el método estándar de lisis alcalina estaba bien establecido, una sorprendente cantidad de cosas aún pueden salir mal. Esta guía enumera algunos de los pros y los contras de la purificación de plásmidos.

Hacer: haz tu E. coli rico (al menos sus medios)

El rendimiento de plásmido de la misma cepa madre de E. coli puede variar mucho dependiendo de muchos factores. Los medios estándar como el LB (caldo de lisogenia) funcionan bien para el crecimiento y la producción de plásmidos. Sin embargo, los medios más ricos (como Terrific Broth, "TB") pueden aumentar el rendimiento de plásmido por ml de cultivo. Esto es especialmente útil para aumentar la cantidad de plásmido de copias bajas recolectadas de volúmenes de cultivo más pequeños.

Los medios más ricos (como el caldo Terrific, "TB") que soportan niveles más altos de crecimiento de bacterias que los medios de cultivo estándar (caldo de lisogenia, LB), dan como resultado un mayor rendimiento de plásmidos de copia baja y copia alta. Los cultivos de E. coli transformados con un plásmido de bajo número de copias o de alto número de copias se hicieron crecer en LB o TB durante 18 horas, luego se procesó un volumen igual de cultivo y se midió el rendimiento total de plásmido (ng) / ml de cultivo.

No: Olvídese de agregar antibióticos a su cultivo.

Un error sorprendentemente común, si olvida agregar antibiótico (o agrega muy poco) a su cultivo, puede experimentar la pérdida de su plásmido debido a una presión selectiva inadecuada. Asegúrese de verificar dos veces la concentración de su antibiótico en los cultivos.

Hacer: Agitar las cosas

A menudo cultivado en frascos, E. coli los cultivos requieren una aireación adecuada para un crecimiento óptimo. Por lo general, esto requiere agitar el cultivo a 200-250 rpm (revoluciones por minuto). Además, considere aumentar la aireación del cultivo ya sea teniendo una proporción mínima de cultivo a volumen de aire de

1: 5 y considere usar matraces de cultivo con deflectores. Finalmente, asegúrese de que el cultivo reciba suficiente aireación usando una cubierta como una lámina (ligeramente suelta), un tapón de algodón o una membrana permeable al oxígeno.

No: sobrecrezca su cultura

Otro caso en el que más no es mejor, si permite que su cultivo crezca durante demasiado tiempo, experimentará contaminación del ADN genómico y preparaciones de plásmidos de baja calidad. Es mejor procesar tus células

12-18 horas después de la inoculación, una vez que el cultivo es denso, pero antes del crecimiento excesivo.

Hacer: medir el diámetro exterior600

El OD600 es una buena forma de estimar la densidad de su cultivo para saber cuándo procesar sus células. Debido a que las densidades ópticas altas no se pueden medir, tome una alícuota del cultivo, diluya diez veces y mida con un espectrofotómetro estándar. Los cultivos están listos para su procesamiento en un OD600 de 0,2-0,35 para un cultivo diluido diez veces.

No: exceda los límites de entrada de cultura

Muchos kits de preparación de plásmidos vienen con recomendaciones sobre las condiciones de cultivo y las aportaciones. Siga estos cuidadosamente para asegurarse de no sobrecargar las columnas. Agregar demasiado cultivo es una forma segura de obstruir la columna y reducir el rendimiento de la purificación.

Hacer: Sea amable

Una de las claves para la purificación adecuada del plásmido es la separación del ADN genómico del ADN del plásmido. Los sedimentos bacterianos se pueden resuspender en el tampón P1 pipeteando o agitando con vórtex. Sin embargo, no puede mezclarlo con demasiada brusquedad durante la lisis, ya que puede cortar el ADN genómico que puede unirse a la matriz de la columna y contaminar su preparación.

No: ignore el tiempo de lisis

Algunas personas pueden pensar que más tiempo es mejor cuando se trata de lisis, asumiendo que es mejor no dejar ADN. Sin embargo, la lisis alcalina de E. coli sólo puede llegar hasta cierto punto para crear un lisado claro. Más cultivo conduce a más detritos, pero potencialmente no hay lisis adicional o liberación de plásmido si se usa muy poco tampón de lisis. Además, diferentes cepas de E. coli varían en su susceptibilidad a la lisis alcalina. Lo que es más importante, los tiempos de lisis demasiado largos pueden conducir a la desnaturalización del ADN plasmídico, lo que da como resultado preparaciones de mala calidad.

Hacer: neutralizar completamente los lisados

Una vez que agregue las soluciones de neutralización y las mezcle con su lisado, ¡no pase inmediatamente al siguiente paso! La neutralización incompleta puede dar lugar a preparaciones de mala calidad. Asegúrese de invertir el tubo varias veces para asegurarse de que el lisado esté completamente neutralizado. Incluso si se observa un gran precipitado esponjoso, deje un poco más de tiempo (consulte los protocolos) para asegurar la mezcla completa de la solución.

No: Pipetee los desechos

Después del paso de neutralización, muchas preparaciones de plásmidos requieren centrifugación para separar el ADN de los restos celulares, aclarando así el lisado. Durante este paso, es importante trabajar lentamente y evitar transferir restos celulares innecesarios al siguiente paso que puede interferir con la unión y / o disminuir la pureza.

Hacer: agregar alcohol

Muchos kits de preparación de plásmidos contienen tampones de lavado que utilizan etanol. Estos tampones a menudo vienen como un concentrado que debe diluirse en etanol antes de su uso. Este es un error común que a menudo se olvida y conduce al fracaso de la preparación. Además, no olvide asegurarse de que la tapa esté bien enroscada para evitar la evaporación del etanol. Su próxima preparación de plásmidos se lo agradecerá.

No: Microondas los tampones

Algunos tampones (P2 y tampón de unión) pueden precipitar durante el envío. Sin embargo, no intente calentar los tampones en el microondas para hacer que el precipitado vuelva a la solución. En su lugar, incube los tampones a 30-37 ° C durante hasta 10 minutos y mezcle invirtiendo las botellas varias veces.

