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Replicación del ADN: ¿cuántas veces y cuándo ocurre?

Replicación del ADN: ¿cuántas veces y cuándo ocurre?


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Actualmente estoy aprendiendo sobre la replicación del ADN en células procariotas y eucariotas. Y mi conferenciante ha mencionado que la replicación es una actividad única en la vida. Y no estoy seguro de lo que esto implica porque he investigado que la replicación del ADN ocurre durante la división celular (ciclos celulares), que ocurren repetidamente a medida que se desarrollan los organismos.


Esto suena como una diferencia en la perspectiva de cuándo exactamente "mueren" las células. Si considera que, en una división celular, una célula madre "da a luz" a dos células hijas, podría argumentar que la célula madre ha "muerto". Tiene sentido pensar en la división celular de esta manera porque coloca a ambas células hijas en el mismo nivel, sin que una sea "especial" por ser la propia célula madre mientras que la otra se considera la "nueva célula".

Si te enfrentas a una división celular como esta, cualquier célula (eucariota o procariota) solo duplicará realmente su ADN una vez: duplican su ADN -> se dividen en células hijas, en las que "mueren" -> (eventualmente) cada célula hija se duplica su ADN -> y así sucesivamente.

Como dije, este es solo un punto de vista particular que podemos identificar cuando tratamos de comprender y describir el ciclo celular y la división celular (aunque es común para los investigadores en el campo).


ADN III: la replicación del ADN

El descubrimiento de que el ADN es el material que forma nuestros genes (consulte nuestro módulo ADN I: El material genético) abrió la puerta al campo moderno de la biología molecular, a veces llamado genética molecular, en el que los científicos examinan cómo el ADN codifica todas las grandes complejidades de los seres vivos. Uno de los primeros avances importantes del nuevo campo de la biología molecular fue el desciframiento de la estructura de la molécula de ADN: la doble hélice (consulte nuestro módulo ADN II: La estructura del ADN).

Parte de la motivación detrás de los extensos esfuerzos de los científicos para descubrir la estructura del ADN fue el principio científico de larga data de que "la estructura engendra función". En otras palabras, lo que hace una célula o molécula, y cómo lo hace, está determinado por su forma y estructura. Esto tiene sentido incluso en nuestra experiencia diaria. Considere un martillo o un destornillador. Estas importantes herramientas pueden hacer lo que hacen debido a su forma única. Si cambiamos su forma, no funcionarían muy bien. Función de unidades de forma. Lo mismo ocurre con el ADN.

La síntesis de ADN

Como se mencionó en nuestro módulo ADN II, en el momento en que James Watson y Francis Crick observaron por primera vez su modelo de ADN recién construido, pudieron ver pistas sobre una de las principales propiedades que sabían que el ADN debía exhibir de alguna manera: la autorreplicación. El misterio de la autorreplicación había confundido a los científicos durante muchos años. Pero una cosa era segura: cada célula, ya sea una levadura, una bacteria o una célula humana, debe ser capaz de copiar todos sus genes, todo su ADN. Esto se debe a que cuando una célula se divide en dos, ambas células resultantes son genéticamente idénticas entre sí y a la célula madre original. La gran cantidad de veces que el ADN de su cuerpo se ha replicado (y con precisión) es asombrosa.

Comenzaste la vida como una sola célula, un cigoto, el resultado de la fusión de un espermatozoide y un óvulo. Desde entonces, te has convertido en un organismo con entre 10 y 100 billones de células (> 10,000,000,000,000). Y, con algunas raras excepciones, cada uno de sus billones de células tiene la misma secuencia de ADN que tenía una célula cuando era solo un cigoto. ¿Cómo se lleva a cabo toda esta copia de ADN?

Como se mencionó, la estructura de la molécula de ADN de doble hebra dio pistas poderosas sobre cómo se podría copiar con precisión el ADN. Específicamente, el apareamiento de bases complementarias del ADN sigue un patrón estricto que nos permite predecir con precisión cómo se ve una hebra de ADN con solo mirar la otra hebra complementaria. Dicho de otra manera, si alguien tomara una molécula de ADN regular, separara las dos hebras y nos mostrara solo una hebra, podríamos enumerar con precisión la serie de nucleótidos de la hebra faltante.

Watson y Crick vieron esta posibilidad cuando terminaron su artículo diciendo: "No se nos ha escapado que el emparejamiento específico que hemos postulado sugiere de inmediato un posible mecanismo de copia del material genético". Este posible mecanismo de copia se llama semiconservador Replicación del ADN, porque si una célula duplicara su ADN de esta manera, la hélice de ADN se dividiría y la mitad de las dos nuevas hélices dobles retendría el ADN de la hebra original (Figura 1). Si bien este esquema tiene sentido, al principio era solo una suposición lógica. No fue hasta finales de la década de 1950 que Matthew Meselson y Franklin Stahl realizaron el experimento científico que demostró que la replicación del ADN era de hecho semiconservadora. (Consulte nuestro Meselson y Stahl: Modelos de replicación del ADN).

Figura 1: Esquema de la replicación del ADN de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. En este modelo, primero se separan las dos hebras de la molécula de ADN original. Luego, se agregan nucleótidos complementarios (A con T, G con C, etc.) frente a los nucleótidos en ambas cadenas originales. El resultado son dos moléculas de ADN, ambas idénticas a la hebra original (y por lo tanto entre sí), y ambas con una hebra antigua y una hebra nueva.

