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¿Se encuentra NADH en todo tipo de células del cuerpo humano?

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¿Se encuentra NADH en todo tipo de células del cuerpo humano? Tengo curiosidad sobre la microglía específicamente.


Como NAD+/ NADH está involucrado tanto en la glucólisis como en el ciclo del ácido tricarboxílico, es difícil imaginar una célula capaz de generar energía sin algo de NADH. (¿Hay células que no sean capaces de hacer esto? ¿Células calcificadas como el hueso?)

Una búsqueda rápida en Internet de 'microglia' y 'metabolismo' indica que las microglias tienen metabolismo energético y, por lo tanto, esperaría que tuvieran NADH. ¿Cuánto (en comparación con NAD+) dependería de su estado metabólico.


Tipos básicos de células

Aunque hay varios cientos de tipos de células en el cuerpo, todos ellos pueden agruparse en solo cuatro categorías principales o tejidos. Esto los hace más fáciles de entender.

Estos cuatro tejidos principales se forman a partir de:

    . Estas células están estrechamente unidas entre sí. Cubren el interior de órganos huecos, como los vasos sanguíneos o los órganos digestivos, o forman la superficie de las cosas, como la piel. Hay decenas de tipos de células epiteliales. ¡Sin células epiteliales, no tendría piel para proteger su cuerpo de lesiones y no tendría estómago para digerir su comida! . Estas células están especializadas para la comunicación. Envían señales desde el cerebro a los músculos y glándulas que controlan sus funciones. También reciben información sensorial de la piel, los ojos y los oídos, y la envían al cerebro. Hay docenas de variedades de células nerviosas en el cuerpo, cada una con sus propias formas y funciones. No tendrías conciencia ni control sobre tu cuerpo sin células nerviosas. . Estas células están especializadas para la contracción. ¡Sin células musculares, no podrías moverte! Hay tres tipos de células musculares. Tiran y tiran de huesos y tendones para producir movimiento. También forman las paredes exteriores gruesas de los órganos huecos, como los vasos sanguíneos y los órganos digestivos, y pueden contraerse para regular el diámetro de estos órganos huecos. . Estas células proporcionan fuerza estructural al cuerpo y también defienden contra invasores extraños como bacterias. Dos tipos de células, fibroblastos y células grasas, son nativas del tejido conectivo. Otras células migran al tejido conectivo desde el torrente sanguíneo para combatir enfermedades. Los tipos especiales de tejido conectivo (cartílago y hueso) están diseñados para ser más fuertes y más rígidos que la mayoría de los tejidos conectivos.

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Escrito por John Young

John K. Young es un profesor jubilado de Biología Celular. Trabajó en el Departamento de Anatomía de la Facultad de Medicina de la Universidad Howard en Washington, DC durante 35 años, enseñando a sus estudiantes sobre las células. Durante su carrera, el Dr. Young publicó artículos científicos sobre una parte del cerebro llamada hipotálamo y también escribió varios libros sobre células y sobre el cerebro.


¿Se encuentra NADH en todo tipo de células del cuerpo humano? - biología

Células madre adultas (ASC):

Las ASC son células indiferenciadas que se encuentran viviendo dentro de tejidos diferenciados específicos en nuestros cuerpos que pueden renovarse o generar nuevas células que pueden reponer el tejido muerto o dañado. & # 160 También puede ver el término & # 8220 célula madre somática & # 8221 usado para referirse a adultos células madre. & # 160 El término & # 8220somático & # 8221 se refiere a las células no reproductivas en el cuerpo (óvulos o espermatozoides). & # 160 Las ASC suelen ser escasas en los tejidos nativos, lo que las ha hecho difíciles de estudiar y extraer con fines de investigación. .

Las poblaciones discretas de ASC, que residen en la mayoría de los tejidos del cuerpo humano, generan células para reemplazar las que se pierden por una reparación normal, una enfermedad o una lesión. Las ASC se encuentran durante toda la vida en tejidos como el cordón umbilical, la placenta, la médula ósea, los músculos, el cerebro, el tejido graso, la piel, el intestino, etc. & # 160 & # 160 Las primeras ASC se extrajeron y utilizaron para la producción de sangre en 1948. & # 160 Este procedimiento se amplió en 1968 cuando se utilizaron las primeras células adultas de la médula ósea en terapias clínicas para enfermedades de la sangre. & # 160

Los estudios que demuestran la especificidad del desarrollo de las ASC son controvertidos, algunos muestran que las ASC solo pueden generar los tipos de células de su tejido residente, mientras que otros han demostrado que las ASC pueden generar otros tipos de tejidos además de aquellos en los que residen. & # 160 Se necesitan más estudios. para confirmar la disputa.

