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Generar E. coli resistente a los fagos T2 / T1

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Me gustaría generar Stbl3 E Coli resistente al fago T2 / T1 para usar en la producción de virus. ¿Hay algún plásmido que alguien haya usado que confiera resistencia, o se hace de otra manera?


Resistencia a antibióticos, factores de virulencia y genotipificación de uropatógenos Escherichia coli son

La forma de tratar los diferentes tipos de enfermedades infecciosas es realmente importante. Usando el método de genotipado, podemos determinar la relación genética entre los organismos con diferentes perfiles de resistencia de diferentes fuentes. El objetivo de este estudio fue determinar la resistencia a los antibióticos y la genotipificación de uropatógenos Escherichia coli (UPEC) mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

Método

Escherichia coli (E. coli) se recuperaron cepas de pacientes con infecciones del tracto urinario (ITU) que ingresaron en varios hospitales importantes de Teherán. Las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos se realizaron de acuerdo con las pautas de CLSI. La presencia de algún factor de virulencia se ha detectado mediante un ensayo de PCR. El genotipado de las cepas se realizó mediante PFGE y todos los perfiles de PFGE se sometieron a procesamiento de datos.

Resultado

En total, 60 E. coli Las cepas fueron sometidas al estudio. La mayoría de E. coli los aislados fueron resistentes a cefepima (100%) y cefalotina (74%) y susceptibles a imipenem (100%), vancomicina (100%) y doxiciclina (100%). Entre los aislados de UPEC la prevalencia de fimbrias tipo I (fimH), hemolisina (hlyA) y aerobactina (aer) genes fueron 89%, 60% y 90%, respectivamente. El PFGE diferenciado E. coli cepas en 33 grupos genéticos diferentes. La mayoría (30%) de ellos, incluido el PFGE tipo 11, generó 15 bandas, mientras que el PFGE tipo 2 fue el grupo prevalente más bajo (2%) con 9 bandas.

Conclusión

El resultado mostró que la resistencia a los antibióticos está aumentando rápidamente. Las cepas de UPEC que causan infecciones tienen más probabilidades de albergar ciertos genes de virulencia. Nuestro hallazgo también mostró E. coli las cepas aisladas en el estudio pertenecían a los diversos clones.


Betty Kutter, la salvia del fago de Evergreen

Docente emérita y sabia de fagos, Betty Kutter. Foto de Karissa Carlson '12.

Phage tiene una rica historia en Evergreen. Elizabeth (Betty) Kutter, quien comenzó a enseñar en Evergreen en 1972, ha investigado los fagos desde sus días universitarios, en 1963. Ahora con 75 años, esta facultad emérita no ha frenado Kutter todavía supervisa de tres a cinco estudiantes al año en el Evergreen Phage Lab. , que creó en el segundo año de la universidad.

Bacterias infectadas con T4. Foto de R. Bijlenga.

El trabajo de Kutter con los fagos la ha puesto a ella, y a sus estudiantes, en contacto con virólogos, bacteriólogos, profesionales del cuidado de heridas, veterinarios y especialistas de todo el mundo, de países como Georgia (en Eurasia) y Polonia, que usan fagos en medicina. práctica, a Bélgica, Francia y otros países que trabajan para revitalizar el uso de la terapia con fagos.

Del 2 al 7 de agosto marcará el 40 aniversario de la Reunión Internacional de Biología de Fagos, un evento mundial que tiene lugar en Evergreen cada dos años. 2015 será la 21ª vez que los científicos de fagos se reúnen en el campus de Olympia. Kutter espera 200 asistentes de todo el mundo, los más importantes entre ellos científicos que investigan los fagos, así como médicos y expertos en seguridad alimentaria que ya usan fagos. Muchos asistentes presentarán sus hallazgos durante la conferencia de cinco días. El grupo forjará vínculos a través de actividades grupales, que incluyen un horneado de salmón de bienvenida preparado por una familia de la tribu Chehalis y una excursión de un día al Parque Nacional Mount Rainier.

El trabajo inicial del laboratorio de fagos se centró en la genética de los fagos y la transición del metabolismo del huésped al del fago después de la infección de E. coli por un fago específico llamado T4. Desde entonces, la colaboración con miembros de la comunidad internacional de fagos ha agregado nuevas exploraciones, incluido el proyecto del genoma T4 de las décadas de 1980 y 1990, infecciones anaeróbicas, simulaciones ecológicamente relevantes y una variedad de nuevos fagos.