En la década de 1950, Meselson y Stahl, Watson y Crick y muchos otros científicos exploraron las propiedades del ADN utilizando la bacteria intestinal Escherichia coli. Porque algunas raras cepas de E. coli se ha encontrado que causa enfermedades gastrointestinales, E. coli se asocia frecuentemente con brotes de intoxicación alimentaria. Pero en realidad, la mayoría de las cepas de E. coli son inofensivos y nuestro intestino grueso está lleno de esta bacteria. E. coli fue uno de los primeros "organismos modelo" de uso rutinario, una especie que se elige para un estudio exhaustivo en el laboratorio porque ofrece ciertas ventajas prácticas que facilitan la investigación. E. coli, en particular, se encuentra entre los organismos de más rápido crecimiento en la Tierra, con un tiempo de generación de menos de 20 minutos en condiciones ideales. Desde mucho antes de que supieran qué era el ADN, los científicos habían notado que la cantidad de ADN en un E. coli celda (y cualquier otra celda para el caso) se duplica antes de la división celular. El conjunto de ADN en la célula se divide en partes iguales entre las dos "células hijas" que resultan, de modo que ambas tengan la misma cantidad de ADN que tenía la bacteria original antes de la replicación. Porque todo esto sucede en E. coli en unos 20 minutos, era el organismo lógico que debían seleccionar los primeros biólogos moleculares.

¿Por qué eligieron los biólogos moleculares E. coli para estudios de laboratorio?

In vitro Replicación de ADN

Mientras Meselson, Stahl y otros estaban probando los posibles modelos hipotéticos de replicación del ADN, otros científicos se propusieron comprender su mecanismo molecular recreándolo en un tubo de ensayo. Este proceso se llama in vitro reconstitución y se usa a menudo en el campo de la bioquímica como una forma de simplificar un evento celular complejo para que ocurra de forma aislada y, por lo tanto, pueda ser observado y manipulado a voluntad. Los científicos que pudieron reconstituir por primera vez la replicación del ADN en un tubo de ensayo fueron Arthur Kornberg y su esposa Sylvy y el equipo de investigación que dirigieron. Lograron esta increíble hazaña a través de un minucioso proceso de purificación química sucesiva de diferentes proteínas y otros componentes de grandes lotes de E. coli bacterias. Al separar y purificar componentes individuales, el equipo de investigación de Kornberg hizo varios descubrimientos importantes sobre cómo se produce la replicación del ADN.

Todos estos descubrimientos comenzaron con el desarrollo de una técnica de importancia crítica: el ensayo de síntesis de ADN. Un ensayo es una medición cuantitativa de laboratorio de un determinado proceso biológico o químico, generalmente en un tubo de ensayo (in vitro). El ensayo de síntesis de ADN es una técnica para medir la síntesis de nuevas moléculas de ADN. El laboratorio de Kornberg fue el primero en desarrollar este ensayo, y el ensayo en sí es bastante simple. Primero, los polímeros de ADN se separan fácilmente de los nucleótidos libres porque el ADN no es soluble en soluciones que contienen ácido tricloroacético (TCA), mientras que los nucleótidos libres sí lo son. Si un científico agrega TCA a una mezcla líquida de ADN y nucleótidos libres, el ADN se precipitará, mientras que los nucleótidos permanecerán disueltos en el líquido. El precipitado de ADN se puede separar fácilmente del líquido mediante centrifugación.

La segunda característica importante del ensayo de síntesis de ADN es su uso de nucleótidos marcados radiactivamente. Un científico puede agregar nucleótidos radiactivos al preparar un ensayo de síntesis de ADN y luego, si se ha producido la síntesis de ADN, parte del marcador radiactivo se incorporará al ADN insoluble en TCA. Esto proporciona evidencia de que algunos de los nucleótidos marcados se polimerizaron en una nueva molécula de ADN. Este ensayo de síntesis de ADN es muy simple de ejecutar y también muy cuantitativo, lo que significa que proporciona valores numéricos muy confiables y reproducibles que se pueden usar para calcular cuánto ADN se produjo y qué tan rápido tuvo lugar la síntesis.

Armado con este ensayo, el laboratorio de Kornberg fue el primero en informar la síntesis de ADN fuera de una célula viva. La prensa popular de la época anunció que Arthur Kornberg había "creado vida en un tubo de ensayo".

Por supuesto, este no fue el caso, pero la nueva capacidad para sintetizar ADN in vitro capturó la atención de la población en general y es reconocido como uno de los éxitos cruciales que allanaron el camino para el surgimiento de la ingeniería genética en las décadas de 1970 y 1980. Inicialmente, la síntesis de ADN en el laboratorio era extremadamente lenta (mucho más lenta de lo que ocurre en una célula), y solo se producía cuando se extraían extractos crudos de E. coli se agregaron a los tubos de ensayo. Los extractos crudos contienen todo el contenido de las células: proteínas, nucleótidos, ADN, ARN, lípidos, carbohidratos, etc. Sin embargo, el ensayo de síntesis de ADN fue un buen punto de partida en el que Kornberg y otros pudieron comenzar a diseccionar el proceso de replicación del ADN. en detalle.

El primer descubrimiento y posiblemente el más importante ocurrió en 1955: el equipo de investigación de Kornberg purificó la enzima del extracto crudo que es el principal responsable de la síntesis de ADN. ADN polimerasa. Cuando se agrega ADN polimerasa purificada al ensayo de síntesis de ADN, la síntesis de ADN ocurre cientos de veces más rápido que cuando no se agrega. sin embargo, el in vitro La síntesis de ADN todavía requería la adición de pequeñas cantidades de extracto celular crudo. Esto se debe a que la ADN polimerasa no produce ADN por sí sola; se requieren muchos otros factores y no todos se conocían en ese momento. El laboratorio de Kornberg y otros en todo el mundo trabajaron para purificar otros componentes importantes del extracto crudo, con la esperanza de que algún día pudieran producir ADN usando solo los factores necesarios y sin extracto crudo.

Algunos de estos componentes necesarios eran obvios, mientras que otros eran inesperados. Por ejemplo, se descubrió muy rápidamente que los nucleótidos eran necesarios para la síntesis de ADN, lo que no es muy sorprendente porque era bien sabido, incluso en la década de 1950, que los nucleótidos son los componentes básicos del ADN. Sin embargo, solo los nucleótidos en forma de trifosfato podrían usarse como bloques de construcción de ADN (Figura 2). Estudios posteriores demostraron por qué esto es así: la ruptura del enlace fosfato terminal de alta energía de cada nuevo nucleótido agregado a una molécula de ADN en crecimiento proporciona la energía para la reacción de polimerización.