Tipos de células madre adultas:

    • Células madre hematopoyéticas (células madre sanguíneas)
    • Células madre mesenquimales
    • Células madre neurales
    • Células madre epiteliales
    • Células madre de la piel

    Células madre embrionarias (ESC):

    Durante los días 3-5 después de la fertilización y antes de la implantación, el embrión (en esta etapa, llamado blastocisto), contiene una masa celular interna que es capaz de generar todos los tejidos especializados que componen el cuerpo humano. derivado de la masa celular interna de un embrión que ha sido fertilizado in vitro y donados con fines de investigación siguiendo el consentimiento informado. & # 160 Los ESC no se derivan de óvulos fecundados en el cuerpo de una mujer & # 8217. & # 160

    Estas células madre pluripotentes tienen el potencial de convertirse en casi cualquier tipo de célula y solo se encuentran durante las primeras etapas del desarrollo. & # 160 Los científicos esperan comprender cómo se diferencian estas células durante el desarrollo & # 160. puede ser capaz de aplicarlos a células madre cultivadas in vitro y potencialmente volver a crecer células como nervios, piel, intestino, hígado, etc. para trasplantes. & # 160

    Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)

    Las células madre pluripotentes inducidas son células madre que se crean en el laboratorio, un medio feliz entre las células madre adultas y las células madre embrionarias. & # 160 Las iPSC se crean mediante la introducción de genes embrionarios en una célula somática (una célula de la piel, por ejemplo) que hacer que vuelva a un estado & # 8220 como célula madre & # 8221. & # 160 Estas células, como las ESC se consideran pluripotentes Descubierto en 2007, este método de reprogramación genética para crear células embrionarias, es nuevo y necesita muchos más años de investigación antes de su uso en terapias clínicas. & # 160 & # 160


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    Enzimas

    Reinhard Renneberg,. Vanya Loroch, en Biotecnología para principiantes (segunda edición), 2017

    2.3 El papel de los cofactores en las enzimas complejas

    No todas las enzimas consisten exclusivamente en proteínas, como ocurre con la lisozima. Muchos incluyen componentes químicos adicionales o cofactores que sirven como herramientas. Estas enzimas se conocen como enzimas calificadas y tienen mecanismos de reacción más complicados.

    Los cofactores pueden constar de uno o más iones inorgánicos (como Fe 3+, Mg 2+, Mn 2+ o Zn 2+) o moléculas orgánicas más complejas, conocidas como coenzimas. Algunas enzimas requieren ambos tipos de cofactores.

    Las coenzimas son compuestos orgánicos que se unen al sitio activo de las enzimas o cerca de él. Modifican la estructura del sustrato o mueven electrones, protones y grupos químicos de un lado a otro entre la enzima y el sustrato, negociando distancias considerables dentro de la molécula de enzima gigante. Cuando se agotan, se separan de la molécula.

    Muchas coenzimas se derivan de precursores de vitaminas, lo que explica por qué necesitamos un suministro constante y bajo de ciertas vitaminas. Una de las coenzimas más esenciales, NAD + (nicotinamida adenina dinucleótida), se deriva de la niacina. La mayoría de las vitaminas solubles en agua del grupo de vitamina B actúan como precursores de coenzimas de manera muy similar a la niacina.

    Otto Heinrich Warburg (1883-1970, fig. 2.3) descubrió la enzima respiratoria citocromo oxidasa (fig. 1.14) y NAD. Su descubrimiento y posterior análisis estructural fue una de las horas brillantes de la bioquímica moderna. En ausencia de niacina en la dieta, ciertas enzimas (p. Ej., Deshidrogenasas) no pueden funcionar eficazmente en el cuerpo. El ser humano afectado desarrollará pelagra, una enfermedad causada por la deficiencia de vitamina B (niacina). Otto Warburg desarrolló una prueba óptica lo que permite cuantificar el NADH reducido a una longitud de onda de 340 nm (el NAD + oxidado no absorbe la luz en esta longitud de onda). Ahora era posible medir reacciones enzimáticas esenciales, como la detección de glucosa mediante glucosa deshidrogenasa (ver Capítulo: Biotecnología analítica y genoma humano).

    Figura 2.3. Otto Heinrich Warburg (1883-1970) descubrió el cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y enzimas respiratorias que contienen hierro, como la citocromo oxidasa (v. Fig. 1.14). Fue galardonado con el Premio Nobel en 1941.

    Hoy en día, vitaminas igual que B2 (riboflavina), B12 (cianocobalamina), y C (ácido ascórbico) se producen por tonelada utilizando métodos biotecnológicos (véase el capítulo: Biotecnología blanca: las células como fábricas sintéticas).

    Cofactores que se unen covalentemente a la enzima se denominan grupos protésicos. El dinucleótido de flavina y adenina actúa como un grupo protésico para GOD. La peroxidasa y el citocromo P-450 contienen un grupo hemo, como se encuentra en la mioglobina y la hemoglobina. El grupo hemo en sí consiste en un anillo de porfirina que incorpora un ión de hierro en su centro.

    Coenzimas, por el contrario, solo tienen uniones sueltas y, al igual que los sustratos, sufren cambios en el proceso de unión y se agotan. Sin embargo, a diferencia de los sustratos, se unen a una gran cantidad de enzimas (p. Ej., NADH y NADPH de casi todas las deshidrogenasas) y se regeneran y reciclan dentro de las células (consulte la Sección 2.13). Las enzimas que se unen a la misma coenzima generalmente se parecen entre sí en sus mecanismos químicos.

    Si bien nos referimos a la cofactores como "herramientas", la sección de proteínas de la enzima es el "artesano" que utiliza estas herramientas, que es responsable de su eficacia. Como siempre, los artesanos y las herramientas se apoyan mutuamente para lograr el mejor resultado posible.