Betty Kutter, entonces miembro de la facultad, al frente, con estudiantes de Evergreen en 1975.


Información de soporte

Comparación de la actividad de β-gal sobreexpresada con diferentes tipos de tratamiento comparación de un paso E. coli detección con T7 de ingenieríacontrol y T7lacZ detección de bacteriófagos en dos pasos de E. coli células a bajas concentraciones usando T7lacZ Determinación de alto rendimiento de bacteriófagos de ingeniería de bacterias Perfiles de resistencia a antibióticos utilizando T7control bacteriófago diseñado y sección experimental. Plásmido pUC57 de construcción insertado LacZ y lacZ que expresa T7lacZ genoma (PDF)


Neurobiología de los esteroides

Nancy R. Nichols,. Caleb E. Finch, en Métodos en neurociencias, 1994

Comentarios

Los vectores de fagos lambda tienen la ventaja de altas eficiencias de transformación debido a buenos extractos de empaquetamiento disponibles comercialmente, sin embargo, la combinación de electroporación de ADN plasmídico que contiene insertos de ADNc y ciertas cepas de E. coli ahora puede rivalizar con los fagos. Más importante aún, es nuestra experiencia que los levantamientos de réplicas de placas son más reproducibles que los levantamientos de réplicas de colonias, por lo tanto, el cribado por hibridación diferencial puede tener menos errores inherentes cuando se usa una biblioteca de fagos.

Los métodos detallados para cultivar y construir una biblioteca en λgt10 se describen en Davis et al. (8) y Huynh et al. (7). Alternativamente, el sistema de vector Uni-ZAP XR (Stratagene) también se ha utilizado en este laboratorio para la construcción de bibliotecas de ADNc y el cribado mediante hibridación diferencial (9). Este sistema combina un vector de fago λ con rescate de plásmido Bluescript, evitando los pasos adicionales necesarios para subclonar fragmentos de restricción de ADN de fago recombinante en un vector de plásmido para secuenciar y hacer sondas de ARNc.


Información del autor

Estos autores contribuyeron igualmente: Gabriel T. Filsinger, Timothy M. Wannier.

Afiliaciones

Departamento de Biología de Sistemas, Escuela de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Gabriel T. Filsinger, Timothy M. Wannier, Devon A. Stork, Verena Volf, Stan Wang y George M. Church

Departamento de Genética, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Timothy M. Wannier, Anik Debnath, Helene Kuchwara, Stan Wang, Xavier Rios, Christopher J. Gregg, Marc J. Lajoie, John Aach y George M. Church

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del Sur de Dinamarca, Odense, Dinamarca

Instituto de Diseño de Proteínas, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Departamento de Matemáticas, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Tenza Inc., Cambridge, MA, EE. UU.

Departamento de Biología, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Kevin Gozzi y Michael T. Laub

Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Institutos Gladstone, San Francisco, CA, EE. UU.

Departamento de Bioingeniería y Ciencias Terapéuticas, Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

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Contribuciones

G.T.F., T.M.W. y G.M.C. concibió el estudio. X.R., C.J.G. y M.J.L. contribuido a la concepción del proyecto. G.T.F. diseñó los experimentos bacterianos. T.M.W., F.B.P., I.D.L., J.Z., K.G. y A.D. contribuyeron al diseño experimental bacteriano. G.T.F., F.B.P., I.D.L. y J.Z. llevó a cabo los experimentos en E. coli, L. lactis, M. smegmatis, C. crescentus y L. rhamnosus y analizó los datos. D.A.S. realizó análisis bioinformático y K.G. realizado C. crescentus experimentos bajo la supervisión de M.T.L. T.M.W. diseñó y realizó los experimentos de hibridación de oligonucleótidos. A.D. contribuyó a experimentos en L. rhamnosus. H.K., V.V. y S.W. contribuido a los experimentos bacterianos. G.T.F. escribió el manuscrito con aportes de todos los demás autores. G.T.F. y F.B.P. generó las cifras. S.L.S. y J.A. supervisión proporcionada. G.M.C. supervisó el estudio.