Figura 2: Solo se pueden usar trifosfatos de nucleótidos para la síntesis de ADN. Aunque los nucleótidos pueden existir con uno, dos o tres fosfatos unidos al carbono 5 'del azúcar pentosa, Kornberg descubrió que solo los nucleótidos trifosfato pueden usarse como bloques de construcción para la síntesis de ADN. Un trabajo posterior demostró que la razón de este requisito es que la ruptura del enlace covalente de alta energía entre los fosfatos proporciona la energía para formar los enlaces covalentes entre nucleótidos adyacentes de ADN.

Otro punto importante que señaló el laboratorio de Kornberg fue que las reacciones de síntesis de ADN del tubo de ensayo requerían la presencia de un ADN molde de copia intacto para que la ADN polimerasa produjera más ADN. En otras palabras, incluso en un tubo de ensayo, la ADN polimerasa no puede construir moléculas de ADN "aleatorias" mediante la polimerización de nucleótidos. Solo puede hacer copias de moléculas de ADN que ya existen. Piénselo de esta manera: la ADN polimerasa es como una fotocopiadora, NO como una computadora con nuevas oraciones que se pueden crear. Una fotocopiadora no puede imprimir nada a menos que tenga una plantilla con la que trabajar. Entonces, cuando Kornberg agregó moléculas de ADN intactas purificadas al ensayo de síntesis de ADN, una vez más, la velocidad de la ADN polimerasa aumentó drásticamente. (Antes de este descubrimiento, la síntesis de ADN se producía solo porque había pequeñas cantidades de plantilla de ADN en el extracto crudo que se agrega a la mezcla de ensayo).

La ADN polimerasa permite sintetizar moléculas de ADN en un tubo de ensayo, un aspecto clave de la ingeniería genética.


6 Procesos y tipos involucrados en la replicación del ADN (con diagrama)

Han pasado más de 30 años desde que J. D. Watson, F. H. C. Crick y M. H. F. Wilkins establecieron la naturaleza helicoidal bicatenaria de la molécula de ADN y sugirieron cómo el ADN sirve en su propia replicación.

De acuerdo con su modelo original para la replicación del ADN, las dos cadenas de polinucleótidos de la doble hélice & # 8220parent & # 8221 se separan y cada una sirve como una & # 8220template & # 8221 para la síntesis de una nueva cadena de polinucleótidos complementaria.

Durante la separación de la hebra, las bases de nitrógeno de cada hebra original se exponen y establecen sitios para la asociación de nucleótidos libres.

Estos nucleótidos luego se unen enzimáticamente para formar una nueva hebra complementaria. Debido a que el ácido desoxiadenílico (dAMP) puede formar enlaces de hidrógeno solo con timina de la hebra molde (y dGMP puede unirse solo a citosina, dCMP solo a guanina y dTMP solo a adenina), la hebra recién sintetizada será idéntica a la hebra complementaria original .

Como resultado, se forman dos nuevas dobles hélices, cada una de las cuales consta de una hebra polinucleotídica de la doble hélice madre y una hebra polinucleotídica recién sintetizada. Debido a que cada una de las dos hélices dobles conserva solo una de las cadenas de polinucleótidos parentales, se dice que el proceso es semiconservador.

Replicación como proceso & # 8220Semiconservative & # 8221:

Aunque el modelo original de Watson-Crick predijo la replicación semiconservativa del ADN, no se verificó hasta los estudios clásicos de M. S. Meselson y F. W. Stahl. En el momento de sus experimentos, se consideraron igualmente factibles otros dos modos de replicación (figura 21-1):

(1) Replicación conservadora, en la que ambas hebras de la doble hélice parental se conservarían y la nueva molécula de ADN consistiría en dos hebras recién sintetizadas y

(2) Replicación dispersiva, en la que la replicación implicaría la fragmentación de la doble hélice parental y la intercalación de piezas de las hebras parentales con piezas recién sintetizadas, formando así las dos nuevas dobles hélices.

Meselson y Stahl verificaron la naturaleza semiconservadora de la replicación del ADN en una serie de elegantes experimentos utilizando ADN marcado isotópicamente y una forma de centrifugación en gradiente de densidad isopícnica (véase el capítulo 12). Cultivaron células de Escherichia coli en un medio en el que el nitrógeno era 15 N (un isótopo de nitrógeno & # 8220 pesado & # 8221, pero no un radioisótopo) en lugar de los 14 N.

Con el tiempo, las purinas y pirimidinas del ADN en las células nuevas contenían 15 N (donde normalmente se encuentran 14 N) y, por lo tanto, las moléculas de ADN eran más densas. El ADN en el que los átomos de nitrógeno son 15 N se puede distinguir del ADN que contiene 14 N porque durante la centrifugación isopícnica, los dos ADN diferentes se agrupan en diferentes posiciones de densidad en el tubo de centrífuga (fig. 21-2).

Meselson y Stahl centrifugaron el ADN aislado de las células durante 2-3 días a velocidades de rotación muy altas en tubos de centrífuga que inicialmente contenían una solución uniforme de CsCl. Durante la centrifugación, se formaron automáticamente gradientes de densidad en los tubos como resultado del equilibrio que se estableció entre la sedimentación de CsCl hacia el fondo del tubo y la difusión de la sal hacia la parte superior del tubo. Esta forma de centrifugación, llamada centrifugación isopícnica de equilibrio,

Dependiendo de su contenido de 15 N y 14 N, el ADN se agrupa en una posición específica en el gradiente de densidad. Debido a que el ADN sintetizado por las células cultivadas en 15 N sería más denso que el ADN que contiene 14 N, se agruparía más abajo en el tubo (fig. 21-2).

Las células que crecieron durante algún tiempo en presencia de medio 15 N se lavaron para liberarlas del medio y se transfirieron a un medio que contenía 14 N y se dejaron continuar creciendo durante períodos de tiempo específicos (es decir, durante varios números de tiempos de generación). El ADN aislado de células cultivadas durante una generación en el medio 14 N tenía una densidad intermedia a la del ADN de las células cultivadas solo en medio que contenía 15 N (identificado como generación 0 en la figura 21-3) y la del ADN a partir de células cultivadas sólo en medio que contiene 14 N (los controles de la figura 21-3).

