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5.2: Espectrofotometría - Biología

5.2: Espectrofotometría - Biología



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El ojo humano responde a la radiación electromagnética dentro de un rango de longitudes de onda entre 400-750 nm (es decir, el "espectro visible"). Las muestras de luz que contienen un espectro continuo de todas las longitudes de onda entre 400 y 750 nm serán percibidas por el cerebro como "luz blanca" (p. Ej., La luz que comprende una longitud de onda específica dentro de este rango es percibida por el cerebro como "coloreada":

  • ~ 400 nm = "violeta"
  • ~ 450nm = "azul"
  • ~ 500 nm = "verde"
  • ~ 550 nm = "amarillo"
  • ~ 600 nm = "naranja"
  • ~ 700nm = "rojo"

A menudo, los objetos aparecen coloreados debido a su absorción de luz dentro de regiones selectivas del espectro visible. La luz de tales objetos que incide en nuestros ojos (cuyo color percibimos) se compone de esas longitudes de onda que el objeto NO absorber.

Por ejemplo, las hojas de las plantas contienen dos pigmentos fotosintéticos: clorofila A y clorofila B. La molécula de clorofila A tiene la capacidad de absorber luz con una longitud de onda en el rango de 430 y 660 nm; la molécula de clorofila B absorbe luz con una longitud de onda en el rango de 450 y 640 nm. Por lo tanto, estos dos pigmentos en las hojas absorben longitudes de onda de luz violeta / azul y naranja / roja (la energía que representan estos fotones se transfiere a las moléculas de clorofila). La luz con longitudes de onda en el rango de 500-600 nm no es absorbida por ninguna molécula. Por lo tanto, después de que la luz del sol interactúa con las hojas, las longitudes de onda que quedan (y que nuestro ojo puede percibir) son de color verde amarillento. Por lo tanto, las plantas son "verdes" porque no absorben la luz verde.


  • ¿Cómo se vería un objeto si contuviera un pigmento que absorbiera todas las longitudes de onda de 400 a 750 nm? Sería "negro"
  • Esta es la misma situación que estar en una habitación cerrada con las luces apagadas. Sin luz no hay color.

Si tuviéramos una muestra de jugo de hojas que contenga clorofila A y B, podríamos cuantificar la concentración de clorofila por la cantidad de luz violeta / azul y naranja / roja que absorbió. NO PODEMOS cuantificarlo por la cantidad de luz verde transmitida (sería esencialmente la misma cantidad independientemente de la cantidad de clorofila:

Figura 5.1.1: Transmisión de luz de clorofila

Aunque la muestra es "más verde" con concentraciones más altas de clorofila, esto es no debido a un aumento en la intensidad de la longitud de onda verde de la luz; es debido a un reducción en las longitudes de onda de luz violeta / azul y naranja / roja. Es esto reducción que podemos usar para cuantificar la concentración de clorofila. Aunque la muestra parece verde, no podemos cuantificarla controlando la longitud de onda verde de la luz.

Luz, Energía y Estructura Molecular

La luz es algo extraño, es una forma radiativa de transferencia de energía, y para comprender sus propiedades debemos considerar que tiene propiedades tanto de onda como de partícula. Las diferentes longitudes de onda de la luz difieren en la energía que transportan; la energía es directamente proporcional a la frecuencia de la luz (cuanto mayor es la frecuencia, mayor es la energía):

E α n

La unidad de energía es la ergio (1 julio = 107ergios) y la unidad de frecuencia es Hertz (es decir, ciclos por segundo, o solo unidades de seg.-1). La constante de proporcionalidad es la constante de Planck, h, con un valor y unidades de 6,6 x 10-27 erg seg

E = hnorte

erg = (erg seg) (seg-1)

La frecuencia (n) de la luz es inversamente proporcional a la longitud de onda (l):

n α 1 / λ

La frecuencia tiene unidades de seg.-1 y la longitud de onda tiene unidades de metros. La constante de proporcionalidad es C (la velocidad de la luz) con un valor y unidades de 3 x 108m / seg:

n = c (1 / λ) = c / λ

Esta relación es verdadera en el vacío; sin embargo, los materiales "ópticamente densos" pueden reducir la velocidad de la luz, lo que requiere la siguiente corrección a la ecuación anterior:

norte = c /nortel

dónde norte es el "índice de refracción" del material y tiene un valor> 1

por lo tanto, el la energía de la luz es inversamente proporcional a la longitud de onda:

