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28.2: Regulación de la expresión génica en bacterias - Biología

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28.2: Regulación de la expresión génica en bacterias

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Ciencias

Vol 371, número 6531
19 de febrero de 2021

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Por Anna Kuchina, Leandra M. Brettner, Luana Paleologu, Charles M. Roco, Alexander B. Rosenberg, Alberto Carignano, Ryan Kibler, Matthew Hirano, R. William DePaolo, Georg Seelig

La secuenciación unicelular MicroSPLiT identifica patrones transcripcionales bacterianos raros.


Abstracto

El sistema renina-angiotensina juega un papel importante en la regulación de la presión arterial y la homeostasis de electrolitos en mamíferos. En este estudio, sometimos ratones transgénicos que contienen una construcción genómica de renina humana a una variedad de manipulaciones farmacológicas y fisiológicas para probar si la expresión del gen de la renina humana y la liberación de renina humana activa está regulada adecuadamente en este modelo. Estas manipulaciones se diseñaron para probar los principales reguladores de la liberación de renina, incluida la angiotensina II, la mácula densa, la presión de perfusión renal y los receptores β-adrenérgicos. Usamos la concentración de renina plasmática humana y los niveles de ARNm de renina renal humana para documentar la respuesta del transgén a estos estímulos. La concentración de renina plasmática humana aumentó en respuesta a la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina con captopril e isoproterenol y disminuyó después de una dieta rica en sal. Una dieta baja en sal o deficiente en sodio no estimuló la liberación de renina. Los niveles de ARNm de renina humana en el riñón aumentaron después del captopril, pero no cambiaron en los otros grupos experimentales. También medimos los niveles de ARNm de renina humana en ratones transgénicos dobles que contienen el mismo gen de renina humana además del gen del angiotensinógeno humano. Estos ratones son hipertensos crónicamente y tienen niveles circulantes aumentados de angiotensina II. Los niveles de ARNm de renina humana en el riñón estaban paradójicamente elevados en comparación con sus homólogos normotensos transgénicos únicos. Estos ratones transgénicos proporcionan un modelo para el examen de la regulación de la renina humana y pueden ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que regulan el gen en respuesta a señales fisiológicas.

El sistema renina-angiotensina juega un papel integral en la regulación de la PA y la homeostasis de electrolitos en mamíferos. También se ha planteado la hipótesis de que ayuda en la regulación de los flujos sanguíneos de órganos y tejidos locales de una manera autocrina / paracrina y desempeña un papel en el desarrollo renal. Los genes del sistema renina-angiotensina también se han vinculado o asociado con la hipertensión en varios modelos animales y en humanos. 1 2 La renina, una aspartil proteasa, inicia una serie de reacciones proteolíticas que conducen a la producción de Ang II, el péptido biológicamente activo del sistema. Aunque la regulación de la expresión de renina en roedores está bien caracterizada, hasta hace poco tiempo, las respuestas fisiológicas que controlan la regulación del gen hRen han quedado sin explorar en gran medida debido a la falta de tejidos humanos y líneas celulares adecuadas. Las transfecciones estables de líneas celulares existentes que no expresan renina con una construcción del gen hRen han proporcionado información sobre el procesamiento intracelular y la secreción de renina, 3 pero dado que estas células no secretan renina producida endógenamente, no se puede afirmar con certeza si estas células contienen todas las factores necesarios para regular correctamente la expresión del gen de la renina. La descripción reciente de una línea celular de carcinoma pulmonar humano, Calu-6, que secreta renina de forma endógena puede proporcionar un sistema para el estudio de la regulación del gen de la renina en un entorno de cultivo celular. 4 No obstante, un sistema in vivo proporcionaría un modelo más ideal para el estudio de la regulación del gen de la renina, y la creación de animales transgénicos que contienen el gen hRen ha proporcionado estos modelos. En modelos de ratón transgénico y de rata transgénica, se ha demostrado que la expresión de ARNm de hRen es adecuadamente específica de tejido y específica de célula. 5 6 7 8 Además, se ha examinado la regulación fisiológica inicial, como la respuesta a la depleción de sodio 9 o la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina, 5 10 pero no se ha realizado una investigación extensa de la regulación génica en animales transgénicos. La expresión del gen de la renina y la secreción de proteínas, por ejemplo, están reguladas negativamente por el circuito de retroalimentación de Ang II, los aumentos de la presión de perfusión renal, la presión arterial sistémica y el sodio plasmático detectado por la mácula densa. 11 Por otro lado, la expresión y secreción del gen de la renina aumentan con el aumento de la actividad del nervio renal, la disminución del sodio plasmático y la activación de los receptores β-adrenérgicos. Además, si vamos a utilizar modelos transgénicos para ampliar nuestra comprensión de la regulación de la expresión del gen de la renina y la genética de la hipertensión, se vuelve de vital importancia determinar si los transgenes responden a estímulos fisiológicos y farmacológicos conocidos. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue examinar la regulación del ARNm de hRen y la secreción activa de hRen en respuesta a una variedad de estímulos fisiológicos y farmacológicos en ratones transgénicos que contienen el gen hRen solo o en ratones hipertensos transgénicos dobles que contienen tanto hRen como hAng. genes.

Métodos

Creación de ratones transgénicos, cuidado de ratones y cría de animales

Se generaron y caracterizaron ratones transgénicos tanto hRen como hAng como se describió previamente. 5 12 Se crearon ratones transgénicos dobles mediante la reproducción de ratones transgénicos hRen heterocigotos con ratones transgénicos hAng heterocigotos. 13 El veinticinco por ciento de la descendencia era doblemente transgénica. La línea transgénica hRen 9 y la línea transgénica hAng 204/1 se utilizaron en la generación de ratones transgénicos dobles. Los ratones transgénicos positivos se diferenciaron de los compañeros de camada no transgénicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa de ADN genómico purificado de muestras de biopsia de cola utilizando cebadores hRen y hAng específicos de especie como se describió anteriormente. 5 12

Todos los ratones fueron alimentados con pienso estándar para ratones y agua ad libitum a menos que el protocolo experimental indique lo contrario. El cuidado del ratón cumplió o excedió los estándares establecidos por los Institutos Nacionales de Salud en el Directrices para el cuidado y uso de animales experimentales. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de la Universidad de Iowa.

Los ratones fueron asesinados por CO2 asfixia. Se obtuvieron aproximadamente 0.5 mL de sangre fresca de la aorta y se colocaron en tubos refrigerados que contenían 2.5 μL de 0.5 mol / L EDTA. La muestra se centrifugó inmediatamente en una centrífuga preenfriada a 14 000 rpm durante 5 minutos y se obtuvo una muestra de plasma de 150 μL y se congeló inmediatamente a -80 ° C hasta el radioinmunoensayo. Las muestras de riñón se obtuvieron inmediatamente después de la muerte, se congelaron instantáneamente en hielo seco y se almacenaron a -80 ° C. Toda la grasa perirrenal y el tejido capsular se extrajeron antes de la congelación.