Tal resultado descartó inmediatamente la posibilidad de que la replicación del ADN fuera conservadora, ya que la replicación conservadora habría producido dos bandas de ADN en el gradiente de densidad para las células de generación 1 (es decir, F). La banda única de densidad intermedia (identificada como ADN & # 8220híbrido & # 8221 en la figura 21-3) consistía en moléculas de ADN en las que una hebra contenía 15 N y la otra 14 N.

Cuando la incubación en medio 14 N se llevó a cabo durante dos generaciones de tiempo (es decir, generación 2), se formaron dos bandas de ADN, una en la misma posición de densidad que el ADN de células cultivadas exclusivamente en medio 14 N (es decir, & # 8220 controles de luz & # 8221) y uno de densidad intermedia. Las generaciones posteriores produjeron un mayor número de moléculas de ADN que formaron bandas en la posición & # 8220light & # 8221 (ADN que contiene 14 N) en el gradiente de densidad. Estos resultados son consistentes solo con el modelo de replicación semiconservadora.

La replicación dispersiva habría producido una sola banda para cada generación y la banda se habría encontrado en posiciones de densidad sucesivamente más ligeras en el gradiente. Los estudios que utilizan otros procariotas además de eucariotas indican que la replicación semiconservativa del ADN es probablemente el mecanismo universal.

Replicación por adición de nucleótidos en el 5 & # 82423 y # 8242 Dirección:

Cada nucleótido de una hebra de ADN se une al siguiente nucleótido mediante un enlace fosfodiéster que une el carbono 3 & # 8242 de su desoxirribosa con el carbono 5 & # 8242 de la desoxirribosa del siguiente nucleótido. En un extremo de la cadena de polinucleótidos, hay un grupo hidroxilo unido al carbono 3 & # 8242 del último nucleótido, y en el otro extremo hay un grupo fosfato unido al carbono 5 & # 8242.

Las dos cadenas de una doble hélice tienen polaridades opuestas y se dice que son antiparalelas, es decir, cada extremo de la doble hélice contiene el extremo 5 & # 8242 de una hebra y el extremo 3 & # 8242 de la otra. Durante la replicación, la unión de un nucleótido a una hebra en crecimiento siempre tiene lugar en la posición terminal 3 & # 8242 de esa hebra. En otras palabras, la cadena de polinucleótidos en formación & # 8220 crece & # 8221 desde su extremo 5 & # 8242 hacia su extremo 3 & # 8242.

Replicación unidireccional y bidireccional:

La replicación comienza en un punto del cromosoma donde las dos hebras parentales comienzan a separarse, este punto se llama origen. La adición de nucleótidos complementarios para formar dos nuevas hebras tiene lugar a lo largo de ambas plantillas de hebras parentales a partir de ese punto (fig. 21-4).

En la replicación unidireccional, el crecimiento avanza a lo largo de ambas hebras en la misma dirección desde el origen. A lo largo de una de las hebras molde parentales, la síntesis de la nueva hebra complementaria tiene lugar mediante la adición continua de nucleótidos al extremo 3 & # 8242 disponible de la hebra en formación. La hebra en crecimiento se llama hebra principal o hebra continua. El extremo 5 & # 8242 de esta hebra se encuentra en el origen y su extremo 3 & # 8242 en la horquilla de replicación móvil (es decir, el punto progresivo de separación de las hebras parentales).

La otra hebra de polinucleótidos que se está formando se llama hebra retrasada o hebra discontinua. El alargamiento de esta hebra se produce mediante un mecanismo algo modificado. En contraste con la hebra principal, la hebra retrasada tiene su posición 3 & # 8242 en el origen y su posición 5 & # 8242 en la horquilla de replicación. Si se añadieran secuencialmente nucleótidos al final de la hebra rezagada en la bifurcación de replicación, entonces el crecimiento de esta hebra y # 8217s procedería en una dirección 3 & # 8217 → 5 & # 8242.

Esto no ocurre. En cambio, el crecimiento tiene lugar mediante la síntesis de una serie de cadenas polinucleotídicas cortas entre la horquilla de replicación y el origen. Cada cadena corta se coloca en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242 y luego se unen entre sí y al extremo 5 & # 8242 de la hebra retrasada.

Como resultado, la dirección general de crecimiento de la hebra rezagada es la misma que la de la hebra principal. El patrón de crecimiento inusual que caracteriza la síntesis de la hebra rezagada explica por qué también se la conoce como hebra & # 8220discontinua & # 8221.

En la replicación bidireccional (fig. 21-5), se forman dos horquillas de replicación en el origen que se alejan del origen en ambas direcciones a medida que se separa la doble hélice parental. La síntesis de las hebras complementarias también se produce en ambas direcciones. Detrás de cada horquilla hay un conjunto de hebras anteriores y posteriores. Como en el caso de la replicación unidireccional, el alargamiento de las dos hebras principales es continuo, mientras que el alargamiento de las dos hebras retrasadas es discontinuo.

Cabe señalar que independientemente de si la replicación es unidireccional o bidireccional, la adición de nucleótidos siempre ocurre en la dirección de 5 & # 8242 a 3 & # 8242, a medida que se agregan nuevos nucleótidos a los extremos 3 & # 8242 disponibles de la hebra continua o la hebra discontinua. R. Okazaki demostró por primera vez la síntesis discontinua de hebras rezagadas. Okazaki incubó células de E. coli en un medio que contenía 3 H-timidina durante períodos de tiempo muy cortos (un pulso de solo 15 segundos) y luego examinó la distribución del radioisótopo en el ADN recién sintetizado.

El radioisótopo se encontró en varios polinucleótidos (1000-2000 nucleótidos de longitud), ahora denominados fragmentos de Okazaki (Figs. 21-4 y 21-5). Cuando las células pulsadas se transfirieron a un medio sin marcar durante períodos de tiempo variables antes del análisis, el marcador radiactivo se recuperó en tramos mucho más largos de ADN. Esto se debe a que los fragmentos de Okazaki producidos durante el pulso corto de tritio se habían unido y conectado al extremo 5 & # 8242 de la hebra rezagada.