E = (hC)/(nortel)

El "fotón" es una descripción corpuscular (partícula) de la luz que es el portador de los "cuantos" de energía definidos en la ecuación anterior. Cuando la luz es absorbida por una molécula, transfiere sus cuantos de energía y el fotón deja de existir. ¿A dónde se fue la energía?

  • los enlaces atómicos, estructura química y electrones de una molécula dada tienen específico estados excitados y modos vibracionales.
  • Estos estados excitados y modos vibratorios tienen niveles de energía definidos por encima del estado fundamental.
  • La molécula puede cambiar del estado fundamental a un estado excitado (o modo vibratorio) al absorber un cuantos de energía exactamente igual a la diferencia entre los estados fundamental y excitado.
  • Por lo tanto, las moléculas pueden absorber la energía asociada con longitudes de onda de luz específicas y la luz se consume en el proceso..

Figura 5.1.2: Escala de luz

Los enlaces atómicos, la estructura química y electrónica de las moléculas son propiedades únicas y difieren de un tipo de molécula a otro.

  • Por lo tanto, la Las diferencias energéticas entre el suelo y los estados excitados difieren de un tipo de molécula a otro.
  • Por tanto, la capacidad de interactuar y absorber la luz, y las longitudes de onda específicas de la luz absorbida difieren de un tipo de molécula a otro

El patrón de absorción característico de las diferentes longitudes de onda de la luz es único para cada tipo de molécula y es un tipo de "huella digital" molecular que se puede utilizar para identificar y cuantificar moléculas

En el ejemplo de clorofila anterior, la intensidad de la luz que atraviesa la muestra se denomina "luz transmitancia"de la muestra:

Figura 5.1.3: Transmitancia de luz de la clorofila

  • La transmitancia es un número adimensional que varía de 1 (transmitancia total) a 0 (sin transmitancia - absorción completa)

Es importante tenga en cuenta la distinción entre transmitancia y absorción: son inversamente proporcional

  • Una muestra con alta absorbancia tiene una baja transmisión de luz.

Figura 5.1.4: Absorción de clorofila

¿Cómo se cuantifican la transmitancia (T) y la absorción (A)?

  • La intensidad de la luz que incide sobre una muestra se denomina luz incidente, I0
  • La intensidad de la luz medida después de pasar a través de una muestra es la luz transmitida, I
  • La transmitancia, T, se define como la relación I / I0 y variará entre 0 y 1:

Figura 5.1.5: Transmitancia

¿Cómo se ve afectada la transmitancia por la concentración de la muestra y el tamaño físico (es decir, la longitud del camino)?

  • Si la transmitancia se reduce debido a la absorción de la muestra, entonces cuanto mayor sea la concentración (C), menor será la transmitancia. En otras palabras, la transmitancia es inversamente proporcional a la concentración: (Ley de cerveza)

T α 1 /C

  • Del mismo modo, cuanto más gruesa es la muestra (es decir, mayor es la longitud de la trayectoria de la luz a través de la muestra), menor será la transmitancia. Por lo tanto, la transmitancia también es inversamente proporcional a la longitud del camino (l): (Ley de lambert)

T α 1 /l

Por lo tanto, esperamos que la ecuación que relaciona T con C y l para tomar la forma general de:

T α 1 /cl

La transmitancia resulta disminución exponencialmente con aumentos en la concentración y la longitud del camino, por lo tanto, la ecuación tiene la forma:

logT α 1 /cl

-logT α cl

La constante de proporcionalidad es el coeficiente de extinción. mi:

-logT = εcl

Dado que los valores logarítmicos son adimensionales, las unidades de e parecerían ser concentración inversa y distancia inversa (por ejemplo, M-1cm-1)