    Cómo funciona la moneda de energía libre

    Las reacciones acopladas se utilizan con frecuencia en el cuerpo para impulsar importantes procesos bioquímicos. Se pueden agregar reacciones químicas separadas para formar una reacción neta. El cambio de energía libre (D G) para la reacción neta viene dado por la suma de los cambios de energía libre para las reacciones individuales. Por ejemplo, la fosforilación de glicerol es un paso necesario en la formación de los fosfolípidos que comprenden las membranas celulares. (Recuerde del experimento, "Membranas y proteínas: diálisis, detergentes y gradientes de protones", que los fosfolípidos que forman las membranas celulares se forman a partir de glicerol con un grupo fosfato y dos cadenas de ácidos grasos unidas). Este paso en realidad consta de dos reacciones. : (1) la fosforilación del glicerol y (2) la desfosforilación del ATP (la molécula de energía libre-moneda). Las reacciones se pueden agregar como se muestra en las ecuaciones 2-4, a continuación:

    El ATP es la molécula de "moneda de energía libre" más importante en los organismos vivos (consulte la Figura 2, a continuación). El trifosfato de adenosina (ATP) es una moneda de energía libre útil porque la reacción de desfosforilación es muy espontánea. es decir., libera una gran cantidad de energía libre (30,5 kJ / mol). Por lo tanto, la reacción de desfosforilación de ATP a ADP y fosfato inorgánico (Ecuación 3) a menudo se combina con reacciones no espontáneas (p.ej., Ecuación 2) para impulsarlos. El uso de ATP por parte del cuerpo como moneda de energía libre es una estrategia muy eficaz para provocar reacciones vitales no espontáneas.

    Figura 2

    Esta es la estructura bidimensional (ChemDraw) del ATP, trifosfato de adenosina. La eliminación de un grupo fosfato (verde) del ATP requiere la ruptura de un enlace (azul) y da como resultado una gran liberación de energía libre. La eliminación de este grupo fosfato (verde) da como resultado ADP, difosfato de adenosina.

    Como estas reacciones acopladas (p.ej., Se producen las ecuaciones 2-4), utilizamos ATP. En una célula típica, se usa una molécula de ATP al minuto de su formación. Durante el ejercicio intenso, la tasa de utilización de ATP es aún mayor. Por tanto, el suministro de ATP debe regenerarse. Consumimos alimentos para proporcionar energía al cuerpo, pero la mayor parte de la energía de los alimentos no está en forma de ATP. El cuerpo utiliza la energía de otros nutrientes en la dieta para producir ATP a través de reacciones de oxidación-reducción (Figura 3).

    Figura 3

    Este diagrama de flujo muestra que la energía utilizada por el cuerpo para sus muchas actividades proviene en última instancia de la energía química de nuestros alimentos. La energía química de nuestros alimentos se convierte en agentes reductores (NADH y FADH2). Estos agentes reductores se utilizan luego para producir ATP. El ATP almacena energía química, de modo que está disponible para el cuerpo en una forma fácilmente accesible.

    ¿Cómo se utilizan los alimentos para producir los agentes reductores necesarios para la producción de ATP?

    Para producir ATP, se debe absorber energía. Esta energía es suministrada por los alimentos que comemos y luego se utiliza para sintetizar dos agentes reductores, NADH y FADH.2 que son necesarios para producir ATP. Uno de los principales nutrientes energéticos de nuestra dieta es glucosa (vea la estructura en la Tabla 1 en el cuadro azul a continuación), un azúcar simple de seis carbonos que el cuerpo puede descomponer. Cuando se rompen los enlaces químicos de la glucosa, se libera energía libre. La descomposición completa de la glucosa en CO2 ocurre en dos procesos: la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico. Las reacciones de estos dos procesos se muestran en el cuadro azul a continuación.

    Reacciones para la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico

    El primer proceso en la descomposición de la glucosa es glucólisis (Ecuación 5), en la que la glucosa se descompone en dos moléculas de tres carbonos conocidas como piruvato. Luego, el piruvato se convierte en acetil CoA (acetil coenzima A) y dióxido de carbono en un paso intermedio (Ecuación 6). En el segundo proceso, conocido como ciclo del ácido cítrico (Ecuación 7), las moléculas de tres carbonos se descomponen aún más en dióxido de carbono. La energía liberada por la descomposición de la glucosa (rojo) se puede utilizar para fosforilar (añadir un grupo fosfato a) ADP, formando ATP (verde). Las reacciones netas para la glucólisis (Ecuación 5) y el ciclo del ácido cítrico (Ecuación 7) se muestran a continuación. (Nota: En las ecuaciones siguientes, la glucosa y los compuestos de carbono en los que se descompone la glucosa se muestran en rojo, las moléculas de moneda de energía se muestran en verde, y los agentes reductores utilizados en la síntesis de ATP se muestran en azul).

    Glucólisis

    Por lo tanto, la reacción general para la oxidación de NADH junto con la reducción de O2 tiene un cambio negativo en la energía libre (D G = -220 kJ) es decir, es espontáneo. Por tanto, cuanto mayor sea el potencial eléctrico de una semirreacción de reducción, mayor será la tendencia de la especie a aceptar un electrón.