Hacer: comprobar la pureza

Una razón común de los problemas de transformación posteriores es la contaminación por sales y proteínas. Asegúrate de medir la A260/A280 y A260/A230 proporciones después de cada purificación para asegurarse de que sus preparaciones estén limpias y claras. Por lo general, las proporciones superiores a 1,8 se consideran puras y libres de contaminantes.

No: procese demasiadas muestras a la vez

Si bien puede resultar tentador acumular las preparaciones para maximizar la eficiencia del tiempo, algunos pasos en la purificación del plásmido son sensibles al tiempo. No intente procesar demasiadas preparaciones a la vez, o algunas preparaciones podrían permanecer demasiado tiempo y arruinarse.

Hacer: elución en caliente

Si los plásmidos son & gt 10 kb, considere usar tampón de elución calentado a 50 ° C para aumentar la eficiencia de elución de la matriz de la columna. Además, el tampón de elución se puede dejar en la columna durante 5-10 minutos antes de la centrifugación.

No: Olvídese de las endotoxinas

Algunas aplicaciones posteriores, como la transfección de líneas celulares sensibles, requieren preparaciones de plásmidos sin endotoxinas. Las tecnologías de eliminación de endotoxinas simples y rápidas pueden eliminar estos contaminantes rápidamente, lo que garantiza un plásmido de alta calidad y grado de transfección.

Hacer: Purificación perfecta de plásmidos

Si bien la lista podría continuar, estos son algunos de los pros y los contras de la purificación de plásmidos más importantes. ¡Intente seguirlos en su próxima purificación y garantice un alto rendimiento exitoso de preparaciones de plásmidos puros y limpios en poco tiempo!


Métodos innovadores utilizados en biología molecular: 3 métodos

Los orgánulos son vesículas encerradas en membranas dentro de todas las células eucariotas que funcionan en una variedad de procesos celulares importantes. Aquí se describe un método para el aislamiento de varias fracciones subcelulares de hígado de rata mediante una técnica denominada centrifugación diferencial. Estas fracciones se pueden usar para analizar la presencia de orgánulos específicos usando ensayos enzimáticos.

La disposición de las macromoléculas dentro de una célula es tan importante para la función celular como sus actividades catalíticas. La compartimentación celular proporciona eficiencia al reunir compuestos relacionados que pueden interferir entre sí (es decir, enzimas hidrolíticas lisosomales). La compartimentación celular se logra en parte mediante varios orgánulos subcelulares. El método utiliza centrifugación diferencial para aislar componentes de diferentes densidades. Con esta técnica, los orgánulos más pesados ​​o densos, los núcleos se sedimentan en menos tiempo y con menos fuerza de la que se requiere para sedimentar orgánulos más ligeros como las mitocondrias. Primero, se produce un homogeneizado celular rompiendo las membranas celulares del tejido.

A continuación, el homogeneizado se centrifuga durante un breve período de tiempo para eliminar los restos celulares y los núcleos. El sobrenadante se transfiere luego a otro tubo y se centrifuga durante más tiempo para sedimentar las mitocondrias más ligeras. El método de fraccionamiento depende del tipo de tejido y del orgánulo a aislar. Las poblaciones de células homogéneas de cultivo celular son muy adecuadas para el fraccionamiento celular. Algunos tejidos, como los del hígado, también tienen un tipo de célula que predomina, por lo que también son adecuados. La mayoría de los tejidos vegetales sin clorofila son aceptables para preparar mitocondrias, pero generalmente se requieren tejidos vegetales recién cosechados.

Una vez que se elige un tipo de célula, es importante obtener los orgánulos en un estado bioquímicamente activo y morfológicamente completo (tabla 23.1). Los homogeneizadores se utilizan para romper las células sin dañar los orgánulos. Los homogeneizadores tienen una separación precisa entre el tubo de vidrio y el mortero, que rompe la membrana celular dejando intactas las membranas de los orgánulos más pequeños. El tampón de homogeneización es una solución que a menudo incluye sacarosa para deshidratar parcialmente los orgánulos, manteniéndolos intactos.

Ninguna técnica utilizada para aislar orgánulos es perfecta. Es muy difícil obtener preparaciones puras e ininterrumpidas de cualquier orgánulo. Las técnicas que proporcionan un aislamiento óptimo de un orgánulo pueden romper completamente otro orgánulo. Por tanto, los métodos se utilizan a menudo para medir la contaminación de una fracción de orgánulos por otra. Esto se puede hacer analizando cada fracción de orgánulos en busca de enzimas marcadoras específicas de orgánulos.

Método de homogeneización de tejidos:

2 g) del tejido a un homogeneizador de vidrio en hielo. No utilice un homogeneizador de vidrio esmerilado ajustado en este paso, ya que las membranas de orgánulos pueden romperse parcialmente.

2. Añada 18 ml de tampón de homogeneización helado al homogeneizador. Nota: el calcio del tampón se utiliza aquí para estabilizar las membranas de los orgánulos.

3. Homogeneizar 3-5 pasadas hasta obtener un homogeneizado homogéneo. Mantenga el homogeneizador en hielo. Precaución: El triturado o calentamiento excesivo puede dañar e inactivar las fracciones subcelulares.

4. Transfiera el homogeneizado a un tubo de plástico de 50 ml en hielo.

5. Repita los pasos 6-9 (combinando todos los homogeneizados) hasta que se haya homogeneizado todo el tejido hepático picado (Fig. 23.1).

Aislamiento de núcleos:

6. Centrifugue el tubo a 700 x g durante 10 min a 0 ° C. El sedimento contiene los restos celulares y los núcleos. El sobrenadante contiene todas las fracciones celulares más ligeras.

7. Sin alterar el sedimento nuclear crudo, decante con cuidado el sobrenadante en otro tubo en hielo. Dado que las mitocondrias están presentes en el sobrenadante, esto se usa para el aislamiento de las mitocondrias, mientras que el sedimento se puede usar para el aislamiento de los núcleos.

8. Continuar con el aislamiento nuclear: Nuclear Wash:

una. Agregue 10 ml de tampón de homogeneización helado a su sedimento nuclear crudo.