El término -logT de la izquierda se puede escribir como log (1 / T) e identifica el inverso relación entre la transmitancia T y la ecl término. Dado que la absorbancia y la transmitancia están inversamente relacionadas, los micl término parecería ser una definición conveniente para la absorbancia (A):

log (1 / T) = ε cl = A
(la ley de Beer-Lambert)

Valores para ε y l

  • Longitud de la trayectoria l suele estar en unidades de cm
  • Coeficiente de extinción molar ε tiene unidades de M-1 cm-1 y es una constante de proporcionalidad que relaciona la absorción de molar soluciones
  • Coeficiente de extinción masiva ε 1% se refiere a la absorbancia de una solución al 1% en masa. Normalmente, esto se refiere a una solución acuosa que podemos considerar que tiene una densidad de 1000 g / L. Por tanto, una solución acuosa al 1% en masa se referiría a la disolución de 10 g / L, o una 10 mg / ml solución de la molécula de interés.
  • Dado que la absorbancia de una molécula es función de la longitud de onda (es decir, la absorción no es igual para todas las longitudes de onda), el coeficiente de extinción también debe hacer referencia a una longitud de onda. Esto generalmente se hace usando un subíndice:

ε 1%280 nm = 14,5 g-1 L cm-1

· En este caso una solución de 10 mg / ml de la molécula tendrá una lectura de absorbancia de 14,5 (unidades adimensionales) a l = 280 nm (es posible que no se conozca la absorción en otras longitudes de onda). Las unidades de concentración son g / L, por lo que e tendrá dimensiones de g-1 L cm-1.

La relación entre cambios en A, T y c

· La relación directa entre A y c significa que hay una Relación lineal entre absorbancia y concentración.. Si duplica la concentración, la absorbancia se duplicará, etc.

· Los registro inverso La relación entre transmitancia y absorbancia se puede establecer como:

T = 1/10A

  • Una duplicación de la concentración por lo tanto resultará en una reducción de 10 veces en la transmitancia. Instrumentación para medidas de absorbancia (espectrofotómetros) Realmente medir la transmitanciay, naturalmente, se vuelven menos precisos a valores bajos de transmitancia. Por lo tanto, Cuanto mayor sea la lectura de absorbancia, menos precisa será. La mayoría de estos instrumentos son inexactos en lecturas de absorbancia> 1,5 (esto resulta ser a una transmitancia <3% de la transmitancia total)

Diseño de espectrofotómetros

Los espectrofotómetros son instrumentos de precisión, sin embargo, conceptualmente involucran un número relativamente pequeño de partes. Un diseño simple se vería así:

Figura 5.1.6: Espectrofotómetro

  • Se usa una lámpara de tungsteno para producir longitudes de onda de luz que abarcan el rango visible, mientras que una lámpara de deuterio se usa para producir luz que abarca el rango ultravioleta.
  • El prisma móvil o la rejilla de difracción se ajusta para dirigir la longitud de onda de interés hacia la muestra.
  • Este es un espectrofotómetro de "haz único" y los datos de referencia y de muestra se recopilan por separado (la muestra de referencia se usa para determinar el valor máximo de transmisión (efectivamente I0)

Una modificación de este diseño, un espectrofotómetro de "haz doble", puede permitir la medición simultánea de I e I0:

Figura 5.1.7: Espectrómetro de doble haz

Los detectores de haz simple y doble permiten al investigador controlar las propiedades de absorbancia durante un longitud de onda única de luz (la longitud de onda seleccionada por los ajustes de prisma / rendija. Una modificación que incorpora un matriz de detectores puede permitir la medición simultánea de un espectro de longitudes de onda:

Figura 5.1.8: Medición simultánea de un espectro

Espectros de absorbancia de moléculas biológicas.