Autores correspondientes


Métodos de detección de proteínas y ácidos nucleicos de fagos

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método simple y robusto para verificar la presencia de fagos más rápido que los ensayos de placa, basado en la detección de ácido nucleico. Al aplicar la PCR de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), también es posible discriminar entre diferentes linajes de fagos en cuestión de horas, sin necesidad de secuenciar el genoma completo (Guti & # x00E9rrez et al., 2011). Sin embargo, sin un gen distintivo presente de forma ubicua en los fagos (como el gen ARNr 16S en las bacterias), es engorroso diseñar cebadores que se dirijan a toda la diversidad de fagos. Otro inconveniente importante de la PCR es que los resultados no son cuantificables, porque la reacción tiene características de punto final. Sin embargo, con los avances en el campo, se desarrolló la PCR cuantitativa (qPCR). De manera análoga, el campo de la detección de proteínas también avanzó a un ritmo rápido. El método de cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS-MS) se puede utilizar para detectar y enumerar con precisión péptidos de una muestra desconocida.

PCR cuantitativa (qPCR)

El descubrimiento de colorantes fluorescentes intercalados (como el verde SYBR introducido en 1994) permitió medir la cantidad de producto de ADN polimerizado después de cada ciclo de PCR (Jin et al., 1994). La fluorescencia se registra mediante termocicladores adecuados, capaces de amplificar el ácido nucleico y detectar la fluorescencia en un solo paso. Los estándares se pueden utilizar como referencia al calcular la concentración inicial de ADN (Mackay et al., 2002). Hay dos químicas básicas que se utilizan en las plataformas qPCR. El primero se basa en la intercalación de colorantes de ADN fluorescentes, mientras que el segundo funciona con una sonda, un fragmento de ADN corto adicional con un colorante fluorescente y una molécula extintora unida a él. El uso de colorantes intercalados es menos selectivo para la cuantificación de ADN bicatenario, mientras que el uso de sondas marcadas con fluorescencia es más preciso, ya que la señal solo se produce después de la hibridación exitosa de los tres fragmentos de ADN (cebador directo, cebador inverso y sonda) y polimerización posterior. (Mackay et al., 2002). Ambos métodos se han utilizado ampliamente en biología de fagos. Se seleccionó qPCR para cuantificar los bacteriófagos M13 y T7 utilizando las químicas SYBR green y TaqMan en diferentes genes de ambos fagos (Peng et al., 2018). Los autores informaron un mayor número de partículas de fagos en comparación con los recuentos de PFU determinados por DLA para ambos métodos, siendo el verde SYBR el más alto. Sugirieron que la presencia de partículas similares a virus no infecciosos podría causar esta discrepancia. El tratamiento con ADNasa en los fagos intactos pudo disminuir la señal, pero la diferencia aún era relativamente alta (Peng et al., 2018). La qPCR también se usó para medir partículas de fagos en suero humano o de ratón que contenía anticuerpos anti-T4 e incluso de superficies plásticas tratadas con proteinasa K (K & # x0142opot et al., 2017). Dado que los fagos no eran infecciosos después de ser neutralizados por los anticuerpos en el suero, no pudieron ser cuantificados por DLA. Esto resalta la sensibilidad de qPCR, pero también sus límites, al no poder distinguir entre partículas virales infecciosas y defectuosas.

Otros intentaron reducir la discrepancia entre DLA y qPCR tratando la muestra para PCR con propidio monoazida (PMA). La PMA puede ingresar a las células bacterianas comprometidas, donde reticula el ADN y evita que la polimerasa tenga acceso. Sin embargo, el tratamiento con PMA disminuyó la señal de qPCR del bacteriófago T4 solo después de la interrupción completa de las cápsides virales con tratamiento térmico a 110 ° C, lo que demuestra que la PMA sola no se puede utilizar para discriminar entre fagos infecciosos y defectuosos (Fittipaldi et al., 2010). Otros compararon DLA, qPCR y ensayo de nanopartículas basado en láser (NanoSight & # x2013 discutido en sección & # x201CMétodos que detectan partículas de fagos completos & # x201D) utilizando tres fagos diferentes que infectan a diversos huéspedes bacterianos (Anderson et al., 2011). Sorprendentemente, los resultados dependieron del fago investigado y su concentración. Cuando se comparó con DLA, un fago estaba sobrerrepresentado, un segundo estaba infrarrepresentado, mientras que el tercero mostró resultados mixtos por qPCR, pero no se pudo descartar la contaminación de la última preparación de fagos o la mezcla de PCR. Sin embargo, los autores propusieron un factor de corrección que podría aplicarse para traducir los resultados de qPCR en recuentos de fagos viables (Anderson et al., 2011). Finalmente, también es posible cuantificar los fagos de ARN usando qPCR, ya que el ARN se puede transcribir de forma inversa a ADNc y amplificar en un solo paso, lo que reduce el tiempo de manipulación. Se ha empleado la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) para detectar y enumerar el fago MS2 (Farkas et al., 2015).