Protocolos experimentales

Los ratones transgénicos y los compañeros de camada de control no transgénicos se colocaron en los siguientes grupos de protocolos experimentales:

A. Sin tratamiento: los ratones de este grupo (n = 10 hRen línea 9, n = 17 hRen línea 10, n = 7 controles) recibieron comida para ratones estándar y agua ad libitum sin tratamientos o medidas adicionales antes de la muerte. La comida normal contenía 0,31% de sodio y 0,48% de cloruro (Teklad LM-485).

B. Tratamiento con captopril: se disolvió captopril en el agua de bebida (0,5 mg / ml) para dar aproximadamente 100 mg / kg por día de captopril. El tratamiento fue de 10 días (n = 5 hRen línea 10, n = 5 controles).

C. Tratamiento con captopril / bajo contenido de sal: se disolvió captopril en el agua de bebida para dar aproximadamente 100 mg / kg por día de captopril. 5 Además, los ratones fueron alimentados con una dieta baja en sal (Teklad No. 7034) que contenía 0,08% de sodio y 0,13% de cloruro. El tratamiento fue de 10 días (n = 9 hRen línea 9, n = 6 hRen línea 10, n = 6 controles).

D. Dieta baja en sal: los ratones recibieron una dieta baja en sal sola (Teklad No. 7034) durante 10 días (n = 5 hRen línea 9, n = 4 hRen línea 10, n = 3 controles). 9

E. Dieta alta en sal: los ratones recibieron una dieta alta en sal (Teklad No. 7033) que contenía 3,18% de sodio y 4,91% de cloruro durante 10 días (n = 4 hRen línea 9, n = 7 hRen línea 10, n = 4 controles).

F. Dieta sin sal: los ratones recibieron una dieta deficiente en sodio (Teklad TD 90228) que contenía 0,01% de sodio y 0,05% de cloruro durante 10 días (n = 6 hRen línea 10, n = 2 controles).

G. Dieta sin sal más furosemida: los ratones recibieron una dieta deficiente en sodio (Teklad TD 90228) durante 10 días y 20 mg / kg de furosemida IP los días 3, 5 y 10 de tratamiento (n = 8 hRen línea 10, n = 7 controles). 14 15

H. Isoproterenol: los ratones recibieron 250 μg / kg de isoproterenol SC 15 minutos antes de la muerte (n = 3 hRen línea 9, n = 6 hRen línea 10, n = 3 controles). dieciséis

I. Isoproterenol / propranolol: Los ratones recibieron 10 mg / kg de propranolol SC 5 minutos antes de 250 μg / kg de isoproterenol SC. Se sacrificaron 17 ratones 15 minutos después de la inyección de isoproterenol (n = 4 hRen línea 10, n = 2 controles).

J. Respuesta a la hipertensión crónica: Se sacrificaron ratones transgénicos dobles que contenían los transgenes hRen y hAng (hRen línea 9 × hAng línea 204/1, n = 8) junto con ratones de control hRen línea 9 (n = 8) y se estudiaron sus tejidos . Ambos grupos recibieron comida normal.

Ensayo de PRA

Realizamos ensayos de PRA y PRC con un kit de radioinmunoensayo RIANEN Ang I 125 I (DuPont) siguiendo las instrucciones y utilizando reactivos suministrados por el fabricante. El kit se diseñó para proporcionar un pH óptimo para la conversión de angiotensinógeno en Ang I y para inhibir las angiotensinasas. Trabajos previos en nuestro laboratorio demostraron que los niveles de Ang I se mantuvieron estables durante varias horas de incubación a 37 ° C, demostrando la ausencia de angiotensinasas en las muestras. 12 Todas las muestras se congelaron y descongelaron una vez. Para el ensayo, las muestras de plasma se descongelaron en un baño de hielo. Una vez descongelado, se añadieron al plasma 3 μL de dimercaprol, 3 μL de 8-hidroxiquinolina y 300 μL de tampón maleato (todos los reactivos se obtuvieron con el kit de radioinmunoensayo). A continuación, las muestras se dividieron en cuatro tubos. El tubo A se incubó a 4 ° C sin más aditivos. El tubo B se incubó a 4 ° C con la adición de 1 μg de hAng purificado (Scripps Laboratories). El tubo C se incubó a 37 ° C sin aditivos adicionales. El tubo D se incubó a 37 ° C con la adición de 1 μg de hAng. Las muestras se incubaron durante 1 hora y luego se realizó el radioinmunoensayo según el protocolo proporcionado por el fabricante. Las muestras se diluyeron apropiadamente con blanco de reactivo para que los resultados del radioinmunoensayo estuvieran en la porción lineal de la curva estándar. La cantidad de Ang I generada en cada muestra se obtuvo por comparación con una curva estándar generada cada vez que se realizó el ensayo. La mPRA se obtuvo restando la cantidad de Ang I generada por mililitro por hora en el tubo A (4 ° C más sin aditivos) de la del tubo C (37 ° C más sin aditivos). hPRC se obtuvo restando el mPRA (Tubo C-Tubo A) del valor obtenido restando la cantidad de Ang I generada por mililitro por hora en el tubo B (4 ° C más 1 μg de hAng) de la del tubo D (37 ° C más 1 μg hAng): hPRC = [(Tubo D − Tubo B) - (Tubo C − Tubo A)]. Las cantidades de Ang I generadas en las muestras a 4 ° C (tubos A y B) se encontraban habitualmente entre el 10% y el 15% de los valores de las muestras a 37 ° C. Esto refleja la actividad de la renina a 4 ° C o el nivel endógeno de Ang I en las muestras de plasma. Aunque sería preferible comparar mPRC con hPRC, en su lugar se midió mPRA por varias razones. En primer lugar, sería necesario utilizar plasma de ratón nefrectomizado como sustrato para la reacción. La nefrectomización de ratones es técnicamente difícil, pero se puede realizar. Sin embargo, numerosos estudios previos han demostrado que la nefrectomía en ratones aumenta la PRA y da como resultado la liberación de prorenina de varios sitios extrarrenales [18, 19]. No está claro si la presencia de prorenina en el plasma del sustrato alterará significativamente los resultados. Alternativamente, consideramos agregar plasma nefrectomizado de otra especie, como la rata, como fuente de angiotensinógeno, pero las diferencias relacionadas con las especies en la cinética de la reacción entre la renina y el angiotensinógeno fueron una gran preocupación. De hecho, se ha demostrado que el mRen tiene una mayor actividad catalítica para el angiotensinógeno de rata. 20 El uso de plasma de otra especie, como la oveja, no nos permitiría diferenciar mRen de hRen. Por lo tanto, se utilizó mPRA para mostrar la actividad generadora de Ang I del gen mRen endógeno.