B. Utilice un homogeneizador de teflón para volver a suspender el sedimento en el tampón.

C. Coloque dos capas de gasa en un embudo sobre un tubo. Filtrar la suspensión de 10 ml a través de la gasa.

D. Enjuague los residuos en el filtro con otros 10 ml de tampón de homogeneización recogiendo el filtrado en el tubo. Deseche el filtro con sus restos celulares.

mi. Centrifugue los filtrados combinados (20 ml) a 1500 x g durante 10 min a 0 ° C. El sedimento contiene la fracción nuclear lavada. Sin alterar el sedimento nuclear, deseche el sobrenadante.

9. Añada 5,0 ml de tampón de homogeneización helado al sedimento nuclear.

10. Utilice un homogeneizador de teflón para volver a suspender el sedimento en el tampón.

11. Con una pipeta, coloque alícuotas de la suspensión nuclear en dos tubos de ensayo de vidrio.

12. Etiquete los dos tubos de vidrio & # 8220Nuclei & # 8221 y guárdelos a -20 ° C. Precaución: Los tubos de vidrio no deben tener más de la mitad de su capacidad o pueden romperse al congelarse.

Aislamiento de mitocondrias:

13. Obtenga el sobrenadante del paso 12 en un tubo sobre hielo.

14. Centrifugar a 5.000 x g durante 15 min a 0 ° C. El sedimento contiene la fracción mitocondrial cruda. El sobrenadante contiene microsomas, fragmentos de membrana, ribosomas, enzimas citoplasmáticas, etc.

15. Sin alterar el sedimento mitocondrial, decante con cuidado el sobrenadante post-mitocondrial (y la capa rosa que se sedimenta parcialmente) en un cilindro graduado.

16. Vierta el sobrenadante en un tubo limpio con hielo.

17. El sobrenadante se puede utilizar para el & # 8220Aislamiento de los microsomas & # 8221.

18. Continuar con el aislamiento mitocondrial: Lavado mitocondrial

una. Agregue 20 ml de tampón de homogeneización helado al sedimento mitocondrial crudo.

B. Usando un homogeneizador de teflón, resuspenda el sedimento en el tampón.

C. Vierta la suspensión nuevamente en el tubo, agregue otros 20 ml de tampón, mezcle y centrifugue a 234,000 x g durante 10 min a 0 ° C. El gránulo contiene las mitocondrias lavadas.

D. Sin alterar el sedimento mitocondrial, decantar y desechar el sobrenadante.

19. Añada 5,0 ml de tampón de homogeneización helado al sedimento mitocondrial.

20. Con un homogeneizador de teflón, vuelva a suspender el sedimento en el tampón. Así es como mediante la centrifugación diferencial se pueden aislar y estudiar varios orgánulos.

Método # 2. Purificación de ácidos nucleicos, análisis de rendimiento de ADN purificado:

Purificación de ADN genómico y plasmídico:

El ADN genómico y plasmídico se puede aislar de las células al romper las células y luego explotar las diferencias en las propiedades entre el ADN, las proteínas y otros componentes. No existe un método universal para la purificación del ADN genómico. El método de purificación del ADN depende de la naturaleza del material de origen. El ADN de plantas es más difícil de obtener en forma clonable que de animales debido a la presencia de metabolitos secundarios y polisacáridos y al grado de interferencia de sustancias presentes en esa fuente.

La primera purificación de ADN cromosómico informada fue en 1944 por Avery y colaboradores de las células & # 8220S & # 8221 de Diplococcus pneumoniae Tipo II. Estas células contenían una gran cantidad de polisacárido capsular y el método se desarrolló para purificar el ADN y eliminar el contaminante.

Desde hace unos quince años, el método Avery & # 8217s con algunas modificaciones continuó utilizándose para la solución de ADN. Gradualmente se fue dando cuenta de que era necesario mejorar el rendimiento y también el tamaño del ADN. Las desoxinucleasas que se liberaron en la lisis celular degradaron una gran parte del ADN. Marmur introdujo el uso de tampón alcalino (Tris 0,1 M, pH 9,0) y dodecilsulfato de sodio. Se encontró que tanto el pH alto como el dodecilsulfato de sodio inactivaban las nucleasas.

Además, la operación de lisis a realizar a baja temperatura (0-2 ° C) para ralentizar las enzimas y la posterior extracción con fenol enfriado saturado con el tampón pH 9.0, que desnaturaliza las proteínas unidas al ADN y consecuentemente aumenta el rendimiento de ADN.

El ADN se precipitó de la capa acuosa con etanol como hizo Avery. La prueba de Lowry no pudo detectar ninguna proteína en la muestra de ADN, pero había algo de ARN. Todos los métodos desarrollados posteriormente para el aislamiento de ADN cromosómico de bacterias, virus y células animales en cultivo se han derivado en gran medida del método de Marmur. Se ha introducido EDTA en el medio de lisis para inactivar nucleasas que se sabe que dependen de Mg ++. En algunos métodos, el fenol se ha reemplazado por una mezcla de volúmenes iguales de fenol y cloroformo.

Dado que se cree que el tratamiento con fenol corta grandes moléculas de ADN, se han desarrollado métodos que evitan el fenol y estos métodos probablemente producen ADN de mejor calidad a expensas de la cantidad. Cuando se desea aislar ADN de tejido animal o vegetal, los pasos mencionados anteriormente deben ir precedidos de un procedimiento para obtener polvo celular a partir del tejido triturado. El tejido se pica finamente y luego se desintegra completamente en una licuadora Warring con nitrógeno líquido. Este paso a veces se realiza en un mortero. El polvo que queda después de la evaporación del nitrógeno líquido se extrae con el tampón alcalino (pH 8,0 a 9,0) que contiene EDTA y el detergente.

Posteriormente, la mezcla se trata con proteasa y ribonucleasa seguido de fenolización. Un problema que se encuentra con bastante frecuencia con el tejido vegetal es la presencia de una gran cantidad de polisacáridos. El ADN vegetal libre de polisacáridos se obtiene mediante centrifugación en equilibrio con cloruro de cesio y bromuro de etidio como se describe en la sección Purificación del ADN plasmídico.