PCR digital de gotas (ddPCR)

En la PCR digital de gotas (ddPCR), la muestra se mezcla con una sustancia hidrófoba para crear una emulsión de agua y aceite y la reacción se lleva a cabo en cada gota simultáneamente. La mezcla se pasa a través de un detector de fluorescencia para enumerar el número de gotitas en las que se produjo la amplificación sobre el número total de gotitas. Esto es proporcional a la cantidad de ADN molde en la muestra, por lo que se puede usar para calcular la concentración inicial sin necesidad de estándares externos (Kim et al., 2014). Uso de ddPCR para cuantificar el patógeno vegetal Pseudomonas syringae y dos fagos que infectan esta bacteria, se detecta un número mayor (20 a 30 veces mayor) de fagos en comparación con DLA. La variación podría reducirse de 3 a 4 veces más con el tratamiento con DNasa antes de interrumpir las cápsides virales, pero sigue siendo una diferencia considerable (Morella et al., 2018).

Espectrometría de masas

Wang y col. (2019) propuso la espectrometría de masas para enumerar el fago M13 a través de un péptido corto y uno grande derivado de la proteína de cubierta pVIII. Los autores argumentaron a favor de la utilidad de este enfoque, sin embargo, es necesario determinar el número de copias de la proteína antes de sacar conclusiones con respecto a la concentración. Los mutantes que tienen una estructura de cápside diferente podrían tener un efecto distorsionador en los resultados (Banu et al., 2014 Wang et al., 2019) y el método no se ha aplicado hasta ahora en muestras mixtas.

Secuenciación de próxima generación

La secuenciación del genoma completo (WGS) permite secuenciar y ensamblar genomas de fagos completos mediante análisis bioinformático, sin aislamiento previo. Las tecnologías de secuenciación de Illumina se utilizan con frecuencia para identificar nuevos fagos y también para detectar virus de varios hábitats, pero no están optimizadas para la enumeración. Sin embargo, es posible que se extraiga cierta información sobre la abundancia del número de contigs ensamblados, lo que proporciona datos semicuantitativos. Otras limitaciones se deben a la pérdida de datos durante el ensamblaje de contigs, lo que conduce a una subestimación del número de fagos en la muestra. Además, el arrastre del ADN bacteriano del huésped, la falta de bases de datos con genomas de fagos de referencia (Hatfull, 2008) y la naturaleza en mosaico de los genomas de fagos hacen que la WGS viral sea un desafío como método de enumeración y detección, a menos que la secuencia se conozca de antemano (Dorscht et al. ., 2009). Recientemente, los enfoques de secuenciación de una sola molécula (PacBio y Oxford Nanopore) con lecturas que abarcan todo el genoma del fago se han vuelto más disponibles (Klumpp et al., 2012). Oxford Nanopore ofrece máquinas compactas de alto rendimiento y un tiempo de ejecución rápido que pueden hacer de este método la opción estándar tanto para la secuenciación de un solo fago purificado como para la enumeración y detección de fagos. Se utilizó MinION TM, un secuenciador portátil de Oxford Nanopore para detectar fagos de ARN (MS2) y ADN (PhiX174) de muestras de agua. Ambos fagos se detectaron con éxito incluso a concentraciones bajas, 155 PFU / mL y 1 a 2 PFU / mL para MS2 y PhiX174, respectivamente. Los autores explicaron la diferencia en el umbral de detección con la disparidad en la tasa de recuperación entre los dos bacteriófagos, ya que el ARN es más propenso a la degradación del ácido nucleico (Ji et al., 2020).


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MÉTODOS

Se realizó una búsqueda bibliográfica utilizando Medline (Biblioteca Nacional de Medicina, Bethesda, Maryland años 1966-2013) y Embase (Elsevier, Amsterdam, Países Bajos años 1950-2013). Las palabras clave utilizadas fueron bacteriófago, lisina, bacterias multirresistentes, biopelícula, tratamiento, prevención, profilaxis. La búsqueda se limitó a publicaciones en inglés. Dadas las limitaciones de palabras y referencias de este artículo general, solo se incluyó una selección de la literatura revisada.


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