En las células eucariotas, los fragmentos de Okazaki suelen ser más pequeños (alrededor de 100-200 nucleótidos de largo). La replicación bidireccional del ADN es el mecanismo empleado en todas las células eucariotas y en la mayoría de las procariotas. La replicación unidireccional es rara y parece ocurrir solo en un número limitado de procariotas.

Visualización de la replicación en E. coli:

En 1963, J. Cairns desarrolló un procedimiento que emplea una combinación de microscopía y autorradiografía que hizo posible visualizar la replicación del cromosoma de E. coli. Cairns colocó en placas células de E. coli en un medio que contenía 3 H-timidina durante varios períodos de tiempo de modo que la timidina radiactiva se incorporó al ADN a medida que el cromosoma se replicaba en generaciones sucesivas de células.

Las células se extrajeron del medio después de varios períodos de incubación y se lisaron suavemente para liberar el cromosoma de la célula (las fuerzas de cizallamiento creadas por la lisis severa rompen el cromosoma en pequeños trozos). A continuación, los cromosomas se transfirieron a portaobjetos de vidrio y se recubrieron con una emulsión fotográfica sensible a las partículas beta de baja energía emitidas por la 3 H-timidina.

Después de exponer la emulsión a los rayos beta, la emulsión se desarrolló y se examinó mediante microscopía óptica. Dondequiera que se hubiera producido la descomposición de la timidina marcada en un cromosoma, la emulsión se expuso y se crearon granos visibles.

Un cromosoma que no participaba en la replicación apareció como una estructura circular formada a partir de una sucesión cercana de puntos de exposición. Los cromosomas & # 8220 atrapados en el acto & # 8221 de replicación dieron lugar a lo que se denominan estructuras theta porque tienen la apariencia de la letra griega theta (es decir, 0) (figura 21-6). Las estructuras theta revelan las posiciones de las horquillas de replicación en el cromosoma circular.

El Replicón y la Secuencia de Replicación:

La secuencia de eventos que tiene lugar durante la replicación del ADN se comprende mejor para los procariotas y parece ser la siguiente (figura 21-7). La separación de la hebra parental comienza en un sitio llamado origen que contiene una secuencia de nucleótidos especial y dirige la asociación de varias proteínas. Las enzimas de desenrollado dependientes de ATP (también llamadas helicasas) promueven la separación de las dos hebras parentales y establecen horquillas de replicación que se alejarán progresivamente del origen (fig. 21-7a) las helicasas separan la hebra parental a aproximadamente 1000 pares de bases por segundo.

Detrás de la bifurcación de replicación, se evita que las hebras simples de ADN se rebobine una sobre la otra (o que formen bucles de horquilla de doble hebra en cada hebra simple) por las acciones de un conjunto de proteínas llamadas proteínas desestabilizadoras de hélice o proteínas de unión de hebra única (es decir, , & # 8220SSBs & # 8221) (Fig. 21-7b). La acción de una helicasa introduce un superenrollamiento positivo en el ADN dúplex antes de la horquilla de replicación. Las enzimas llamadas topoisomerasas relajan el superenrollamiento uniéndose al dúplex transitoriamente superenrollado, cortando una de las hebras y haciéndola girar a través de la hebra intacta. A continuación, se vuelve a sellar la muesca.

Antes de que la síntesis de ADN comience en el origen, se forman polinucleótidos de ARN cortos que son complementarios a la plantilla de ADN. Estos tramos de ARN se denominan cebadores y también se colocan en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242. A continuación, se añaden los nucleótidos de ADN de uno en uno a los extremos libres 3 & # 8242 de los cebadores de ARN. Debido a que el crecimiento de la hebra rezagada es discontinuo, se forman varios cebadores de ARN y fragmentos de Okazaki. Tenga en cuenta que debe formarse un cebador de ARN para cada fragmento de Okazaki que se depositará (figura 21-7c). Las enzimas necesarias para la síntesis de los cebadores de ARN son una clase especial de ARN polimerasas llamadas ARN primasas.

El alargamiento de la cadena principal y la síntesis de los fragmentos de Okazaki son catalizados por una enzima llamada ADN polimerasa III. Los sustratos de la ADN polimerasa III son los desoxinucleósidos trifosfatos (por ejemplo, dATP, dGTP, dCTP y dTTp). La adición de un nucleótido a la posición 3 & # 8242 disponible de la hebra líder en continuo crecimiento o un fragmento de Okazaki de la hebra retrasada implica la eliminación de pirofosfato para producir un monofosfato de desoxinucleósido (por ejemplo, dAMP, dGMP, dCMP y dTMP).

Una vez finalizados los fragmentos de Okazaki, los cebadores de ARN son escindidos por la ADN polimerasa I, que luego llena los huecos resultantes con ADN (figura 21-7d). Después de que la ADN polimerasa I agrega el desoxirribonucleótido final en el espacio dejado por el cebador escindido, la enzima ADN ligasa forma el enlace fosfodiéster que une el extremo libre 3 & # 8242 del reemplazo del cebador al extremo 5 & # 8242 del fragmento de Okazaki (Fig. 21-7f).

ADN polimerasas y & # 8220Processivity & # 8221:

En general, en las células se encuentran tres enzimas polimerasas de ADN diferentes. En los procariotas, estos se denominan ADN polimerasa I, ADN polimerasa II y ADN polimerasa III. Como se indicó anteriormente, la ADN polimerasa I escinde los cebadores de ARN y llena los huecos con ADN, mientras que la ADN polimerasa III agrega nucleótidos a la cadena principal en crecimiento y a los extremos 3 & # 8242 de los cebadores de ARN.

La función de la ADN polimerasa II sigue siendo desconocida. En las células eucariotas, las ADN polimerasas son ADN polimerasa a, ADN polimerasa II y ADN polimerasa 7; sus funciones se comparan con las de las enzimas procarióticas en el cuadro 21-1. La rapidez y eficacia con la que una ADN polimerasa extiende una cadena en crecimiento se denomina procesividad. Por ejemplo, la procesividad de la ADN polimerasa III que actúa sobre el extremo 3 & # 8242 de la hebra principal es muy alta porque la enzima permanece asociada con el extremo en crecimiento de la cadena y la hebra molde.