Diferentes tipos de procedimientos de aislamiento:

1. Extracción de SDS-fenol:

Este es el método más simple y rápido para el aislamiento de ADN y se usa ampliamente con hongos filamentosos y material vegetal. La técnica utiliza SDS con fenol para desnaturalizar y disolver las hifas maceradas dejando intacto el ADN. Luego, el ADN se precipita de la solución con un volumen preciso de isopropanol.

2. Tratamiento con SDS-proteinasa K:

Esta técnica es aplicable a la mayoría de los materiales y se basa en proteinasa K y SDS para disolver la muestra y digerir el componente proteico sin afectar el ADN. A continuación, la muestra se extrae con desnaturalizantes de proteínas (fenol, fenol-cloroformo, cloroformo) y el líquido acuoso que contiene el ADN se dializa y se precipita con etanol o isopropanol en una solución de acetato de sodio o amonio. La ARNasa puede o no usarse dependiendo de los diferentes protocolos usados.

El aislamiento de ADN de plantas se consigue preferiblemente mediante tratamiento con CTAB. Este detergente tiene una carga positiva que interactúa con la carga negativa del ADN en alta concentración de sal y forma un complejo soluble. En los pasos siguientes, una disminución en la concentración de sal provoca la precipitación del ADN, dejando otros compuestos, especialmente polisacáridos, en solución. La preparación de ADN a partir de tejido animal que se encuentra en mucopolisacáridos también podría realizarse mediante esta técnica que produce material de buena calidad.

Aislamiento de ADN plasmídico:

Los plásmidos son moléculas de ADN circular bicatenario extracromosómico presentes en bacterias y eucariotas inferiores que existen en estado súper helicoidal in vivo, estando el tamaño del plásmido en el rango entre 1 kb y más de 300 kb. El ADN cromosómico es mucho más grande y, aunque también podría ser circular, se vuelve lineal mediante la presión de corte durante la lisis celular y el procedimiento de aislamiento del ADN. Estas moléculas lineales largas invariablemente se enredan en los restos de las células lisadas.

Los primeros procedimientos de aislamiento de plásmidos se desarrollaron a finales de la década de 1960 en el laboratorio de Donald R. Heiliski en la Universidad de California en San Diego. La lisis celular se logró mediante el uso de EDTA, lisozima y un detergente no iónico suave como Triton X-100 a pH 8,0 y evitando agitación vigorosa. Luego se incorporó un paso de centrifugación para sedimentar preferentemente las moléculas de ADN cromosómico enredadas en los restos celulares.

La solución sobrenadante contenía los plásmidos, que se trataron sucesivamente con ribonucleasa y proteinasa. Siguió el tratamiento con fenol, la extracción con cloroformo y alcohol isoamílico # 8211 y la precipitación del ADN plasmídico con etanol enfriado. En otro procedimiento, el rendimiento aumentó mucho mejor al llevar rápidamente a ebullición la suspensión de células tratadas con lisozima, manteniéndola a 100 ° C durante 40 segundos y luego sumergiéndola inmediatamente en agua helada. El ADN cromosómico se eliminó como de costumbre mediante centrifugación.

Puede observarse aquí que aunque los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras de ADN dúplex se rompen con álcali o los enlaces se reforman instantáneamente al restablecerse el pH o la temperatura favorables, debido a su naturaleza circular cerrada. Sin embargo, las preparaciones de ambos métodos contenían una mayor proporción de fragmentos lineales contaminantes de ADN cromosómico.

Purificación de ADN plasmídico:

Ultracentrifugación isopícnica:

El ADN plasmídico se puede purificar mediante centrifugación en equilibrio en un gradiente de bromuro de etidio de cloruro de cesio (CsCl). Los tintes como el bromuro de etidio y el bromuro de propidio se unen al ADN dúplex intercalando entre las dos hebras. Esta intercalación es mucho mayor en el caso de ADN dúplex lineal, aparentemente debido al fácil acceso a través de los dos extremos abiertos y al menos con ADN plasmídico covalente, circular cerrado superenrollado.

El tinte unido provocó una mayor reducción en la densidad de flotación aparente del ADN lineal en comparación con la del ADN circular y, por lo tanto, los plásmidos podrían separarse del ADN cromosómico lineal mediante centrifugación en equilibrio, el gradiente de densidad de CsCl (Fig. 23.2) muestra la posiciones relativas de proteínas, ADN lineal o ADN plasmídico cortado, ADN plasmídico superenrollado y ARN monocatenario.

El ADN del plásmido se recuperó perforando el tubo de centrífuga con una aguja hipodérmica (no demasiado fina) justo debajo de la banda del plásmido que se podía visualizar mediante luz ultravioleta de longitud de onda baja. Se ha descrito el principio detrás de la purificación centrífuga.

Hay muchas operaciones de ingeniería genética en las que no se requiere ADN plasmídico muy puro. Se encuentran disponibles comercialmente varias columnas pequeñas que pueden usarse eficazmente para obtener una preparación de ADN plasmídico considerablemente puro a partir de una preparación cruda incluso a partir de un lisado celular. Estas columnas contienen, entre otros materiales, resina a base de sílice o sistemas de intercambio aniónico de membrana, partículas paramagnéticas o simplemente polvo de vidrio simple.

Cromatografía de adsorción:

En cromatografía, se utiliza hidroxiapatita que se une a las proteínas y ácidos nucleicos a baja concentración de fosfato. Si la concentración de fosfato aumenta gradualmente, las proteínas y el ARN se eluyen primero, seguidos de pequeñas moléculas de ARN, es decir, ADN plasmídico y finalmente de alto peso molecular, es decir, ADN cromosómico a la concentración más alta de fosfato. Cuando se carga un lisado transparente en una columna de hidroxiapatita, se produce la separación según el principio mencionado anteriormente.

Electroforesis preparativa:

La molécula de plásmido, especialmente en su forma CCC superhelical completa, puede separarse fácilmente del ARN y del ADN cromosómico grande mediante electroforesis en gel de agrosa. Puede producir ADN en mg y también puede dar una idea del peso molecular del ADN comparándolo con el marcador de peso molecular.