    Al igual que en el cuadro anterior, el potencial eléctrico de la reacción general (transferencia de electrones) entre dos portadores de electrones es la suma de los potenciales de las dos medias reacciones. Siempre que el potencial de la reacción general sea positivo, la reacción es espontánea. Por lo tanto, de la Tabla 2 a continuación, vemos que el citocromo c1 (parte del complejo de citocromo reductasa, n. ° 3 en la figura 9) puede transferir espontáneamente un electrón al citocromo c (n. ° 4 en la figura 9). La reacción neta viene dada por la Ecuación 16, a continuación.

    citocromo c reducido1 - & gt citocromo c oxidado1 + e - mi oxidación = - .220 V (14)
    citocromo c oxidado c + e - - & gt citocromo c reducido mi reducción = .250 V (15)
    NET: cyt c reducido1 + cyt oxidado c - & gt
    cyt oxidado c1 + cyt c reducido
    mi rxn = 0,030 V (16) Espontáneo

    También podemos ver en la Tabla 2 que el citocromo c1 no poder transferir espontáneamente un electrón al citocromo b (Ecuación 19):

    cyt reducido c1 - & gt cyt c oxidado1 + e - mi oxidación = - .220 V (17)
    cyt oxidado b + e - - & gt cyt b reducido mi reducción = - 0,34 V (18)
    NET: cyt c reducido1 + cyt oxidado c - & gt
    cyt oxidado c1 + cyt c reducido
    mi rxn = - 0,56 V (19) NO espontáneo

    La Tabla 2 enumera los potenciales de reducción para cada una de las proteínas del citocromo (es decir., los últimos tres pasos en la cadena de transporte de electrones antes de que los electrones sean aceptados por O2) involucrados en la cadena de transporte de electrones. Tenga en cuenta que cada transferencia de electrones es a un citocromo con un mayor potencial de reducción que el citocromo anterior. Como se describe en el cuadro anterior y se ve en las ecuaciones 14-19, un aumento en el potencial conduce a una disminución en D G (ecuación 13) y, por lo tanto, la transferencia de electrones a través de la cadena es espontánea.

    Nombre complejo

    Media reacción

    Potencial de reducción

    (también conocido como citocromo b-c1 complejo)

    (3 en la Figura 9)

    (4 en la Figura 9)

    (5 en la Figura 9)

    Tabla 2

    Para ver las moléculas de citocromo de forma interactiva utilizando RASMOL, haga clic en el nombre del complejo para descargar el archivo pdb.

    Por lo tanto, la cadena de transporte de electrones (que funciona debido a la diferencia en los potenciales de reducción) conduce a un gran gradiente de concentración de H + . Como veremos a continuación, este enorme gradiente de concentración conduce a la producción de ATP.

    Preguntas sobre los portadores de electrones: pasos en los potenciales de reducción de la cadena de transporte de electrones y su relación con la energía libre

    • Brevemente, explique por qué los electrones viajan desde la NADH-Q reductasa, a la ubiquinona (Q), a la citocromo reductasa, en lugar de en la dirección opuesta.
    • Un resultado de la transferencia de electrones desde la NADH-Q reductasa a lo largo de la cadena de transporte de electrones es que aumenta la concentración de protones (iones H +) en el espacio intermembrana. ¿Podrían las células mover protones (iones H +) de la matriz al espacio intermembrana sin transportar electrones? ¿Por qué o por qué no?

    ATP sintetasa: producción de ATP

    Hemos visto que la cadena de transporte de electrones genera un gran gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna. Pero recuerda eso el objetivo final de la fosforilación oxidativa es generar ATP para suministrar energía libre fácilmente disponible para el cuerpo. ¿Cómo ocurre esto? Además de las proteínas transportadoras de electrones incrustadas en la membrana mitocondrial interna, una proteína especial llamada ATP sintetasa (Figura 9, la proteína de color rojo) también está incrustada en esta membrana. La ATP sintetasa utiliza el gradiente de protones creado por la cadena de transporte de electrones para impulsar la reacción de fosforilación que genera ATP (Figura 7c).

    La ATP sintetasa es una proteína que consta de dos segmentos importantes: un canal de protones transmembrana y un componente catalítico ubicado dentro de la matriz. El segmento del canal de protones permite que los iones H + se difundan desde el espacio intermembrana, donde la concentración es alta, hacia la matriz, donde la concentración es baja. Recuerde del tutorial de Diálisis renal que las partículas se difunden espontáneamente desde áreas de alta concentración a áreas de baja concentración. Así, dado que la difusión de protones a través del componente del canal de la ATP sintetasa es espontánea, este proceso se acompaña de un cambio negativo en la energía libre (es decir., se libera energía libre). El componente catalítico de la ATP sintetasa tiene un sitio por donde puede entrar ADP. Luego, utilizando la energía libre liberada por la difusión espontánea de protones a través del segmento del canal, se forma un enlace entre el ADP y un grupo fosfato libre, creando una molécula de ATP. Luego, el ATP se libera del sitio de reacción y una nueva molécula de ADP puede ingresar para ser fosforilada.