Realizamos varios experimentos de control para validar nuestras mediciones de PRA y PRC. Primero, demostramos en un experimento de curso de tiempo prolongado que los niveles de Ang I aumentaron linealmente con el tiempo (hasta 6 horas). Esto fue cierto cuando se midieron las actividades de mRen y hRen. Estos resultados indican que estábamos trabajando con la velocidad inicial de la reacción renina-angiotensinógeno y que los sustratos de la reacción, angiotensinógeno de ratón y hAng, no estaban en cantidades limitantes (datos no mostrados). En segundo lugar, no hubo evidencia de producción adicional de Ang I en muestras de ratones transgénicos incubados en presencia de 1,0 o 5,0 µg de hAng purificado. En tercer lugar, para verificar que los resultados observados no fueran artefactos del proceso de recolección de sangre, demostramos que no hubo diferencia en mPRA y hPRC de muestras de plasma obtenidas por hemorragia orbital del ojo en ratones anestesiados en comparación con muestras de plasma obtenidas de la aorta en ratones sacrificados. . Tampoco hubo diferencia en los valores de mPRA y hPRC de muestras de plasma fresco o de plasma una vez congelado.

A los efectos de la definición, la PRA mide la actividad generadora de Ang I total en el plasma y depende de la concentración de renina y angiotensinógeno circulantes. PRC es una medida de la concentración de renina plasmática basada en la Ang I generada en presencia de un exceso de sustrato. La mPRA en estos experimentos proporcionó una medida de control crítica que nos permitió evaluar la magnitud de las respuestas para los tratamientos experimentales descritos.

Ensayo de protección de ARNasa

La expresión de ARNm de hRen y ratón. ren-1 c en el riñón se determinó con un ensayo de protección de ARNasa. Las sondas utilizadas fueron un cDNA de hRen parcial de las coordenadas 741 a 1148 clonado en pSL301 (Invitrogen), un ratón parcial ren-1 c ADNc de las coordenadas 178 a 657 clonado en pCRII (Invitrogen) y un ADNc de β-actina de ratón parcial obtenido del fabricante (Ambion). El ARN total se aisló de muestras de riñón mediante homogeneización en isotiocianato de guanidinio seguido de extracción en emulsión de fenol a pH 4,0 usando una modificación de un método descrito previamente. Se escalaron 10 homogeneizaciones hasta 2,5 ml para aumentar el rendimiento y la calidad del ARN. Se hibridaron muestras (10 µg) de ARN de riñón total con sondas de ARN antisentido marcadas de una sola hebra generadas por la ARN polimerasa de T3 con un kit Maxiscript (Ambion). La protección de la ARNasa fue la descrita por el fabricante. Los productos de protección se visualizaron mediante electroforesis a través de geles de secuenciación de poliacrilamida (5%) / urea (8 mol / L) que se fijaron y secaron para autorradiografía.

Análisis estadístico

El análisis de datos entre los diferentes grupos de tratamiento se realizó mediante ANOVA de una vía, comparando los grupos de tratamiento con el grupo de control no tratado. Los tratamientos individuales también se compararon por pares con el grupo de control con el uso de un t prueba (de estudiante). Consideramos un valor de PAG& lt.05 sea estadísticamente significativo. Todos los valores se expresan como media ± SE.

Resultados

Regulación de la liberación de hRen

Medimos mPRA y hPRC basales en dos líneas independientes de ratones transgénicos para descartar efectos de posición sobre la expresión del transgén (Fig. 1). La mPRA endógena fue similar en ambas líneas (14,2 ± 3,1 ng Ang I / ml por hora para la línea 9 y 8,6 ± 0,9 para la línea 10), y la mPRA no difirió significativamente entre los controles de compañeros de camada transgénicos y no transgénicos (14,2 ± 3,1 frente a 11,1 ± 1,9 , respectivamente, para la línea 9 y 8,6 ± 0,9 frente a 12,4 ± 5,5 para la línea 10). Los ratones transgénicos tenían hRen activo medible que no era significativamente diferente entre las dos líneas (10,9 ± 1,2 para la línea 9 frente a 11,6 ± 1,0 para la línea 10). Esencialmente, no se observó actividad de hRen en los compañeros de camada no transgénicos de ninguna línea. Estos resultados sugieren que se está liberando hRen activo en la circulación sistémica de estos ratones.

Examinamos la regulación de la liberación de hRen en ratones tratados y no tratados como se describe en "Métodos". Estos resultados se muestran para la línea 10 de hRen en la Figura 2 y se resumen junto con todos los datos de PRA en la Tabla. hRen PRC fue muy elevado en ratones transgénicos tratados con captopril solo y también en ratones alimentados con una dieta baja en sal combinada con captopril. Una dieta baja en sal por sí sola no elevó la hPRC. Los intentos posteriores de depleción de sodio alimentando a los ratones con una dieta sin sal o una dieta sin sal más furosemida no cambiaron la hPRC. Hubo una clara tendencia hacia una menor hPRC en ratones tratados con alto contenido de sal. El tratamiento con isoproterenol dio como resultado una elevación de hPRC que fue bloqueada por el pretratamiento de ratones con propranolol. Los cambios en hPRC en respuesta a los tratamientos experimentales en la línea 9 de hRen fueron en gran parte paralelos a los observados en la línea 10 de hRen (Tabla). Tampoco hubo diferencias significativas en mPRA en los grupos no tratados, captopril, captopril más bajo en sal, bajo en sal, sin sal más furosemida, alto en sal, isoproterenol y propranolol más isoproterenol cuando se compararon ratones transgénicos con controles no transgénicos. Se observó una diferencia pequeña pero significativa en la mPRA entre los ratones transgénicos y no transgénicos tratados sin sal (PAG& lt.05).

Regulación de la expresión de hRen en el riñón

Examinamos mediante la protección de ARNasa los niveles de ARNm de ARNm y ARNm en el riñón de ratones transgénicos y no transgénicos no tratados y tratados crónicamente (Fig. 3). El ARNm de hRen era claramente evidente en los ratones transgénicos, y no se observó expresión de hRen en los controles no transgénicos, lo que confirma que la sonda detectaba específicamente ARNm de hRen pero no mRen. El ARNm de ARNm fue evidente en las muestras transgénicas y no transgénicas cuando se utilizó una sonda de protección de ARNasa específica de ARNm de ARNm (Fig. 3). Los niveles de ARNm de hRen aumentaron significativamente en los ratones tratados con captopril, pero no se alteraron en los otros grupos de tratamiento, lo que coincide en gran medida con los datos de hPRC obtenidos de los ratones tratados crónicamente. Los niveles de ARNm de ARNm aumentaron de manera similar en los ratones tratados con captopril, pero no se alteraron en los otros grupos de tratamiento. No examinamos la expresión de hRen en el riñón en los grupos de tratamiento agudo (isoproterenol y propranolol) porque no esperábamos cambios en los niveles de ARNm de hRen en el corto período de tiempo (15 minutos) de los experimentos.Los niveles de ARNm de hRen renal fueron iguales en la línea 9 de hRen y en la línea 10 de hRen, y ambas líneas respondieron cuantitativamente por igual a los tratamientos experimentales (datos no mostrados).