Aislamiento de ARN:

Las células contienen ribonucleasas y, por lo tanto, la inactivación de esta enzima durante la lisis celular es crucial. Por tanto, durante la lisis celular se añaden agentes que inactivan eficazmente las ribonucleasas. Se sabe que los detergentes iónicos dodecilsulfato de sodio y laurilsarcosinato de sodio inhiben las ribonucleasas y se utilizan con frecuencia. Los agentes reductores como el P-merceptoetanol interfieren con la estructura terciaria de la ribonucleasa y podrían usarse eficazmente para inactivar la enzima.

Una vez que se obtiene el lisado celular, el ARN se aísla mediante pasos similares a los del aislamiento del ADN. El ADN del lisado celular se comparte mediante la expulsión repetida a través de una fina aguja hipodérmica, se añaden enzimas proteolíticas y luego el ARN se extrae con fenol o una mezcla de fenol y cloroformo.

El siguiente paso crítico aquí es reducir el pH a pH 4,7-5,2 y también saturar el fenol que se utilizará para la extracción con tampón acetato pH 4,7-5,2 en lugar de tampón Tris pH 8,0. Esto lleva al ADN a la interfase de fenol y agua y deja el ARN en la fase acuosa. El ARN se precipita como de costumbre a partir de la fase acuosa mediante etanol o isopropanol.

El ARN ribosómico constituye el 80-85% del ARN celular total, el ARN de transferencia y el ARN nuclear pequeño (en el caso de eucariotas) constituyen aproximadamente el 10-15%, mientras que el ARN mensajero constituye aproximadamente el 1-5%. Para la mayoría de los experimentos de ingeniería genética, lo importante es el ARN mensajero.

Purificación de ARN mensajero:

El ARN mensajero bacteriano se puede separar del ARN ribosómico y de transferencia mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa a velocidad o electroforesis en gel. El método para la purificación de ARNm eucariota fue desarrollado por Philip Leder en 1972 aprovechando el hecho de que el ARNm suele tener una cola múltiple. El poliA ARN podría separarse de otras especies de ARN mediante cromatografía de afinidad a través de una columna de oligo (dT) celulosa. Algunos también han utilizado una columna de poliU sefarosa.

Análisis de rendimiento de ácido nucleico:

Análisis de rendimiento de ADN:

El análisis del rendimiento de ADN purificado se realiza mejor mediante el método de la difenilamina. La intensidad del color azul formado a pH ácido se determina controlando la absorción a 595 nm. Este ensayo es específico y se puede utilizar para analizar el ADN incluso en una preparación de ADN crudo.

Un método rápido pero menos sensible y mucho menos específico que se utiliza con bastante frecuencia es determinar la absorción del propio ácido nucleico a 260 nm. Este ensayo se basa en el hecho de que la base de purina y pirimidina presente en los ácidos nucleicos absorben como máximo alrededor de 260 nm. Este ensayo obviamente sería positivo tanto para ADN como para ARN, nucleótidos y nucleósidos libres e incluso a base de purina y pirimidina, pero en una muestra de ADN o ARN purificada, el ensayo es confiable. Otro ensayo rápido pero muy aproximado de ADN bicatenario es mediante la estimación visual de la fluorescencia ultravioleta del ADN en una gota provocada por bromuro de etidio.

Análisis de rendimiento de ARN:

Es obvio a partir de la subsección anterior que el rendimiento de ARN también se puede determinar controlando la absorción a 260 nm siempre que sea una muestra pura de ARN. Un método más específico y sensible se basa en el seguimiento del color desarrollado por reacción con orcinol. La muestra de ARN se hierve con orcinol recristalizado en presencia de FeCl y HCl.

El color verde desarrollado se controla a 655 nm. La ribosa ligada solo a las purinas contribuye al color. La especificidad de esta reacción no es tan buena como la reacción de la difenilamina para el ADN 2- Desoxirribosa El ADN metil pentosa, el ácido hexurónico y las aldoheptosas también producen algo de color verde que da absorbancia en esa región.

Método # 3. Secuencia ADN:

La secuenciación de ADN es la determinación de la secuencia precisa de nucleótidos en una muestra de ADN. Antes del desarrollo de los métodos de secuenciación directa del ADN, la secuenciación del ADN era difícil e indirecta. El ADN tenía que convertirse en ARN, y los engorrosos métodos existentes podían realizar una secuenciación limitada del ARN. Por tanto, con este método sólo se pudieron determinar secuencias de ADN más cortas. Usando este método, Walter Gilbert y Alan Maxam de la Universidad de Havard determinaron que el operador Lac es una secuencia de 27 pb de longitud.

El desarrollo de técnicas de secuenciación directa de ADN cambió el alcance de la investigación biológica. La evolución de la tecnología de secuenciación de ADN desde la secuenciación más-menos hasta la piro-secuenciación en unos 20 años es paralela al progreso en biología desde la biología molecular hasta la genómica.

El desarrollo de técnicas de secuenciación de ADN con mayor velocidad, sensibilidad y rendimiento es de suma importancia para el estudio de sistemas biológicos. La determinación de la secuencia se realiza con mayor frecuencia utilizando tecnología de terminación de cadena de di-desoxi. La pirosecuenciación, un método bioluminométrico no electroforético en tiempo real para la secuenciación del ADN, ha surgido como una tecnología de secuenciación de vanguardia.

Esta tecnología tiene la ventaja de precisión, facilidad de uso y alta flexibilidad para diferentes aplicaciones. La pirosecuenciación permite el análisis de variaciones genéticas, incluidos SNP, inserciones / deleciones y repeticiones cortas, así como evaluar el desequilibrio alélico del ARN, el estado de metilación del ADN y el número de copias del gen.


Purificación de plásmidos

La purificación de ADN plasmídico de células bacterianas es un paso importante en el flujo de trabajo de clonación. Durante la purificación del plásmido, las células bacterianas se lisan, liberando el ADN y otros componentes celulares de la pared celular. Luego se eliminan los componentes celulares y el lisado que contiene ADN se procesa para eliminar más contaminantes que separan el ADN plasmídico del ADN genómico.