    Preguntas sobre ATP sintetasa: producción de ATP


    Discusión

    Hay una serie de factores que apoyan nuestra hipótesis subyacente de que la fluorescencia medida en este estudio se origina en la coenzima NADH. En las células epiteliales mamarias (MCF10A pZIP), existen tres fluoróforos principales: NADH, flavina adenina dinucleótido (FAD) y triptófano, cuyas características espectrales se han caracterizado previamente (28). A la longitud de onda de excitación de fotón único equivalente utilizada en este estudio (370 nm), el espectro de fluorescencia medido en las células pZIP MCF10A tiene el mismo espectro que el NADH (28). En segundo lugar, es bien sabido que la adición de KCN a las células inhibirá el transporte de electrones y, por tanto, la proporción de NADH y NAD + (29). Esto provocará un aumento en la intensidad de fluorescencia de NADH. En el estudio de KCN informado en este artículo, la intensidad de la fluorescencia aumentó en un factor de ∼1,3 después de la adición de KCN, lo cual es consistente con lo esperado (25-27). Finalmente, las vidas medias de fluorescencia registradas para las dos especies emisoras de fluorescencia en las células pZIP MCF10A en este estudio son consistentes con las reportadas para NADH libre y unido en la literatura (17, 24, 25). Es poco probable que el triptófano contribuya a la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de dos fotones de 740 nm, porque tiene un pico de absorción de un solo fotón de ~ 280 nm (30). Se puede lograr una excitación eficiente de dos fotones del triptófano a una longitud de onda de ~ 560 nm (30), que está lejos de la excitación de 740 nm utilizada en nuestros experimentos. Esto, combinado con el hecho de que, en comparación con NADH y FAD, el triptófano tiene una sección transversal de absorción de dos fotones particularmente baja (31), lo consideraría una fuente improbable de la fluorescencia medida en este estudio. También debe señalarse que la vida útil de la fluorescencia medida en los Resultados (Efecto de la confluencia celular sobre la vida útil y la proporción de NADH libre y unido a proteína) es más corta en todos los casos en un factor de ∼2 en comparación con la informada para FAD (24 ).

    Un aumento en la confluencia celular aumenta el hacinamiento celular y, por lo tanto, probablemente disminuye el consumo de oxígeno. Una disminución en el consumo de oxígeno debería aumentar a su vez la relación NADH / NAD +. Se puede inferir de los resultados del estudio de control que una disminución en la vida útil de la fluorescencia de los componentes libres y unidos a proteínas de NADH y una disminución en la contribución de NADH unido a proteínas con el aumento de la confluencia está relacionada con un aumento en la Relación NADH / NAD +.

    El tratamiento con KCN inhibe el transporte de electrones (29). Esto también debería resultar en un aumento en la relación NADH / NAD +. Por lo tanto, se puede inferir que la disminución en la vida útil de la fluorescencia de los componentes libres y unidos a proteínas de NADH de las células tratadas con KCN en confluencias de 25,000 y 100,000 y una disminución en la contribución de NADH unido a proteínas de las células tratadas con KCN en las tres confluencias se relaciona con un aumento de la relación NADH / NAD +. Esto corrobora los hallazgos experimentales del estudio de control. Sin embargo, la falta de diferencias estadísticamente significativas entre la vida útil de la fluorescencia del NADH libre y unido a proteína en las células tratadas con KCN y las células de control en una confluencia de 1.000.000 no está clara en este momento. Se especula que el tratamiento con KCN no afecta más a la relación NADH / NAD + de las células completamente confluentes.

    El suero está lleno de precursores tanto de la glucólisis (como la glucosa) como del ciclo del ácido cítrico (como el piruvato), que en condiciones normales son esenciales para el metabolismo celular (29). Por lo tanto, se espera que la eliminación del suero ralentice el metabolismo celular y cambie la relación de reducción-oxidación hacia un aumento de NADH. Por tanto, no es sorprendente que las células privadas de suero y las tratadas con KCN produzcan cambios similares en la duración de la fluorescencia y contribuciones relativas de NADH libre y unido a proteínas en relación con las de las células de control.

    Estudios previos de NADH en cultivo celular encontraron que la vida útil efectiva de NADH (vida media de NADH libre y unido a proteínas) disminuye con el estrés oxidativo inducido con el inhibidor de la cadena respiratoria rotenona (17). El KCN, como la rotenona, es un inhibidor de la cadena respiratoria y tiene un efecto similar sobre la vida útil del NADH libre y unido a proteínas en nuestro estudio. En otro estudio, la microscopía multifotónica de la vida útil y la anisotropía en cortes de tejido cerebral revelaron un acortamiento de la vida útil con hipoxia y esto se atribuyó a una redistribución de NADH unido a proteínas a sitios de unión a enzimas con vidas más cortas y debido a una disminución en la vida útil de NADH libre ( 32). El tratamiento con KCN, como la hipoxia, provocó una disminución en la vida útil del NADH libre y unido a proteínas en nuestro estudio. Tanto el KCN como la hipoxia provocan un aumento en la relación NADH / NAD + (KCN inhibe la transferencia de electrones del NADH al oxígeno y la hipoxia reduce el suministro de oxígeno que puede aceptar electrones del NADH). Por lo tanto, el acortamiento de la vida causado tanto por la hipoxia como por el KCN probablemente esté relacionado con una mayor proporción de NADH / NAD +.