Durante la replicación unidireccional, la horquilla de replicación rodea completamente el cromosoma y las moléculas de ADN resultantes se separan. Para los procariotas en los que la replicación es bidireccional, las horquillas de replicación avanzan alrededor del cromosoma hasta que se encuentran. En los cromosomas eucariotas, donde hay muchas unidades de replicación o replicones, todos los replicones se unen antes de que las cromátidas puedan separarse. El replicón consiste en ese segmento de un cromosoma que incluye un origen y dos puntos de terminación (es decir, puntos donde termina la replicación).

NK Sinha y A. Kornberg han sugerido que las ADN polimerasas, las ARN primasas y las helicasas pueden asociarse entre sí para formar un complejo multienzimático, el replisoma que lleva a cabo la síntesis de las cadenas principales y rezagadas de manera coordinada (Fig. 21-8). Un complejo de este tipo sería altamente procesable y aseguraría una rápida replicación del ADN.

Alta fidelidad de replicación:

A pesar de la complejidad del proceso y la rapidez con la que procede, se cometen muy pocos errores durante la replicación del ADN. Por ejemplo, se estima que por cada error que ocurre, 10 9 pares de bases se replican fielmente. La alta fidelidad de la replicación del ADN se atribuye en parte a las propiedades especiales de las ADN polimerasas.

Las ADN polimerasas agregarán un nucleótido al extremo 3 & # 8242-OH disponible de una cadena de ADN en crecimiento (o cebador de ARN) solo si el nucleótido anterior está emparejado correctamente con el nucleótido molde. Si está presente un nucleótido no emparejado, el crecimiento de la hebra se detiene transitoriamente mientras se escinde un segmento de la hebra que contiene el error. Con un extremo 3 & # 8242 corregido restablecido, se reanuda el alargamiento por la ADN polimerasa.

Queda mucho por aprender sobre las enzimas que catalizan las reacciones de replicación. Hasta ahora, el principal obstáculo para tales estudios ha sido la dificultad de aislar y purificar las enzimas, ya sea individualmente o en complejos. Esto se debe en parte al hecho de que algunos de ellos pueden estar asociados con membranas. En las células procariotas, las horquillas de replicación están unidas a la membrana plasmática.

Se ha demostrado que alrededor de dos docenas de proteínas diferentes están involucradas en la replicación del ADN en las células de E. coli. Varias de las proteínas de E. coli están involucradas en las reacciones previas al cebado, es decir, las reacciones que ocurren antes de la formación de cebadores de ARN.


Reparación de ADN

Nuestros editores revisarán lo que ha enviado y determinarán si deben revisar el artículo.

Reparación de ADN, cualquiera de los varios mecanismos mediante los cuales una célula mantiene la integridad de su código genético. La reparación del ADN asegura la supervivencia de una especie al permitir que la descendencia herede el ADN de los padres con la mayor fidelidad posible. It also preserves the health of an individual. Mutations in the genetic code can lead to cancer and other genetic diseases.

Successful DNA replication requires that the two purine bases, adenine (A) and guanine (G), pair with their pyrimidine counterparts, thymine (T) and cytosine (C). Different types of damage, however, can prevent correct base pairing, among them spontaneous mutations, replication errors, and chemical modification. Spontaneous mutations occur when DNA bases react with their environment, such as when water hydrolyzes a base and changes its structure, causing it to pair with an incorrect base. Replication errors are minimized when the DNA replication machinery “proofreads” its own synthesis, but sometimes mismatched base pairs escape proofreading. Chemical agents modify bases and interfere with DNA replication. Nitrosamines, which are found in products such as beer and pickled foods, can cause DNA alkylation (the addition of an alkyl group). Oxidizing agents and ionizing radiation create free radicals in the cell that oxidize bases, especially guanine. Ultraviolet (UV) rays can result in the production of damaging free radicals and can fuse adjacent pyrimidines, creating pyrimidine dimers that prevent DNA replication. Ionizing radiation and certain drugs, such as the chemotherapeutic agent bleomycin, can also block replication, by creating double-strand breaks in the DNA. (These agents can also create single-strand breaks, though this form of damage often is easier for cells to overcome.) Base analogs and intercalating agents can cause abnormal insertions and deletions in the sequence.

There are three types of repair mechanisms: direct reversal of the damage, excision repair, and postreplication repair. Direct reversal repair is specific to the damage. For example, in a process called photoreactivation, pyrimidine bases fused by UV light are separated by DNA photolyase (a light-driven enzyme). For direct reversal of alkylation events, a DNA methyltransferase or DNA glycosylase detects and removes the alkyl group. Excision repair can be specific or nonspecific. In base excision repair, DNA glycosylases specifically identify and remove the mismatched base. In nucleotide excision repair, the repair machinery recognizes a wide array of distortions in the double helix caused by mismatched bases in this form of repair, the entire distorted region is excised. Postreplication repair occurs downstream of the lesion, because replication is blocked at the actual site of damage. In order for replication to occur, short segments of DNA called Okazaki fragments are synthesized. The gap left at the damaged site is filled in through recombination repair, which uses the sequence from an undamaged sister chromosome to repair the damaged one, or through error-prone repair, which uses the damaged strand as a sequence template. Error-prone repair tends to be inaccurate and subject to mutation.

Often when DNA is damaged, the cell chooses to replicate over the lesion instead of waiting for repair ( translesion synthesis). Although this may lead to mutations, it is preferable to a complete halt in DNA replication, which leads to cell death. On the other hand, the importance of proper DNA repair is highlighted when repair fails. The oxidation of guanine by free radicals leads to G-T transversion, one of the most common mutations in human cancer.

Hereditary nonpolyposis colorectal cancer results from a mutation in the MSH2 and MLH1 proteins, which repair mismatches during replication. Xeroderma pigmentosum (XP) is another condition that results from failed DNA repair. Patients with XP are highly sensitive to light, exhibit premature skin aging, and are prone to malignant skin tumours because the XP proteins, many of which mediate nucleotide excision repair, can no longer function.