El kit Monarch Plasmid Miniprep es un método rápido y confiable para la purificación de ADN plasmídico de alta calidad a partir de cultivos bacterianos. Este método emplea pasos estándar de resuspensión celular, lisis alcalina y neutralización, con el beneficio adicional de indicadores de color en ciertos pasos para monitorear fácilmente la finalización. Los tampones de lavado exclusivos garantizan la eliminación de sales, proteínas, ARN y otros componentes celulares, lo que permite la elución de ADN concentrado y de alta pureza. La elución en tan solo 30 & microl proporciona ADN concentrado para su uso en aplicaciones posteriores, como digestión con enzimas de restricción, secuenciación de ADN, PCR, otras manipulaciones enzimáticas y transfección de líneas celulares robustas. Para obtener más información, consulte los datos de rendimiento del kit Monarch Plasmid Miniprep.

Los kits de minipreparación de plásmidos Monarch proporcionan una purificación rápida y fiable, un tiempo de intervención reducido y una elución en volúmenes bajos.

Nuestro diseño de columna único ofrece varias mejoras con respecto a otros productos disponibles comercialmente, incluida la eliminación de la retención de tampón y la elución en tan solo 30 & microlitros.

Elija el tipo:

  • Eluir en tan solo 30 μl
  • Evite la retención de tampón y el arrastre de sal con un diseño de columna optimizado
  • Reduzca el tiempo de uso con protocolos más rápidos y menos tiempo de centrifugado
  • Supervisar la finalización de ciertos pasos mediante el sistema de amortiguación de colores
  • No es necesario agregar RNase antes de comenzar
  • Etiquete columnas fácilmente con pestañas y superficies esmeriladas
  • Buffers y columnas disponibles por separado
  • Se utiliza mucho menos plástico en comparación con otros kits
  • Envases reciclables y de origen responsable
  • Sin tarifas por materiales peligrosos
  • Culture Volume: 1-5 ml, not to exceed 15 OD units.
  • Binding Capacity: up to 20 &mug
  • Plasmid Size: up to 25 kb
  • Typical Recovery: up to 20 &mug. Yield depends on plasmid copy number, host strain, culture volume, and growth conditions.
  • Elution Volume: &ge 30 &mul
  • Purity: A260/280 and A260/230 &ge 1.8
  • Protocol Time: 10.5 minutes of spin and incubation time
  • Compatible Downstream Applications: restriction digestion and other enzymatic manipulations, transformation, transfection of robust cells, DNA sequencing, PCR, labeling, cell-free protein synthesis, etc.

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Purification of plasmid DNA from bacteria

Fondo:
There are a number of methods for DNA purification, all of which are carried out by some variation of basic procedures: lysis/rupture of ‘host’ cells and separation of liberated DNA from other cellular components in a form which is useable for intended downstream applications.

Over the years, the methodology for DNA purification has evolved towards procedures that are faster, easier, and more convenient than earlier methods, and involve minimal use of toxic organic chemicals (such as phenol and chloroform). In common use now are silica resins pre-packed into chromatography columns, combined with buffer systems that are designed to allow for specific binding of nucleic acids to the resin. Larger cellular ‘contaminants’ (macromolecules) are typically precipitated out and removed, either by centrifugation or filtration, from the ruptured cell mixture prior to the mixture’s application to the silica column. Subsequently, the mixture of nucleic acid plus smaller contaminants (metabolites, peptides, etc.) is applied to the column under conditions that favor nucleic acid binding. One or more ‘wash’ steps with the appropriate buffer(s) remove weakly bound contaminants, after which pure nucleic acid is eluted from the resin. (See “workflow” diagram, next page.)

In this protocol, you will purify your plasmid DNA from other bacterial cell components in the lysates (subcellular preparations) of the host bacteria. Protocol is to be performed for two replicate samples (colonies) of transformed bacteria.

Reactivos
Each team will need a bucket of ice. At each station you should have:

-Resuspension buffer (P1), containing RNase A and “LyseBlue” pH indicator, see below
-Alkaline lysis buffer (P2)
-Neutralization buffer (P3) (keep on ice)
-Equilibration buffer (QBT) for Midi tip-100 silica-DEAE resin
-Wash buffer (QC)
-Elution buffer (QF)
-Isopropanol
-70% ethanol
(all solutions at room temperature, except for P3)

1. Harvest bacteria with your plasmid: Retrieve your two flasks of bacteria if growth was successful, the media will be quite “cloudy”. Using sterile serological pipettes, transfer 14 ml of cell suspension from each flask to a labeled high- speed centrifuge tube. Eyeball your two tubes and make sure they’re at the same height if not, make the necessary adjustments. Proper balance is important when centrifuging, especially at the higher speeds.

Spin the bacteria in the high-speed centrifuge (room 408) for 15 minutes at 6000 x g at 4oC. (We will likely spin the entire class’s samples together.) Carefully decant into designated container with bleach.

2. Resuspend the bacterial cell pellet: First, ‘shake’ or vortex your aliquot of P1
Resuspension buffer immediately before first use. (This resuspends the particles of “LyseBlue” pH indicator.) Then add 4 mL of P1 buffer to each of your bacterial pellets. Cap the tubes and vortex the mixture at high speed until there are no cell clumps remaining. It is important to completely resuspend the bacterial cells at this stage. Note that the bacteria are still intact at this point you have not yet lysed them.

3. Lyse the host bacterial cells: First, transfer (by pouring) each bacterial cell suspension to a clean, labeled 50 ml blue-top tube. Pipette in 4 mL of Alkaline Lysis Buffer P2 to each tube, replace the cap (close tightly) and immediately mix by inverting the closed tubes 4-6 times (do not shake). DO NOT VORTEX (this will shear genomic DNA into fragments that will co-purify with plasmid DNA, which we do not want). Do not allow the lysis reaction to proceed for more than 5 minutes, at

room temperature. The aliquot of Buffer P2 should be re-closed immediately after use, to avoid acidification from CO2 in the air. (The cell suspension should turn uniformly blue after addition of Lysis Buffer P2 and appropriate mixing, due to the “LyseBlue” reagent that was added to Buffer P1.)

5 min incubation in P2, label your prepared QIAfilter Syringe Cartridges (one cartridge for each sample) make sure they are nearby as you perform the next step.