    Además de la obtención de imágenes de por vida, se determinó la proliferación celular mediante tinción con yoduro de propidio y citometría de flujo en las células de control y en las células privadas de suero en las tres confluencias diferentes. Los resultados promediados de un total de dos experimentos independientes mostraron que hay una diferencia insignificante en el porcentaje de células en S-G2-Fase M para las células control o hambrientas de suero en diferentes confluencias. Sin embargo, un experimento de obtención de imágenes en paralelo realizado en células sembradas en placas el mismo día y en las mismas condiciones mostró una disminución en la vida útil de la fluorescencia del NADH libre y unido a proteínas y una disminución en la contribución de NADH unido a proteínas con una mayor densidad de placa y suero. inanición (consistente con las Figs. 4 y 5). Este estudio adicional indica que los cambios observados en las variables de vida útil de la fluorescencia no se deben a cambios en la proliferación celular.

    En el estudio actual, se realizaron análisis de por vida en varios píxeles por celda (que se identificaron arbitrariamente a partir de la región citoplasmática). Para probar la solidez de este enfoque, también se realizaron análisis de por vida en todos los píxeles de la región citoplasmática de la célula. Ambos métodos de análisis arrojaron resultados muy similares (esto solo se evaluó en imágenes recolectadas de celdas de control en diferentes confluencias) lo que indica que el método de análisis no afecta las conclusiones reportadas en este estudio.


    Diferencia entre pluripotente y totipotente

    Todo el cuerpo humano está compuesto por más de 200 tipos de células. Todos estos tipos de células surgen básicamente de un solo tipo de célula llamada "células madre". Células madre se definen como las células que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en uno o en todos los más de 200 tipos de células que componen todo el cuerpo. Hay cuatro células madre diferentes que se encuentran en el cuerpo que son unipotente, que da lugar a un solo tipo de célula, multipotente, que produce un número limitado de tipos de células, totipotente, que forma todos los tipos de células en cualquier etapa de desarrollo, y pluripotente, que da lugar a todos los tipos de células del cuerpo adulto. De estos cuatro tipos, pluripotente y totipotente tienen la capacidad de formar cualquier tipo de célula en diferentes etapas del desarrollo humano.

    Pluripotente

    Las células pluripotentes son las células madre que dan lugar a cualquier tipo de células que se desarrollan a partir de las tres capas germinales embrionarias, incluidas endodermo, ectodermo y mesodermo. Eso significa que las células pluripotentes pueden formar cualquier tipo de célula en el cuerpo adulto. Las células pluripotentes tienen las mismas capacidades que las células totipotentes con una excepción de que no forman trofoblasto. Debido a esta excepción, las células pluripotentes no pueden convertirse en seres humanos completos.

    La célula totipotente se define como la célula que tiene la capacidad de crear todo tipo de células en un organismo en cualquier etapa de desarrollo. A diferencia de las otras células madre, las células madre totipotentes son extremadamente raras. En los humanos, solo las primeras ocho células que se forman cigoto son solo totipotentes ya que tienen la capacidad de convertirse en cualquier tipo de célula durante el desarrollo embrionario. Por lo tanto, a diferencia de las otras células madre, las células totipotentes tienen la capacidad de formar un ser humano completo.

    ¿Cuál es la diferencia entre pluripotente y totipotente ??

    • Las células totipotentes tienen la capacidad de formar cualquier tipo de célula en cualquier etapa de desarrollo, mientras que las células pluripotentes tienen la capacidad de formar cualquier tipo de célula después de las primeras escisiones de embrión.

    • Todas las células, incluidas las células pluripotentes, se derivan de células totipotentes durante el desarrollo embrionario.

    • A diferencia del pluripotente, el totipotente es extremadamente raro.

    • A diferencia de las células pluripotentes, las células totipotentes tienen la capacidad de formar un ser humano completo.

    • El totipotente forma el trofoblasto, mientras que el pluripotente no.

    • Las células totipotentes tienen el potencial de convertirse en embriones, mientras que las células pluripotentes no.


    Materiales y métodos

    Medios y cepas. Mtb H37Rv fue un regalo de C. Imperatrice (Enfermedades Infecciosas Clínicas, Hospital de la Universidad de Pensilvania) y Mycobacterium smegmatis Mc 2 155 se obtuvo de V. Mizrahi (Servicio Nacional de Laboratorio de Salud, Johannesburgo). Las bacterias se cultivaron en caldo 7H9 suplementado con ácido oleico-albúmina-dextrosa catalasa al 10% / glicerol al 0,5% / Tween 80 al 0,05%. Se añadió agar sólido (15 g / litro) al medio líquido para crear medio sólido según fuera necesario.