Differences and Similarities between DNA and RNA

Both molecules are nucleic acids made up of nucleotides, supported by a phosphate backbone. They are both major players in the central dogma. RNA is transcribed from the DNA to make proteins. DNA carries all the information needed for DNA replication and transfer new information to new cells.

They are involved in the maintenance, replication, and expression of hereditary information. DNA holds the key to heredity. RNA helps DNA unlock this code and show us what this code is capable of achieving. Together these molecules ensure that the DNA is replicated, the code is translated, expressed and that things go where they should go.

DNA and RNA work hand in hand in biology. It is rare that one can speak of the one without bringing up the other. Simply put, they are connected by the central dogma. The central dogma is the process of DNA transcription and translation for the purpose of protein synthesis which then perform a multitude of tasks in organisms. Different types of proteins guide the gene expression. Therefore, even though the DNA is the same throughout- different things happen at different part of the body. In addition to this, it also tells stem cells what to differentiate to. This is due to strict regulatory mechanisms in place to control gene expression.

Both DNA and RNA have a negative backbone (because of the phosphate group). They both have four nucleotides each, three of which they share (Guanine, Cytosine, and Adenine) with one significant difference, DNA has Thymine while RNA has Uracil. DNA is double-stranded while RNA is single-stranded. Last but not least, DNA is found in the nucleus while RNA resides both in the nucleus and the cytoplasm. DNA is long-lived while RNA is regenerated with each reaction.

They are both central to cell function.


Bacterial Replication

The single chromosome of a bacterium is a loop of double-stranded DNA. The number of bases can vary from one species to another. The well-known bacteria E. coli has 4.7 million base pairs that take about 40 minutes to replicate, implying a speed of over 1,000 bases per second.

Replication starts at a single fixed location and proceeds on each strand in opposite directions. The replication process includes a proofreading step that ensures a mistake rate no higher than one in one billion.


DNA replication - how many times and when does it occur? - biología

DNA replication is a semi-conservative process that occurs during the S phase of interphase. It is the process by which an organism’s DNA is replicated to produce two identical copies.

It starts at the origin of replication. Prokaryotes have one origin of replication, whereas eukaryotes have multiple. At each origin of replication, there is a replication bubble that contains two replication forks. At each replication fork is the enzyme DNA helicase that unwinds the DNA’s double helix structure. It does this by breaking the hydrogen bonds between nitrogenous bases, separating the two DNA strands. Single strand binding proteins prevent separated strands from reattaching at the replication fork. The two separated strands of DNA are now called template strands.

DNA polymerase III is the enzyme that is used to build a complementary DNA strand using a template strand. It does this by attaching nucleoside triphosphates to the 3’ end of a nucleotide. DNA polymerase III also ensures that the nucleotides being attached have complementary bases to the template strand. However, DNA polymerase III cannot add nucleotides to the template strand. So the RNA primase creates RNA primers: short RNA sequences that are complementary to the DNA template strand. The DNA polymerase III then has available 3’ ends to add nucleotides to. However, DNA polymerase III can only do this in a 5’ to 3’ direction.

DNA is antiparallel that is, each strand goes in the opposite direction (as seen in the diagram below).

Because of this, the two template strands are also in different directions. In the diagram above, the strand on the right would be the leading strand. This means that after an RNA primer is placed at the 3’ end of this strand, DNA polymerase can build its complementary strand continuously in a 5’ to 3’ direction.

The strand on the right of the diagram is the lagging strand. The lagging strand appears to be growing in a 3’ to 5’ direction, but this is not the case. The lagging strand is divided into segments called Okazaki fragments that are being individually built in a 5’ to 3’ direction by DNA polymerase III. Each fragment begins with an RNA primer. As helicase unzips the DNA double helix, more and more primers are added.

Other enzymes are involved in DNA replication as well. DNA polymerase I removes RNA primers and replaces them with DNA nucleotides. DNA ligase forms phosphodiester bonds between the DNA nucleotides that DNA polymerase I adds and the ends of Okazaki fragments. Finally, enzymes proofread the DNA strands to check for mistakes, preventing mutation.

7.1.1 Nucleosomes help to supercoil the DNA.

Nucleosomes also help to regulate gene expression. Some DNA is wrapped around the histones in the nucleosome and is not accessible by the RNA polymerase so it cannot be transcribed

Video de Youtube

7.1.2 DNA structure suggested a mechanism for DNA replication.

DNA is double stranded and the two strands are joined together via complementary base pairing. Therefore, it stands to reason that during replication the two strands separate and then through complementary base pairing nucleotides join the separated strands. And this would make 2 new, identical strands of DNA.

7.1.3 DNA polymerases can only add nucleotides to the 3’ end of a primer.

DNA polymerase cannot add bonds to the phosphate on the 5' end of DNA, so it creates bonds on the 3' end.

7.1.4 DNA replication is continuous on the leading strand and discontinuous on the lagging strand.

DNA replication occurs on both strand of the DNA, one strand is called the leading strand and the other is called the lagging. The leading strand is the one that moves in a 3' to 5' direction in the same way the helicase does.

7.1.5 DNA replication is carried out by a complex system of enzymes.

DNA polymerase III - Catalyzes the reaction that binds free floating nucleotides to make a new DNA strand

Helicase - Separates the original DNA strands

Gyrase/Topoisomerase - Helps uncoil the DNA helix

DNA Primase - Provides a site called the primase for the DNA polymerase III to begin adding nucleotides.

DNA Polymerase I - Replaces the RNA primer with DNA

Single Strand Binding Proteins - Prevents the DNA from re-annealing

Ligase - Joins the okazaki fragments together

7.1.6 Some regions of DNA do not code for proteins but have other important functions.

DNA that does not code for a protein is referred to as a non-coding sequence. Some non-coding sequences have important functions such as regulating gene expression by promoting and repressing the transcription of genes next to the.