Proteinas

Las proteínas no se absorben en la longitud de onda visible a menos que tengan un grupo protésico (p. Ej., Fe2+) o un aminoácido no natural. Sin embargo, los aminoácidos triptófano, tirosina y cisteína absorben la luz en la longitud de onda UV:

Figura 5.1.9: Absorción de triptófano

  • El triptófano tiene un pico de absorción a 280 nm en el rango UV
  • Esta es una longitud de onda útil para cuantificar la absorción de triptófano.
  • Dado que la absorción es proporcional a la concentración, esta es una forma útil de cuantificar la concentración de proteínas (para proteínas que contienen Trp)

Ácidos nucleicos

Los anillos aromáticos en las bases de los ácidos nucleicos también absorben en el rango UV:

Figura 5.1.10: Absorción de ácidos nucleicos

  • Cada base de ADN y ARN tiene un espectro de absorción ligeramente diferente.
  • 260 o 280 nm es una longitud de onda típicamente útil para controlar la concentración de ácidos nucleicos

Tenga en cuenta que las muestras de ácidos nucleicos y proteínas pueden absorberse a 280 nm, por lo tanto, las muestras de moléculas biológicas deben ser puro para cuantificar mediante espectroscopia de absorción UV.


Biología REA

Crédito: Carga inductiva, NASA (CC-BY-SA 3.0) La luz es un tipo de energía que viaja como una onda-partícula. longitud de onda de luz son las distancias entre los picos de las ondas a medida que viaja la luz. Las longitudes de onda se miden en nanómetros (nm) y diferentes longitudes de onda de luz representan colores diferentes. La luz blanca es una mezcla de la luz visible. espectro . La luz de longitudes de onda largas (infrarrojos) y longitudes de onda muy cortas (ultravioleta) es invisible para los humanos, pero puede ser observada por otros organismos. A medida que disminuye la longitud de onda, aumenta la energía de la luz.

La difracción de la luz a través de un prisma expone las longitudes de onda de los componentes de la luz.


Experimentos

A continuación, se muestran los experimentos que nuestros especialistas en ciencias han seleccionado para respaldar el tema del IB *.

Evolución de la celobiasa en hongos

En esta actividad preliminar, (1) producirá un extracto de hongo botón, (2) reaccionará este extracto que contiene celobiasa con el sustrato, (3) recolectará muestras después de 1, 2, 3, 4 y 6 minutos de reacción, (4 ) utilizar un espectrofotómetro para medir las absorbancias de las muestras coloreadas, (5) trazar un gráfico de absorbancia vs. tiempo, y (6) use el gráfico para determinar la velocidad de la reacción catalizada por celobiasa.

Después de completar la Actividad preliminar, primero utilizará las fuentes de referencia para obtener más información sobre los hongos, la actividad de la celobiasa y la evolución y ecología de las setas antes de elegir e investigar una cuestión de investigación relacionada con la celobiasa y la evolución de las setas. Algunos temas a considerar en su búsqueda de referencias son:

  • celulosa
  • celobiosa
  • celobiase
  • basidomycota
  • ascomycota
  • micorriza
  • ecología
  • evolución

Evolución de la levadura

En esta actividad preliminar, utilizará un CO2 Sensor de gas para determinar la tasa de respiración de glucosa por levadura panadera y # 8217s.

Después de completar la Actividad preliminar, primero utilizará fuentes de referencia para obtener más información sobre las cepas de levadura que se utilizan para hornear y preparar cerveza antes de elegir e investigar una pregunta de investigación relacionada con la evolución de la levadura a través de la selección artificial. Algunos temas a considerar en su búsqueda de referencias son:

  • Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces bayans
  • levadura de cerveza
  • levadura de vino
  • seleccion artificial
  • evolución
  • horneando
  • monosacáridos
  • disacáridos
  • metabolismo

* El Programa del Diploma del IB es un programa oficial de la Organización del Bachillerato Internacional (IBO) que autoriza a los colegios a ofrecerlo. El material disponible aquí ha sido desarrollado independientemente del IBO y no está respaldado por este.