4. Precipitate out the larger cell components: After the

5 min incubation in P2 is complete, pipette in 4 mL of chilled Neutralization buffer (P3) to each lysate, re- cap tubes, and mix immediately and thoroughly by vigorously inverting the closed tube 4-6 times (don’t shake!!). Immediately after mixing is complete, pour each lysate into the barrel of the appropriately labeled, capped QIAfilter Syringe Cartridge. Leave at room temperature for at least 10 minutes, without disturbing. (Addition of Buffer P3 to the blue solution turns it uniformly colorless after appropriate mixing.) This step neutralizes the suspension and enhances precipitation of detergent, plus bacterial genomic DNA, proteins, and larger cell debris. (You will see a fluffy white material form, and the lysate should become less viscous).

During the 10 minute incubation, set up and label a QIAGEN-tip 100 (containing the silica-DEAE anion exchange resin) for each sample, so that it is suspended over a 50 ml “waste” tube (using the purple holders). Equilibrate (prime) each column by
adding 4 mL of Equilibration buffer (QBT) to each column. Allow it to empty completely into the waste tube by gravity flow. The drained columns will not dry out, and are safe to leave in this manner for awhile if necessary.

5. Bind plasmid DNA to the column: After the 10 min incubation in P3 buffer is complete, remove the little white cap from the QIAfilter Syringe Cartridge outlet nozzle. Position the syringe over a prepared (equilibrated) Qiagen-tip silica column. Gently insert the plunger into the cartridge and filter the cell lysate directly into the equilibrated, drained, and labeled QIAGEN-tip column. Filter until all the lysate has
passed through the cartridge, but do not apply extreme force (i.e., stop if the pressure gets too high the goal is to keep the white precipitate out of the column).

Allow all of the cleared lysate (containing plasmid) to enter the resin by gravity flow. (i.e., wait until the column has completely drained before proceeding to the wash step, below).

6. Wash out impurities from the column: Wash each QIAGEN-tip twice, each time with 10 mL of Wash buffer QC. Allow the buffer to move through the tip by gravity flow, and wait for the column to drain completely before adding the second wash. All column flow-through solutions to this point can be discarded. (When your waste tube gets too full, simply empty it into the large plastic beaker at your station, and return the tube under the column.)

7. Elute plasmid DNA (remove DNA from column): After the second wash is complete, place a clean, labeled 50 ml tube under each column elute each DNA sample by adding 5 mL Elution buffer (QF) to each column. After elution, transfer (by pipetting) each DNA solution into a clean, labeled high-speed polypropylene centrifuge tube.

8. Desalt and precipitate plasmid DNA: Precipitate DNA by adding 3.5 mL of room- temperature isopropanol to each eluted DNA sample. Cap the tubes (tightly!) and
mix gently by inverting several times. To ensure that the tubes are perfectly balanced prior to centrifugation, “eyeball” the level of liquid in your tubes, side-by-side, and if necessary, add

more isopropanol as needed to bring each tube to the same level (re-mix the tubes if you add more isopropanol). Centrifuge at 15,000 x g for 30 min at 4°C, making sure that your 2 balanced tubes are directly opposite each other in the rotor.

Immediately after the spin, locate your DNA pellet at the bottom edge of the tube. Carefully decant the supernatant without disturbing the pellet, using the provided beaker in the centrifuge room. (Instructor will assist with this step.) NOTE: Isopropanol pellets are typically “small” white pellets and may be difficult to see, in contrast to the fluffy, seemingly denser pellets that result from ethanol precipitation. Isopropanol pellets are also more loosely attached to the side of the tube, and extreme care should be taken when removing the supernatant.

9. “Wash” the pellet of excess salt: With a p1000, add 1000 ul of 70% room- temperature ethanol to each DNA pellet. Disperse the pellets by gentle pipetting and transfer each suspension to a separate, clean, labeled 1.5 ml eppendorf tube.
(These eppendorf tubes are your ‘final’ tubes please label them legibly with your team name and gene.)

10. Spin 5 min at maximum speed in the microfuge. Note that you are not “dissolving” the DNA pellet at this stage you should still see “chunks” of precipitate. The 70% ethanol “washes” the DNA pellet by removing (dissolving) the precipitated salt that isopropanol left behind, and it replaces isopropanol with the more volatile ethanol, ultimately making the DNA easier to redissolve.

11. Carefully remove and discard the 70% ethanol with a p1000 remove as much ethanol as possible without disturbing the pellet. If necessary, follow the p1000 with a smaller micropipette (i.e., a p200 or p20) to carefully remove most of the remaining ETOH.
Air-dry the pellet by placing the tube on its side, on a clean paper towel, for 10-15 minutes (no longer).

12. Gently redissolve each DNA pellet in 100 ul (or less) of your TE buffer, pH 8. Redissolve by thoroughly rinsing the walls of the tube to recover all the DNA.

Composition of buffers in the Qiagen kit:

Buffer P1 (resuspension buffer)
50 mM Tris-Cl, pH 8.0
10 mM EDTA
100 mg/ml RNase A (plus LyseBlue reagent)

Buffer P2 (alkaline lysis buffer)
200 mM NaOH, 1% SDS (anionic detergent)

Buffer P3 (neutralization buffer)
3.0 M potassium acetate, pH 5.5

Buffer QBT (equilibration buffer)
750 mM NaCl
50 mM MOPS, pH 7.0
15% isopropanol
0.15% Triton X-100 (non-ionic detergent)

Buffer QC (wash buffer)
1.0 M NaCl
50 mM MOPS, pH 7.0
15% isopropanol

Buffer QF (elution buffer)
1.25 M NaCl
50 mM Tris-Cl, pH 8.5
15% isopropanol


Working with bacterial cells

1: Conjugation

Conjugation is the transfer of a plasmid from one bacterial cell to another. You'll mix two strains, or genetic types, of E. coli bacterias. The S strain (actually called S-17-1) contains the plasmid pARO (actually called pARO180), which can be transferred through conjugation. The H strain (HB101) doesn't have a plasmid to begin with, but receives pARO through conjugation. The plasmid contains a gene called bla (β-lactamase), which gives the cells resistance to the antibiotic ampicillin (amp). See Conjugation.