Para evaluar la respuesta del ARNm de hRen a la PA elevada, generamos ratones transgénicos dobles que contienen los genes hRen y hAng. Estos ratones transgénicos dobles son crónicamente hipertensos (presión arterial media, 150,6 ± 5,0 mm Hg frente a 111,1 ± 5,6 en ratones hRen transgénicos simples) 13 y tienen niveles elevados de Ang II circulante (340 ± 58 frente a 99,8 ± 13,2 pg / ml). Tanto la presión arterial elevada como la Ang II circulante elevada deberían, en teoría, regular a la baja la síntesis y liberación de renina. Sin embargo, el ARNm de hRen en estado estacionario se incrementó significativamente en ratones transgénicos dobles en comparación con los controles transgénicos simples (Fig. 4). Curiosamente, los niveles de ARNm de mRen fueron regulados a la baja de manera apropiada por estos estímulos (Fig. 4).

Discusión

Regulación de la liberación de hRen y mRNA en respuesta a la manipulación experimental

El propósito de este estudio fue examinar la regulación de la expresión y secreción de hRen en respuesta a una variedad de manipulaciones fisiológicas y farmacológicas en ratones transgénicos. Estudios previos han demostrado que los ratones transgénicos que contienen una construcción genómica que consta de todos los exones y secuencias de intrones y que están flanqueados por una cantidad relativamente pequeña de ADN hRen aguas arriba (900 pb) y aguas abajo (400 pb) exhibían un patrón de expresión específico de tejido y específico de célula en gran parte coherente con la expresión de genes de renina en roedores. 5 6 Dado que la cantidad de ADN flanqueante 5 'utilizada en la construcción era bastante pequeña, deseamos determinar si el gen era capaz de responder a señales fisiológicas que normalmente regulan la expresión y liberación de renina.

En los estudios realizados con ratones transgénicos individuales, se estimuló la liberación de hRen activo en condiciones de inhibición de la enzima convertidora de angiotensina con captopril o tratamiento con isoproterenol. El nivel de ARNm de hRen en estado estacionario también aumentó en los ratones tratados con captopril. Estos cambios reflejaron la respuesta del ARNm y la proteína endógenos del ARNm a estos tratamientos. Se cree que Ang II participa en un circuito de retroalimentación que regula la liberación y expresión de renina actuando a través de un mecanismo dependiente del receptor de angiotensina tipo 1. 21 22 23 24 Aunque presumiblemente esto ocurre directamente en las células yuxtaglomerulares, no se han reportado pruebas suficientes para probarlo directamente. Sobre la base de este modelo, la liberación y el ARNm de hRen deberían aumentar en los ratones tratados con captopril debido a un alivio de la supresión por retroalimentación mediada por Ang II. El mRNA mPRA y mRen también aumentaron de manera similar en ratones tratados con captopril, aunque el aumento en mPRA no fue tan grande como el observado con hPRC. Lo más probable es que esto se deba al hecho de que la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina no solo disminuye la Ang II circulante y aumenta la síntesis y liberación de renina, sino que también disminuye la producción y liberación de angiotensinógeno, lo que disminuye la actividad generadora de Ang I. El valor de hPRC no se vio afectado por esto porque agregamos un exceso de hAng exógeno al plasma para determinar el PRC.

La activación de los receptores β-adrenérgicos por la epinefrina circulante o por la liberación de noradrenalina de las terminales nerviosas simpáticas renales debe estimular la liberación de renina y aumentar el ARNm de renina a través de una vía dependiente de cAMP. 25 26 En nuestros experimentos, demostramos que el nivel circulante de hRen aumentó en respuesta al isoproterenol y que la respuesta fue mediada específicamente por el receptor bloqueando la respuesta con la administración previa del antagonista del receptor β-adrenérgico propranolol. No determinamos el ARNm de renina en este grupo experimental porque no anticipamos que un tratamiento agudo de 15 minutos afectaría el nivel de ARNm de renina en estado estacionario. Además, los efectos estimulantes directos mediados por receptores del tratamiento crónico con isoproterenol sobre los niveles de ARNm de renina deberían interpretarse en el contexto de sus efectos de elevación de la PA. Actualmente estamos realizando experimentos para medir el efecto de la estimulación crónica del receptor β-adrenérgico en condiciones en las que la PA no se eleva por la coadministración de un vasodilatador.

De todos los resultados presentados en este informe, los datos obtenidos de los grupos de tratamiento alto, bajo y sin sal son los más difíciles de conciliar. Como era de esperar, los ratones alimentados con una dieta alta en sal durante 10 días mostraron una disminución pequeña pero significativa en hPRC, presumiblemente debido a la activación de los mecanismos de la mácula densa. 27 28 Sin embargo, el ARNm de hRen en estado estacionario en el grupo con alto contenido de sal no disminuyó significativamente. Las explicaciones obvias pueden reflejar la corta duración del tratamiento (10 días) y las limitaciones para detectar un pequeño cambio en el ARNm de hRen renal que se correlaciona con una disminución de solo un 30% en los niveles plasmáticos de hRen activo. En contraste con el grupo con alto contenido de sal, la limitación de la ingesta de sodio mediante la alimentación de ratones con dietas bajas en sal o deficientes en sodio durante 10 días no tuvo ningún efecto sobre los niveles de ARNm de hRen o hPRC renal. Además, no hubo un efecto aditivo sobre los niveles de hPRC del uso de diuréticos en ratones alimentados con una dieta deficiente en sodio, aunque se observó un modesto aumento de mPRA en el grupo transgénico (Tabla). En ratas, estos tratamientos generalmente dan como resultado un aumento significativo de ARNm de renina renal y ARNm. El hecho de que los niveles de mPRA y hPRA coincidieran a lo largo de estos experimentos descarta la posibilidad de que el gen humano carezca de elementos reguladores apropiados que respondan a las señales de la mácula densa. En cambio, los resultados sugieren que la magnitud o la duración de los tratamientos en ratones deben aumentar significativamente o que los ratones son más refractarios a los cambios en el sodio de la dieta. Curiosamente, 10 días de alto contenido de sodio en la dieta no elevan la PA en varias cepas de ratones (D.C. Merrill y C.D.S., resultados no publicados, 1995). Será de vital importancia en experimentos futuros medir la excreción urinaria de sodio y sodio plasmático para confirmar la eficacia de nuestro régimen dietético para modular los niveles de sodio plasmático.

También es importante señalar que no podemos descartar la renina extrarrenal como fuente de renina plasmática en los ratones transgénicos. De hecho, hRen se expresa en una variedad de tejidos además del riñón, incluidos los pulmones, los tejidos reproductivos y el tejido adiposo. 5 Estudios previos en roedores y grandes mamíferos demuestran claramente que los tejidos extrarrenales secretan prorenina, y las células Calu-6, que se derivan del pulmón humano, expresan ARNm de hRen de manera endógena pero secretan solo prorenina en los medios (DF Catanzaro y CDS, resultados no publicados, 1995 ). Aunque la glándula submandibular puede ser una fuente de renina extrarrenal en cepas de ratón que contienen la Ren-2 gen, los ratones utilizados en nuestros estudios se mantuvieron en un fondo genético C57BL / 6, que carece Ren-2 y tiene niveles 100 veces más bajos de ARNm de renina de la glándula submandibular. 29 30 Además, no hay ARNm de hRen en la glándula submandibular de la línea 9 y solo niveles bajos en la línea 10. Es poco probable que la renina derivada de la glándula submandibular sea responsable de nuestras observaciones porque la magnitud de las respuestas en las dos líneas fueron similares.