Additionally, many DNA coding sequences are interrupted by non-coding sequences called introns. The introns are removed before translation but they are important in mRNA processing

On the ends of chromosomes are non-coding sequences called telomeres. During DNA replication the end of the molecule cannot be replicated so telomeres protect parts of the DNA from being lost during replication

Lastly, some non-coding sequences code for tRNA molecules instead of a protein.


7.1.7 Rosalind Franklin’s and Maurice Wilkins’ investigation of DNA structure by X-ray diffraction.

In 1950, Marice Wilkins developed a method of producing a way of imaging DNA molecule through X-Ray diffraction. Rosalind Franklin worked in the same lab as Wilkins and developed a high-resolution detector that took very clear images of DNA. Her findings were essential in the discovery of the double helix by Crick and Watson

7.1.8 Use of nucleotides containing dideoxyribonucleic acid to stop DNA replication in preparation of samples for base sequencing.

DNA sequencing is a process by which the order of the nucleotides in DNA can be found. One of the preliminary steps for DNA sequencing is fragmenting the DNA into pieces. To do this ddNA is added (dideoxyribonucleic acid) which do not have a OH molecule on the 3' end of the ribose sugar, this means that when the DNA polymerase reaches the ddNA it cannot continue replicating.

Gel electrophoresis is the process by which the sequence of the DNA is found. The fragmented DNA is put into a gel and an electric current runs through it. DNA is a polar molecule and is affected by the electric current and moves down the gel. Lighter/smaller fragments of the DNA moves further while heavier/longer fragments move very little. The result is a pattern of bands that one can use to figure out the sequence of the DNA. But remember that the sequence of the original strand is complementary the one shown by the banding patterns since the DNA had replicated.


7.1.9 Tandem repeats are used in DNA profiling.

A variable number tandem repeat (VNTR) is a short sequence of nucleotides that can be used to create a profile of a person based on how many times the sequence is repeated. The VNTR is found at the same locus (location on the chromosome) among different people making it relatively simple to find. DNA profiling can be used to solve criminal cases and solve parental disputes among other things


7.1.10 Analysis of results of the Hershey and Chase experiment providing evidence that DNA is the genetic material.

Hershey and Chase conducted an experiment to see whether proteins or DNA were the genetic material of the cell. To do this, they infected an E.coli bacteria with the T2 Phage virus. Viruses consist of only DNA inside a protein coat so there were no other variables in the mix.

DNA contains phosphorus but not sulphur, and proteins can contain sulphur but not phosphorous. This distinction was used in the experiment using isotopes (different forms) of sulphur and phosphorous. They made two strains of the T2 Phage bacteria, one with a heavier phosphorus isotope in the DNA, and one with a heavier sulphur isotope in the proteins. They did this by putting the T2 phage in a solution with everything necessary to replicate and only the heavier version of the sulphur or the heavier version of the phosphorous. After the T2 phage replicated a couple of times it would mostly consist of the heavier isotope

Hershey and Chase caused the T2 phage virus to inject its genetic material into the E. Coli bacteria. And then they put that E. Coli in a test tube and put that test tube in a centrifuge to spin it really fast in a circle. Because of the quick, circular motion the heavier parts of the E. Coli moved to the bottom of the test tube while the lighter isotopes were at the top.

When the sulphur strain injected its genetic material the percentage of heavy isotopes vs light isotopes were negligible. However, when the phosphorous strain of the virus injected its genetic material into the bacteria 65% of the DNA in the E. Coli was of the heavy isotope based on the centrifuge results.


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La replicación del ADN requiere la cooperación de muchas proteínas. Éstos incluyen

  1. ADN polimerasa y ADN primasa para catalizar la polimerización de nucleósido trifosfato
  2. ADN helicasas y proteínas monocatenarias de unión al ADN (SSB) para ayudar a abrir la hélice del ADN para que pueda copiarse
  3. ADN ligasa y una enzima que degrada los cebadores de ARN para sellar juntos los fragmentos de ADN de hebra rezagada sintetizados de manera discontinua
  4. Topoisomerasas de ADN para ayudar a aliviar los problemas de enrollamiento helicoidal y enredo del ADN. Muchas de estas proteínas se asocian entre sí en una bifurcación de replicación para formar una “máquina de replicación” altamente eficiente, a través de la cual se coordinan las actividades y los movimientos espaciales de los componentes individuales.

Extrinsic Controls

In addition to intrinsic controls exerted by CDKs and checkpoints, many external controls affect cell division. Both normal and abnormal cell cycles can be triggered by such extrinsic controls. Por ejemplo, el hormona estrogen affects the development of a wide variety of cell types in women. Estrogen exerts its effects on a receptive cell by binding to a specific receptor protein on the cell's nuclear membrane. By binding to an estrogen receptor, estrogen initiates a cascade of biochemical reactions that lead to changes in the cell-cycle program. Normally, estrogen moves cells out of a resting stage into an active cell cycle.

In a different context, however, even normal levels of estrogen encourage the growth of some forms of breast cancer. In these cases, estrogen increases the speed with which the cancerous cells complete their cell cycles, leading to more rapid growth of the tumor. The most effective current drug therapies for such breast cancers block the estrogen receptor's estrogenbinding ability, making cells unresponsive to estrogen's proliferation signal. Thus, while estrogen itself does not cause breast cancer, it plays an important role in stimulating the growth of some cancers once they initiate by other mechanisms, such as by an unregulated CDK or a defect in a cell-cycle checkpoint.


Ver el vídeo: La Replicación del ADN (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Howland

    Aquí entre nosotros, en mi opinión, es obvio. No quisiera desarrollar este tema.

  2. Voll

    Entre nosotros, trataría de resolver el problema en sí.

  3. Matholwch

    Que divertida pregunta

  4. Tantalus

    Esta es la mentira.

  5. Maramar

    Cometer errores. soy capaz de demostrarlo. Escríbeme por MP.

  6. Marti

    Te pido disculpas, pero, en mi opinión, cometes un error. Discutámoslo. Escríbeme por PM, hablamos.

  7. Nikoktilar

    Me uno. Todo lo anterior dijo la verdad. Discutamos esta pregunta. Aquí o en PM.



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