2: Transformation

Transformation is when cells take up DNA from the environment, rather than from another cell. You'll transform H cells with the plasmid pGLO. Unlike pARO, pGLO lacks the essential genes for conjugation. However, pGLO has a gene for green fluorescent protein (GFP), which you'll be able to experiment with, and it also has the ampicillin resistance gene bla. See pGLO.

3: Plating

Plating means growing your bacterial cultures on plates, or petri dishes containing agar with specific growth media. The most important outcome will be that you can use plates with ampicillin as a selective medium: only cells containing a plasmid (either pARO or pGLO) will grow with the antibiotic, since the plasmids provide antibiotic resistance. In addition, you'll use various other plates as experimental treatments or as controls to investigate specific aspects of your experiment. These plates are described on the conjugation and pGLO pages. See Conjugation and pGLO.

All the steps described so far (conjugation, transformation, and plating) use classical microbiology techniques. You genetically manipulate your cells, then infer the outcome based on the characteristics of the bacterial colonies you observe. To bring these experiments into the realm of molecular biology, the next steps would be to directly examine the DNA and proteins from the cells, using the steps described below.


Lysate Clarification

It’s essential to remove cellular debris from the cellular lysates before moving onto the next nucleic acid purification steps. Lysate clarification is the reduction or elimination of unwanted materials that can become carryovers in DNA purification. These materials vary depending on the sample but usually include lipids, proteins, and saccharides from cellular structures.

The purpose of clearing lysate is to prevent the cell membranes from clogging or disrupting the downstream application. There are three methods for clearing lysate, such as centrifugation, bead-based techniques, and filtration.


What is a plasmid in biology?

See full answer. Regarding this, what is a plasmid and what is its function?

Funciones de Plásmidos Plásmidos have many different funciones. Pueden contener genes que mejoran la supervivencia de un organismo, ya sea matando a otros organismos o defendiendo la célula huésped produciendo toxinas. Algunos plásmidos Facilitar el proceso de replicación en bacterias.

Also, what is plasmid made of? Plásmidos are circular, double-stranded DNA molecules typically containing a few thousand base pairs that replicate within the cell independently of the chromosomal DNA. Plásmido DNA is easily purified from cells, manipulated using common lab techniques and incorporated into cells.

Hereof, what is plasmid DNA used for?

ADN plasmídico es usado para a number of downstream applications such as transfection, sequencing, screening clones, restriction digestion, cloning, and PCR. A number of methods have been developed for the purification of plasmid DNA from bacteria.

What best describes a plasmid?

A small single circular extra-chromosomal DNA molecule which can self-replicate. Explicación: Plásmidos are the extrachromosomal small circular DNA molecule that can self replicate in the cell. Plásmidos are mainly found in bacteria but are also found in archaea and some eukaryotic cells.


Discusión

In the present paper we describe the use of a novel large pore affinity support for the purification of plasmid DNA by triplex affinity interaction. Due to its high mechanical stability and protection of the ligand inside macropores this support can be used in a continuous affinity recycle extraction process (CARE, in progress) ( 24). Unlike affinity chromatographic methods ( 21), CARE can easily deal with particulate contaminants and, unlike processes using magnetic beads ( 20), it can be scaled up to large scale.

Agarose gel electrophoresis of plasmid pTS2. sc, supercoiled oc, open circular. Lane 1, λ HindIII size marker lane 2, clarified lysate. Cell DNA shows as a smear over the whole path of migration at large DNA sizes, while RNA shows as a large dot running faster than plasmid DNA. Lane 3, plasmid DNA after triplex affinity purification. No cell DNA or RNA is seen.

Agarose gel electrophoresis of plasmid pTS2. sc, supercoiled oc, open circular. Lane 1, λ HindIII size marker lane 2, clarified lysate. Cell DNA shows as a smear over the whole path of migration at large DNA sizes, while RNA shows as a large dot running faster than plasmid DNA. Lane 3, plasmid DNA after triplex affinity purification. No cell DNA or RNA is seen.

Triplex binding experiments showed that efficient binding of plasmid DNA can be achieved at moderately acidic pH with yields of up to 62%. Maximum bead capacity was found to be 28 µg/ml, which is comparable with values published for a small pore triplex affinity support (23–49 µg/ml) ( 21). While a similar capacity is reported for gel filtration ( 7), other chromatographic techniques using anion exchange ( 8, 9) or hydroxyapatite ( 25) columns generally show at least 10-fold higher values. Future development should therefore be aimed at increasing bead capacity by increasing both accessibility of ligands (larger pore size) and ligand density on the support. Special attention should be directed at bead chemistry, as high crosslinking provides the stability necessary for such a support but at the same time is responsible for its low functionalization (T.Schluep and C.L.Cooney, submitted to J. Chromatogr. A).

Triplex affinity purification of plasmid DNA from clarified lysate showed efficient removal of RNA, cell DNA and bacterial protein. In HPLC we observed a certain enrichment of denatured supercoiled plasmid, which elutes shortly after the main plasmid peak. This plasmid form is generated by harsh conditions during alkaline lysis, possesses large single-stranded areas and runs at the same speed as supercoiled plasmid in agarose gels ( 10). It is conceivable that conformational changes induced by denaturation could be responsible for improved triplex formation. In agarose gels we observed that the purified plasmid contained a higher fraction of supercoiled plasmid than the starting material ( Fig. 3). While similar observations have been reported previously ( 21), other authors report the contrary ( 20), pointing to the possibility that preferential binding might be a function of the target sequence or target position in the plasmid.

In conclusion, triplex affinity purification shows a high potential for downstream processing of plasmid DNA. It is especially suited to production of pharmaceutical grade plasmid preparations as no toxic chemicals or animal-derived enzymes are necessary. Future work will focus on integration of the triplex affinity principle into a continuous affinity purification process which can be easily scaled up. Combination of such a process with classical purification steps will hopefully result in a large scale production process for pharmaceutical grade plasmid DNA.


Ver el vídeo: Purificación de ADN plasmídico paso a paso (Mayo 2022).