Regulación del ARNm de hRen en respuesta a una Ang II elevada y una PA elevada

Los resultados más interesantes obtenidos hasta ahora se encontraron en la comparación de los niveles de ARNm de renina renal en ratones transgénicos dobles hipertensos y sus homólogos transgénicos de hRen simple. Claramente, la expectativa era que la hipertensión crónica desencadenaría mecanismos barorreceptores y los niveles elevados de Ang II en plasma desencadenarían el ciclo de retroalimentación de Ang II para causar una regulación negativa significativa del ARNm de hRen renal en los ratones transgénicos dobles. De hecho, demostramos que la expresión de ARNm de ARNm endógeno está deprimida en los ratones transgénicos dobles. Estos resultados sugieren que los mecanismos que normalmente son responsables de regular el ARNm de renina en respuesta a una PA elevada o una Ang II circulante elevada están intactos.

La pregunta principal que nos queda es: ¿Cuál es el mecanismo que impulsa los niveles elevados de ARNm de hRen en el riñón de los ratones transgénicos dobles? En primer lugar, es poco probable que las diferencias de expresión o los efectos de posición entre las líneas sean responsables porque se usó la misma línea hRen tanto para los ratones transgénicos de hRen simple como para los ratones transgénicos dobles. Curiosamente, Lee et al 31 observaron que la expresión de los genes endógenos de renina de rata y mRen estaba suprimida en el riñón al inicio del estudio en ratas transgénicas hipertensas con TGR (mREN-2) 27 que contenían el ratón. Ren-2 gene. La inhibición de la enzima convertidora de angiotensina levantó la supresión de ambos genes de la renina y redujo la PA, pero la reducción de la PA sola sin alterar los niveles de Ang II no aumentó la expresión de ninguno de los genes de la renina. Los autores propusieron que la Ang II generada localmente puede estar suprimiendo la expresión del gen de la renina a pesar de que la PA sistémica se redujo. Estos resultados son consistentes con la regulación de retroalimentación corta de la renina por Ang II y apoyan el concepto de generación tisular local de Ang II. Sin embargo, los factores locales que modulan la respuesta del gen de la renina no pueden explicar la desincronía en la respuesta de los genes hRen y mRen observada en nuestro modelo.

Nuestros resultados pueden explicarse si la construcción transgénica utilizada en estos experimentos no contiene todos los elementos reguladores apropiados necesarios para regular la expresión del gen de la renina en respuesta a la PA elevada y / o la Ang II circulante aumentada. De hecho, el transgén utilizado contiene sólo 896 pb de ADN flanqueante 5 '. Se requieren hasta 4,6 kb de ADN flanqueante 5 'del promotor mRen para apuntar a la expresión apropiada por sí solo en ratones transgénicos. 32 33 Quizás la región reguladora que controla la respuesta a estos estímulos se encuentra más arriba. Una dificultad con esta interpretación es que el nivel de expresión del gen hRen aumentó significativamente en respuesta a la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina. Esto sugiere la posibilidad de que los elementos reguladores responsables de controlar la respuesta del gen de la renina a la disminución de la Ang II circulante (como en los ratones tratados con captopril) estén claramente separados de los que controlan la respuesta debida al aumento de la PA (o aumento de la Ang II). También es posible que el aumento de ARNm de renina debido a captopril y la disminución normalmente causada por los mecanismos barorreceptores y el bucle de retroalimentación de Ang II operen por diferentes mecanismos, como los mecanismos transcripcionales versus postranscripcionales. Se ha sugerido que el aumento de ARNm de renina en respuesta a AMPc elevado se debe en parte a la disminución del recambio de ARNm de renina en células yuxtaglomerulares de ratón 34 y células Calu-6 humanas. 35 Actualmente estamos probando algunas de estas hipótesis generando ratones transgénicos adicionales con construcciones que contienen tanto cantidades aumentadas (5 y 22 kb) como disminuidas (149 pb) de secuencias flanqueantes aguas arriba. También estamos determinando experimentalmente si los altos niveles circulantes de Ang II con y sin hipertensión son responsables de nuestras observaciones.


28.2: Regulación de la expresión génica en bacterias - Biología

Editor: Prensa científica Horizon
Autores: Anil Kumar de la Universidad Devi Ahilya, Indore-452017, India y A.K. Srivastavadel Instituto Indio de Investigaciones Veterinarias, Izatnagar-243122, India
Fecha de publicación: Agosto de 2001
ISBN-10: 1-898486-28-X (hbk)
ISBN-13: 978-1-898486-28-2 (hbk)
Paginas: viii + 152

Este volumen representa una excelente descripción general de temas avanzados seleccionados en biología molecular. Este libro está dirigido a todos los postgraduados, investigadores, profesores, editores, etc. que trabajen en esta área o que interactúen con biólogos moleculares. La primera página de cada capítulo contiene una tabla de contenido que proporciona una guía de "un vistazo" para todo el capítulo. Cada capítulo incluye una introducción que describe brevemente los conceptos básicos y ofrece una comprensión más clara del tema. El libro se abre con un capítulo sobre la organización del ADN en el genoma eucariota y continúa con capítulos sobre la replicación del ADN (procariota y eucariota), la transcripción, los mecanismos de empalme, el procesamiento del ARN en eucariotas, la regulación de la expresión génica (en procariotas y eucariotas). y transposones y los mecanismos de transposición. Se ha incluido un glosario para explicar los principales términos utilizados en biología molecular. Un volumen imprescindible para todo aquel que desee adquirir conocimientos fundamentales en este ámbito.


Biotecnología industrial y productos básicos

3.28.2 Preparación de productos químicos finos a partir de materias primas renovables

Se ha estimado [12] que solo se utiliza el 3% de la biomasa producida. Esta biomasa se compone de un 75% de carbohidratos y un 20% de lignina, y el 5% restante comprende aceites, grasas, proteínas y terpenos. Como consecuencia, el primer paso en una biorrefinería es la fermentación de materiales celulósicos y lingocelulósicos para producir productos macromoleculares excretados por las células como enzimas o polisacáridos. Luego, la producción de pequeñas moléculas como metabolitos primarios - ácido acético, acetona, aminoácidos, ácido cítrico, vitaminas, etc. - y metabolitos secundarios - antibióticos, colorantes, pigmentos y compuestos aromáticos representa el segundo paso en las biorrefinerías.