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de proteínas

Esta unidad describe métodos espectrofotométricos y colorimétricos para medir la concentración de una muestra de proteína en solución. Absorbancia medida a 280 nm (A280) se utiliza para calcular la concentración de proteína en comparación con una curva estándar o valores de absortividad publicados para esa proteína (a280). Alternativamente, la absorbancia medida a 205 nm (A205) se utiliza para calcular la concentración de proteínas. los A280 y A205 Se pueden usar métodos para cuantificar la proteína total en lisados ​​brutos y proteína purificada o parcialmente purificada. Se puede utilizar un espectrofluorómetro o un fluorómetro de filtro para medir la emisión de fluorescencia intrínseca de una solución de muestra. Este valor se compara con las emisiones de las soluciones estándar para determinar la concentración de la muestra. El método de emisión de fluorescencia se utiliza para cuantificar la proteína purificada. Este método simple es útil para diluir muestras de proteínas y se puede completar en poco tiempo. Hay dos métodos colorimétricos: el método colorimétrico de Bradford, basado en la unión del colorante azul brillante de Coomassie a la proteína de interés, y el método Lowry, que mide la reacción colorimétrica de los residuos de tirosilo en la muestra de proteína.


Consulte las Hojas de datos de seguridad (SDS) para conocer los peligros y las precauciones de manipulación adecuadas.

7.3 Procedimientos operativos relacionados

7.4.1 Tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5,0 a 37 ºC

7.4.1.1 Prepare 200 ml en agua desionizada utilizando 1,36 g de acetato de sodio, trihidrato, Prod. No. S8625. Ajustar a pH 5,0 a 37 ºC con HCl 1N, Prod. No. H3162.

7.4.2 Solución Sigmacell al 5% (p / v) (Sigmacell)

7.4.2.1 Prepare 100 ml en tampón de acetato de sodio 50 mM usando 5 g de Sigmacell Microcrystalline Type 20, Prod. No. S3504. Mezclar y calentar suavemente para hacer una suspensión uniforme.

7.4.3 Vial de determinación de glucosa (HK)

7.4.3.1 Utilice reactivo de ensayo de glucosa (HK), Prod. No. G3293. Disuelva el contenido según las instrucciones de la etiqueta.

7.4.4 Solución de enzima de celulasa (celulasa)

7.4.4.1 Inmediatamente antes de su uso, prepare una solución que contenga 2-6 unidades / ml de celulasa en agua desionizada fría.

7.5.1 Pipetee (en mililitros) lo siguiente en tubos de cultivo de vidrio de borosilicato desechables:

7.5.1.3 Mezcle inmediatamente tanto la Prueba como el Blanco agitando. Con un baño de agitación, incube tanto la prueba como el blanco a 37 ºC durante exactamente 120 minutos con agitación moderada.

7.5.1.4 Transfiera inmediatamente la prueba y el blanco a un baño de hielo. Deje reposar cada uno hasta que las suspensiones se hayan asentado. Centrifugar a aproximadamente 4000 rpm durante aproximadamente 2 minutos para aclarar. Utilice el sobrenadante en el paso 7.5.2.2.

7.5.2 Pipetee (en mililitros) lo siguiente en cubetas adecuadas:

7.5.2.1 Equilibrar a 25 ºC. Monitorear el A340 nm hasta constante, utilizando un espectrofotómetro debidamente termostatizado. Registre la inicial A340 nm tanto para la prueba como para el blanco.

7.5.2.3 Mezclar inmediatamente por inversión y registrar el aumento de A340 nm hasta que esté completo (durante aproximadamente 5 minutos). Obtén la A final340 nm tanto para la prueba como para el blanco.

7.6.1 ΔA340 nm Prueba = A340 nm Prueba final - A340 nm Prueba inicial

7.6.2 ΔA340 nm En blanco = A340 nm Final en blanco - A340 nm Inicial en blanco

(ΔA340 nm Prueba - ΔA340 nm En blanco) (3.1) (5) (DF)

7.6.3.1 3.1 = Volumen final (en mililitros) del paso 7.5.2

7.6.3.2 5 = Volumen total (en mililitros) de la mezcla de reacción del paso 7.5.1

7.6.3.4 6.22 = Coeficiente de extinción milimolar de β-NADH a 340 nm

7.6.3.5 2 = Factor de conversión de 2 horas a 1 hora según la Definición de unidad

7.6.3.6 1 = Volumen (en mililitros) de celulasa usado en el paso 7.5.1

7.6.3.7 0.1 = Volumen (en mililitros) del paso 7.5.1 usado en el paso 7.5.2


Ver el vídeo: Ciclo de la Urea (Agosto 2022).