    Espectroscopia. Mtb H irradiado con rayos gamma, cultivado aeróbicamente37Rv las células completas se obtuvieron de John Belisle (Universidad del Estado de Colorado, Fort Collins) bajo el contrato del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas NO1-A1-75320. Las células (12 g de peso húmedo) se lavaron con 10 ml de tampón de fosfato-digitonina (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, que contenía 0,1% de digitonina) y se resuspendieron en el mismo tampón. Las bacterias se lisaron pasándolas a través de una prensa francesa a 14.000 kPa y la suspensión se centrifugó a 12.000 x gramo durante 15 minutos para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se aclaró aún más mediante centrifugación a 50.000 × gramo durante 50 min. Este sobrenadante se utilizó como fracción que contiene la membrana (o extracto libre de células) para estudios espectrales. Para aislar las membranas celulares, el 50.000 × gramo el sobrenadante se centrifugó a 150.000 × gramo durante 60 min. El sedimento resultante se lavó con tampón de fosfato-digitonina, se resuspendió y luego se centrifugó a 150.000 × gramo durante 60 min por segunda vez. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante ensayo bicinconínico (BCA, Pierce) utilizando BSA como estándar. Los espectros de UV-visible se registraron a temperatura ambiente en un espectrofotómetro de haz doble Cary 4E (Varian) usando una velocidad de exploración de 120 nm / min y un ancho de rendija de 1 nm. La reducción de 21,3 mg / ml de proteína de membrana se logró mediante una incubación de 3 min con NADH 5 mM. Para ilustrar la perturbación espectral debida a la unión de CO de las oxidasas terminales, se burbujeó suavemente CO gas en la muestra durante 5 min antes de la reducción de NADH. Para las muestras que contenían trifluoperazina (TPZ), se añadió fármaco a la muestra y se incubó durante 5 min antes de la adición de NADH.

    Ensayo amperométrico. El consumo de oxígeno por respiración de las membranas citoplasmáticas de Mtb se midió mediante un método polarográfico. Se suspendieron membranas de Mtb (50 mg / ml) en tampón de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,4) y se añadió NADH 10 mM para iniciar la respiración. Posteriormente, se añadieron TPZ 1 mM o vehículo y luego ascorbato de sodio 10 mM más 3,3,5,5-tetrametilfenilendiamina (TMPD) 1 mM a la mezcla de reacción, como se muestra en la Fig.2.B .

    Los pigmentos reducidos y de unión a CO de los extractos de células H37Rv. (A) Espectro diferencial reducido en NADH menos oxidado por aire. La reducción se logró 5 minutos después de la adición de NADH 10 mM. (B) (NADH-reducido más CO) menos (NADH-reducido) espectro de diferencia. Para mostrar la perturbación espectral debida a la unión de CO, se burbujeó CO a través de la muestra antes de la reducción.

    Ensayo de actividad de NADH-quinona oxidorreductasa. Para el ensayo de actividad de NADH-quinona oxidorreductasa de la membrana de Mtb, la membrana se dializó contra tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,5) que contenía EDTA 1 mM a 4ºC durante la noche para eliminar los sustratos reductores endógenos. La membrana de Mtb (3 mg / ml) se suspendió en el tampón de fosfato que contenía KCN 10 mM y menaquinona 1 100 μM (MK1) o Q1. Se añadió el fármaco o vehículo según se deseaba y la mezcla de reacción se incubó durante 5 min a 30ºC. La reacción se inició añadiendo 100 µM de NADH y el cambio de absorbancia a 340 nm se controló utilizando un espectrofotómetro 1098 personalizado (Hitachi, Tokio). La oxidación de NADH no se produjo en ausencia de proteína de membrana o quinona. Para el Ndh o NdhA purificado, se midió la actividad de NADH-quinona oxidorreductasa en tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 150 mM y colato de potasio al 2% (peso / volumen). La mezcla de reacción contenía 50 μMQ2/1 μg of purified enzyme, and it was initiated by adding 100 μM NADH and monitored by following the absorbance change at 340–400 nm with a PerkinElmer 557 double-beam dual-wavelength spectrophotometer at 37°C. For chlorpromazine (CPZ)-inhibition assays, ≈1 μg of purified enzyme and 50 μM Q2 were incubated in the reaction mixture with various amounts of CPZ for 2–3 min at room temperature before the addition of NADH.

    Expression and Purification of Mtb ndh and ndhA in Escherichia coli. The Mtb ndh y ndhA genes were amplified by PCR using the Mtb genomic DNA and template, and the products were cloned in pET16b expression plasmid, which contains an N-terminal His-6-tag. Mtb Ndh and NdhA were reproducibly expressed in E. coli strain BL21(DE3), and the products were localized to the cytoplasmic membrane. los E. coli cell suspension in buffer A (50 mM Hepes, pH 7.0/100 mM KCl/1 mM PMSF) was passed through a French press twice at 14,000 kPa. Next, the suspension was centrifuged at 12,000 × gramo for 15 min to remove unbroken cells and debris. The resulting supernatant was ultracentrifuged at 130,000 × gramo durante 30 min. The membrane pellet was resuspended in buffer A and ultracentrifuged at 130,000 × gramo again for 15 min. The cytoplasmic membranes thus obtained were resuspended in buffer A, 2% (wt/vol) sodium cholate (pH 7.2) was added, and the mixture was solubilized by incubation at 4°C for 1 h. The mixture was next ultracentrifuged at 130,000 × gramo for 30 min, and solubilized proteins in the supernatant were collected. We added 1 ml of buffer A-equilibrated Talon (BD Biosciences) resin, and the mixture was incubated at 4°C for 1 h. The resin was transferred into a column was washed with 30 ml of buffer A with 1% cholate, followed by 50 ml of buffer A with 1% cholate and 10 mM imidazole. Last, the bound proteins were eluted with buffer A with 1% cholate and 100 mM imidazole. Purified recombinant Mtb Ndh and NdhA were used immediately for activity assays.

    Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) by the Bactec MGIT 960. The MIC for each compound was determined by the Bactec MGIT (mycobacteria growth indicator tube) 960 system. Mtb H37Rv was grown in Middlebrook 7H9 broth until the growth index (GI) reached 75 (GI is a scale in the Bactec system (Becton Dickinson), which reflects the amount of growth) and was then diluted 2,500-fold and used as the inocula. The vials were dispensed with different dilutions of drug to reach final concentrations ranging 0.2–26 μg/ml. All of the drug-containing vials were inoculated with 0.5 ml of the bacterial suspensions prepared as described above. Six drug-free controls were included with each test three were inoculated with 0.5 ml of the suspension, and the remaining three were inoculated with 0.5 ml of a 1:100 dilution of the suspension. The vials were incubated at 37°C and read in a Bactec 960 reader every day until the GI in the control diluted 1:100 reached 75, with an increase in the GI of at least 10 for 3 consecutive days. The time to positive was 10 days for the undiluted control. MIC was defined as the lowest concentration of the drug that caused an increase in the GI equal to or less than the increase in the GI of the control diluted 1:100.

    Animal Studies: Test of Phenothiazine Efficacy in a BALB/c Mouse Model of Acute Mtb Infection. Each treatment group consisted of five female mice intranasally infected with 10 2 colony-forming units (cfu) of H37Rv Mtb on day 0. INH, RIF, or compound 1 was given orally on days 1–11. After 11 days of the indicated treatment, mice were killed, and the lungs and spleens were aseptically collected. Serial 10-fold dilutions were prepared of tissue homogenates in 7H9 media and were plated on 7H11 agar at 37°C for cfu enumeration after 4 weeks of incubation.


    Célula madre adulta

    Adult stem cells are undifferentiated cells found throughout the body that divide to replenish dying cells and regenerate damaged tissues.

    Also known as somatic stem cells, they can be found in children, as well as adults.

    Research into adult stem cells has been fueled by their abilities to divide or self-renew indefinitely and generate all the cell types of the organ from which they originate &mdash potentially regenerating the entire organ from a few cells.

    Unlike embryonic stem cells, the use of adult stem cells in research and therapy is not controversial because the production of adult stem cells does not require the destruction of an embryo.

    Adult stem cells can be isolated from a tissue sample obtained from an adult.

    They have mainly been studied in humans and model organisms such as mice and rats.

    The rigorous definition of a stem cell requires that it possesses two properties: Self-renewal - the ability to go through numerous cycles of cell division while maintaining the undifferentiated state.

    Multipotency or multidifferentiative potential - the ability to generate progeny of several distinct cell types, for example both glial cells and neurons, opposed to unipotency - restriction to a single-cell type.

    Some researchers do not consider this property essential and believe that unipotent self-renewing stem cells can exist.

    Stem Cell Treatments Due to the ability of adult stem cells to be harvested from the patient, their therapeutic potential is the focus of much research.

    Adult stem cells, similar to embryonic stem cells, have the ability to differentiate into more than one cell type, but unlike embryonic stem cells they are often restricted to certain lineages.

    The ability of a stem cell of one lineage to become another lineage is called transdifferentiation.

    Different types of adult stem cells are capable of transdifferentiation more than others, and for many there is no evidence of its occurrence.

    Consequently, adult stem therapies require a stem cell source of the specific lineage needed and harvesting and or culturing them up to the numbers required is a challenge.

    Adult stem cell treatments have been used for many years to treat successfully leukemia and related bone/blood cancers through bone marrow transplants.


    Layers of the Skin

    The skin is composed of 3 layers namely:

    3 Layers of the Skin (Source: Wikimedia)

    1. Epidermis

    This is the outer most superficial layer which is made up of 5 inner layers. They are Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum, Stratum lucidum, and Stratum corneum.

    In general, skin’s epidermal layer is subjected to constant wear & tear from external factors such as sunlight, chemicals such as soaps, and pollution.

    2. Dermis

    Dermis cover the significant portion of the skin’s layer. The dermis layer has connective tissues, blood vessels, oil and sweat glands, nerves, hair follicles, and other structures.

    The dermis is made up of two inner layers namely – a thin upper layer called the papillary dermis, and a thick lower layer called the reticular dermis.

    3. Subcutaneous Layer

    Subcutaneous layer is also known as hipodermis. The hypodermis is the innermost layer of the skin. This layer hosts fat and connective tissues that house larger blood vessels and various nerves.

    The primary function of the hypodermis is to act as an insulator for regulating the body temperature.

    Why are tattoos permanent though skin cells die and get replaced?

    The answer lies hidden in the second layer of the skin (Dermis). The permanent tattoo ink is injected till the dermis layer so that it stays permanent. If it is put on the outer layer, then it will be worn out as time progresses. That is why permanent tattooing is always a harrowing and painful experience.


    Ver el vídeo: Biochemistry: ATP, FADH and NADH. Expert level for beginners. IN 7 MINUTES (Agosto 2022).