La producción de estructura β-lactámica es el ejemplo más descrito [4, 13]. En los siguientes párrafos se describen otros ejemplos representativos de estos procesos. Biotransformaciones catalizadas por bacterias, hongos o callo se han presentado como ejemplos representativos de la aplicación de la biotecnología en este campo.

3.28.2.1 Etanol

El etanol es el compuesto pequeño más grande obtenido en toneladas por fermentación anaeróbica de biomasa (24 000 toneladas año -1 [13]). La mayor parte del bioetanol se utiliza como combustible de transporte para reducir el uso de combustibles fósiles y el CO global.2 emisiones. Sin embargo, la opción de producir etanol industrialmente se está considerando cada vez más.

3.28.2.2 Ácido láctico

El ácido láctico se utiliza desde la década de 1990 como una sustancia química fina (producción de 60 000 a 80 000 toneladas año -1). Una parte importante (25 000 toneladas año -1) se utiliza como aditivo en la industria alimentaria. La segunda aplicación principal es como bloque de construcción de polímeros, solventes y plastificantes verdes. El ácido láctico se produce químicamente por hidrocianación ( Figura 1 ) seguido de hidrólisis de la cianhidrina. Los principales inconvenientes son la manipulación de cianuro de hidrógeno (HCN), la producción de (NH4)2ASI QUE4 (1 eq), y los pasos de purificación complejos para obtener ácido láctico de grado alimenticio porque se obtiene el ácido racémico. Para superar estas dificultades, la fermentación anaeróbica a partir de carbohidratos utilizando Lactobacillus delbrueckii es una buena alternativa porque solo (S) -ácido láctico se obtiene en un solo paso. La fermentación se realiza a 50 ° C durante 2 a 8 días con un rendimiento del 85 al 95% y la concentración de producto es de 100 g l -1. El aislamiento de (S) -ácido láctico de biomasa es fácil utilizando metodologías convencionales.

Figura 1 . Comparación de la producción química y de fermentación de (S)-ácido láctico.

3.28.2.3 Ácido shikímico

El ácido shikímico (SA) ha surgido recientemente como el intermedio clave en la síntesis del antiviral Tamiflu®. La preparación de SA utilizando Escherichia coli mutantes es una buena alternativa al aislamiento de SA del fruto de la Illicium plantas (mg kg -1 de biomasa). Estos mutantes han bloqueado la quinasa SA, combinada con mutagénesis para aumentar la producción de SA ( Figura 2 ). SA se secreta en el medio de cultivo (27 g l −1) acompañado de ácido dehyroshikimic (DHS) (& lt 4 g l −1) y ácido quínico (QA) (& lt 13 g l −1) como productos secundarios.

Figura 2 . Biosíntesis del ácido shikímico, el intermedio clave en la preparación de Tamiflu ®.

3.28.2.4 l-Triptófano

El l-triptófano (l -Trp) es un aminoácido esencial que se utiliza como aditivo en alimentos y piensos y en aplicaciones médicas. Aunque se han desarrollado muchas investigaciones en los últimos años para obtener este costoso aminoácido, no existe un proceso químico rentable para la l -Trp. Genéticamente modificado (OGM) Corynebacterium glutamicum y E. coli se han utilizado en la biosíntesis de l -Trp a partir del ácido corísmico (CHA). Estos OMG tienen D-ribosilantranilfosfato sintasa (DAHP sintasa) resistente a la retroalimentación y enzimas en la vía Trp liberadas de la regulación ( figura 3 ). La productividad varía de 45 g l −1 a 58 g l −1.

Figura 3 . Biosíntesis de l -Trp utilizando microorganismos modificados genéticamente (OGM).

3.28.2.5 Riboflavina (vitamina B2)

Riboflavina (vitamina B2) es un factor nutricional esencial para humanos y animales que lo necesitan como precursor de las flavoproteínas. La riboflavina se obtiene químicamente de la d-ribosa mediante el largo y tedioso proceso de Karrer-Tishler. En este proceso, se puede obtener un rendimiento global del 60% utilizando muchos disolventes orgánicos y pasos de protección / desprotección. Roche, en colaboración con OmniGene, llevó a cabo la biosíntesis utilizando un OMG. La clave del éxito fue la desregulación de genes, la sustitución de promotores nativos por promotores constitutivos y el aumento del número de copias de genes. El procesamiento posterior de la riboflavina de la fermentación es fácil porque la riboflavina precipita del caldo de fermentación y los cristales se recogen por centrifugación (pureza & gt 95%). Después de la cristalización convencional, se puede lograr & gt 99% de pureza ( Figura 4 ).

Figura 4 . Biosíntesis esquemática de riboflavina.

3.28.2.6 Aromas de productos naturales

Los monoterpenos son moléculas fragantes importantes ampliamente distribuidas en la naturaleza (más de 400 estructuras), que la industria de la perfumería puede aislar de las hojas, flores y frutos de muchas plantas. Además, son materias primas adecuadas para la producción biotecnológica de productos químicos aromáticos naturales útiles en la industria alimentaria o farmacéutica. En este sentido, la bioconversión de terpenos juega un papel importante, ya que la funcionalización química selectiva del CH remoto2 es difícil de lograr. Por el contrario, puede funcionalizarse biocatalíticamente con alta regio y estereoselectividad, como ocurre, por ejemplo, cuando se utilizan monooxigenasas [14].

Geraniol y nerol ( Figura 5 ), la mezcla de ambos (citrol) y la mezcla de aldehídos (citral) se pueden transformar en 6-metil-5-hepten-2-ona mediante cultivos superficiales esporulados de Penicillium digitatum. Estas esporas conservaron su capacidad de biotransformación durante un período de al menos 6 semanas, lo que hizo que la biooxidación fuera atractiva industrialmente.El citral, un terpeno aromático que imparte el característico aroma de limón a plantas como la hierba de limón, es un compuesto relativamente económico y representa un ingrediente importante en la industria de la perfumería empleado para la síntesis de enantiómeros de mentol.

Figura 5 . Estructura de algunos monoterpenos de interés industrial.

Otro compuesto aromático interesante es (R) - (+) - limoneno ( Figura 5 ), que se puede obtener del aceite de piel de naranja. Biotransformación de este monoterpeno por el basidiomiceto Pleurotus sapidus condujo a cis/trans-carveol y carvona ( Figura 5 ) como los principales productos. (S) -Carvona (sabor a alcaravea) y (R) -carvona (sabor a menta verde) son compuestos aromáticos importantes para alimentos y bebidas. Ambos estereoisómeros pueden reducirse estereo y quimioselectivamente utilizando hongos [15].

3.28.2.7 Sesquiterpenos, diterpenos y otros terpenos altos

Los terpenos altos se obtienen de plantas y muestran propiedades interesantes en Química Medicinal [14]. En los siguientes párrafos se indican algunas biotransformaciones interesantes de estos metabolitos secundarios.

Los hongos filamentosos Bipolaris sorokiniana produce eficientemente la biotransformación de α-bisabolol ( Figura 6 ) al óxido de bisabolol B. El α-bisabolol es económicamente interesante debido a su delicado olor floral y sus actividades antiinflamatorias y antisépticas. Por lo tanto, se está empleando ampliamente en la industria farmacéutica. En la presente metodología, la alta regio y estereoselectividad observada en la síntesis de un diastereoisómero de bisabolol-óxido B junto con el alto rendimiento (84%) hacen que esta biotransformación sea muy atractiva. Por el contrario, la oxidación química de α-bisabolol con metroEl ácido -cloroperbenzoico no es selectivo, lo que da lugar a una mezcla de productos de epoxidación de ambos CC con escaso rendimiento.

Figura 6. Algunas estructuras de alto contenido de terpenos con interés industrial.

La alta selectividad de las enzimas hace que estas biotransformaciones de moléculas biológicamente activas sean de gran interés debido a la posibilidad de lograr productos difíciles de obtener por síntesis química y con supuestas mejores propiedades. Los procesos no se realizan exclusivamente con enzimas microbianas. En efecto, callo de plantas. Este es el caso de Taxol®, que es un fármaco muy valorado en la quimioterapia contra el cáncer. Paclitaxel (Taxol ®) ( Figura 7 ) fue aislado de Taxus brevifolia Cortezas con un rendimiento de solo 0,014%. La estructura de Taxol® es imposible de lograr mediante una síntesis química total. Además, T. brevifolia crece lentamente (200 años siendo productor de Taxol®). Para mejorar la producción, semisíntesis de 10-deacetyl-Baccatin III, producida por European Taxus baccata hojas (rendimiento 0,1%) ( Figura 7 ). Esta alternativa da como resultado mejores rendimientos totales que el aislamiento de producto natural.

Figura 7. Semisíntesis de paclitaxel a partir de 10-desacetil-bacatina III.

La alternativa biotecnológica es la cultura de callo de T. baccata hojas y fermentación utilizando farnesil-difosfato e isopentenil-pirofosfato como precursores, esta biosíntesis produce Baccatin III. Luego, la fenil-serina transferasa cataliza la acilación de Baccatin III hasta Paclitaxel (110 mg l -1 cada 2 semanas). Esta alternativa, que utiliza biotecnología verde, permite la eliminación de 11 pasos químicos, reduce el uso de solventes orgánicos (especialmente en la sililación) y disminuye la generación de muchos desechos, al tiempo que aumenta el rendimiento general.

La alta producción de Taxol® abrió la posibilidad de mejorar la actividad farmacológica y / o el perfil farmacocinético, y así se han realizado diferentes biotransformaciones. Bioconversión de 2α, 5α, 10β, 14β-tetra-acetoxi-4 (20), 11-taxadieno por los hongos Cunninghamella elegans o Cunninghamella echinulata fue examinado. Se produjeron reacciones de hidroxilación y desacetilación en varias posiciones dando un compuesto con el mismo perfil farmacológico pero más fácil de administrar.

Argentatina B ( Figura 6 ) es un triterpeno tetracíclico con una estructura de tipo cicloartano. Estaba aislado de Parthenium argentatum y Partenio tomentosa. La transformación microbiana condujo a 16,24-epoxicicloartan-3β, 25-diol (isoargentatin D) por Nocardia corallina var. taoka ATCC 31338, Mycobacterium especie NRRL B3683, o Septomyxa affinis ATCC 6737, que también produjo 16,24-epoxicicloartan-3β, 25-diol (argentatin D) y 1,2-didehydroargentatin B (isoargentatin D). Los triterpenos de tipo cicloartano son líderes en el desarrollo de potentes promotores antitumorales (agentes quimiopreventivos del cáncer) [10].

Betulina, ácido betulínico y sus derivados ( Figura 6 ) se ha informado que exhiben una variedad de propiedades biológicas, como actividad antiinflamatoria, inhibición de la replicación del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en las células de linfocitos H9, bloqueo de la entrada del VIH tipo 1 en las células, inhibición de la ADN polimerasa β y inhibición efectos sobre la activación del antígeno temprano del virus de Epstein-Barr (EBV-EA). Biotransformación preparativa de ácido betulínico utilizando suspensiones de células en reposo de Cunninghamella sp. proporcionó la glicosilación para dar 28-O-β- d -glucopiranosil-3β-hidroxi-lup-20 (29) -en-28-oaato. Sin embargo, este metabolito no fue activo contra las líneas celulares de melanoma probadas en comparación con el sustrato (ácido betulínico) [14]. Estos resultados sugieren que el grupo ácido carboxílico libre es esencial para la actividad citotóxica contra el melanoma. Incubación de ácido betulínico con suspensiones de células en reposo de fenobarbital inducido Bacillus megaterium ATCC 14581, Cunninghamella elegans, Mucor mucedo, y B. megaterium ATCC 13368 dio como resultado la producción de metabolitos oxidados de manera diferente con alta actividad frente a diferentes cánceres humanos.


OBESIDAD SINDROMICA

Las formas sindrómicas de obesidad a menudo se asocian con fenotipos además de la obesidad grave de aparición temprana. Esto puede deberse a cambios en un solo gen o en una región cromosómica más grande que abarca varios genes. La obesidad es una característica de casi 100 síndromes, un poco más de la mitad aún no tienen nombre y el 13,9% tiene más de un nombre. 72 Los fenotipos copresentantes a menudo incluyen discapacidad intelectual, facies dismórfica o anomalías específicas de órganos y sistemas. Las formas más frecuentes de obesidad sindrómica son el síndrome de Bardet Biedl y Prader Willi.

Síndrome de Bardet-Biedel (BBS)

El BBS es una ciliopatía autosómica recesiva poco frecuente caracterizada por distrofia retiniana, obesidad, polidactilia posaxial, disfunción renal, dificultades de aprendizaje e hipogonadismo. 73 La prevalencia de BBS varía notablemente entre poblaciones desde 1: 160 000 en las poblaciones del norte de Europa hasta 1: 13500 y 1:17 5000, respectivamente, en comunidades aisladas de Kuwait y Terranova, donde prevalece un mayor nivel de consanguinidad. El fenotipo evoluciona lentamente durante la primera década de la vida y, a menudo, la única manifestación que se observa al nacer puede ser la polidactilia posaxial, con o sin otras anomalías de las extremidades. 74 La aparición gradual de ceguera nocturna, junto con la fotofobia y la pérdida de la visión central y / o cromática es el siguiente hallazgo definitivo, que a menudo conduce al diagnóstico. La obesidad está presente en la gran mayoría (72 & # x0201386%) de las personas, aunque el peso al nacer puede ser normal. Existe una alta prevalencia de diabetes tipo 2, hipogonadismo, déficit cognitivo, comportamiento lábil, déficit del habla, anomalías renales y cardíacas. 75 El defecto biológico del síndrome es una anomalía en los cilios inmóviles que funcionan principalmente como el orgánulo sensorial que regula las vías de transducción de señales. La unidad funcional de los cilios inmóviles, o BBAlgunos, comprende el cilio, el cuerpo basal, el complejo chaperonina y otras proteínas de membrana que mantienen la función del cilio. En el momento de escribir este artículo, se han identificado mutaciones en 16 genes diferentes que alteran la función del BBSome en varios niveles (BBS1 & # x02013BBS16). Se puede encontrar una revisión completa de BBS en GeneReviews (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1363/).

Síndrome de Prader Willi (PWS)

El SPW es la causa más común de obesidad sindrómica en todo el mundo (1 de cada 15.000 y # x0201325.000 nacimientos). 76 Se caracteriza por hipotonía neonatal grave, trastornos de la alimentación que evolucionan en varias fases (desde anorexia y retraso del crecimiento en la primera infancia hasta hipefagia grave con compulsividad alimentaria alrededor de los 4 & # x020138 años de edad). 77 Las características adicionales incluyen facies dismórficas, deterioro cognitivo global, anomalías del comportamiento, hipotonía, retraso en el desarrollo motor y deficiencias hormonales como la hormona del crecimiento, hipotiroidismo, hipogonadismo y anomalías de la grelina. 76 El defecto genético en PWS es la inactivación de la región crítica de Prader-Willi (PWCR) ubicada en la región 15q11-13 del cromosoma paterno. El PWCR en el cromosoma materno está impreso y, por lo tanto, silenciado epigenéticamente mediante metilación, lo que lleva a la expresión monoalélica de los genes paternos. 78 La mayoría de los casos de SPW son causados ​​por deleciones intersticiales de la región paterna del PWCR (65 & # x0201370%), mientras que otros por disomía uniparental materna (20 & # x0201330%) y mutaciones dentro del centro de impronta (2 & # x020135%). Al menos 5 genes, ubicados en el PWCR y expresados ​​en el hipotálamo, han sido implicados sin claridad de sus funciones: MKRN3 (makorin 3), MAGEL2 (Como un mago 2), NDN (necdin), NPAP1 (proteína 1 asociada al poro nuclear), SNURF-SNRPN (Marco de lectura SNRPN aguas arriba y proteína ribosomal nuclear pequeña # x02013 1). 79 Un estudio reciente de neuronas derivadas de células madre pluripotentes de individuos con microdeleción en el PWCR indica una menor expresión de proconvertasa 1 (PC1), previamente implicada en la obesidad monogénica, ofreciendo potencialmente una explicación unificadora para el fenotipo. 80

Síndrome de microdeleción 16p11.2

Esta deleción heterocigótica de

La región de 593 kb en el cromosoma 16 se caracteriza por retraso en el desarrollo, discapacidad intelectual y / o trastorno del espectro autista junto con obesidad severa. Walter et al observaron la presencia de obesidad severa en niños con la deleción y realizaron un análisis a gran escala utilizando cohortes poblacionales y basadas en enfermedades para encontrar un enriquecimiento de la deleción en niños y sus padres con obesidad. 81 Otros estudios de Bochukova y sus colegas indican que la obesidad observada en niños y adultos con la deleción 16p11.2 puede estar mediada por SH2B1, ubicado en la región. 82

Además del PWS y el síndrome de deleción de 16p11.2, se han identificado varios otros síndromes relacionados con la obesidad con defectos cromosómicos. La obesidad a menudo se manifiesta en muchos individuos, pero no en todos, lo que sugiere una penetrancia variable o un gen específico que puede estar involucrado de manera diferencial en diferentes individuos. Los ejemplos incluyen la deleción de 1p36 (síndrome de monosomía 1p36), 2q37 (síndrome de retraso mental braquidactilia BDMR), 6q16 (síndrome similar al PWS), 9q34 (síndrome de Kleefstra), 11p13 (síndrome de WAGR) y 17p11.2 (síndrome de Smith Magenis SMS) . 83 Estos síndromes pueden ser la clave de los genes individuales en la región que podrían explicar mejor la biología de la enfermedad, p. Ej. presencia de deleción en el BDNF gen en individuos con síndrome de WAGR que también presentaban obesidad. 63

La Tabla 2 proporciona una lista de síndromes que se sabe que están asociados con la obesidad, los síndromes de sobrecrecimiento (a veces confundidos con obesidad) y los síndromes en los que aún no se ha dilucidado una etiología genética. Muchos de estos síndromes abarcan anomalías del desarrollo neurológico de espectro variable. Los estudios a gran escala, como los estudios de asociación de todo el genoma, han mostrado una expresión generalizada de los loci asociados con el IMC en el cerebro. Es plausible que exista una base compartida no identificada hasta ahora de la obesidad y los defectos del neurodesarrollo. Sin embargo, debido a la alta prevalencia de obesidad en la sociedad y la influencia de los medicamentos neuropsicológicos sobre el peso, y el uso de alimentos como modulador de la conducta, la presencia de obesidad puede ser un mero factor de confusión. Sin embargo, los defectos del neurodesarrollo continúan sirviendo como un marcador importante para considerar la investigación genética en niños con obesidad severa de inicio temprano. Se remite al lector interesado a una revisión sistemática reciente de Kaur et al. 72

TABLA 2

A] SÍNDROMES CON OBESIDAD COMO CARACTERÍSTICA
NOMBREGENEFenotipo
MIM
Gen / Locus
MIM
CARACTERÍSTICAS CLÍNICASModo de
HERENCIA
CROMOSÓMICO
POSICIÓN
GENÉTICO
DEFECTO
Síndrome de microduplicación 5p13NIPBL613174 Retraso en el desarrollo, comportamiento autista, obesidad, linfedema, hipertensión y macrocefaliaANUNCIO5p13Microduplicación
Deleción 16p11.2? SH2B1611913 Autismo, obesidad severa de inicio temprano, discapacidad intelectual, anomalías congénitas-16p11.2del
Osteodistrofia hereditaria de Albright / PHP tipo 1 aGNAS103580139320Braquimetaflangismo, baja estatura, obesidad y retraso mentalANUNCIO20q13.32MS, FS, NS, SS, indel
Síndrome de AlstromALMS1203800606844Ceguera, discapacidad auditiva, obesidad infantil, resistencia a la insulina y diabetes tipo 2Arkansas2p13.1FS, NS, MS
Síndrome de Bardet Biedel (BBS) Retinosis pigmentaria, obesidad, disfunción renal, polidactilia, disfunción conductual e hipogonadismo
BBS 1BBS1209900209901 AR, DR11q13.2MS, NS, SS, FS
BBS 2BBS2615981606151 Arkansas16q13MS, NS, FS, SS, duplicación
BBS 3ARL6209900608845 Arkansas3q11.2NS, del
BBS 4BBS4615982600374 Arkansas15q24.1MS, NS, SS, supr.
BBS 5BBS5615983603650 Arkansas2q31.1MS, FS, SS, del
BBS 6MKKS605231604896 Arkansas20p12.2MS, FS
BBS 7BBS7615984607590 Arkansas4q27FS, MS, NS, suprimir
BBS 8TTC8615985608132 Arkansas14q31.3MS, SS, indel
BBS 9PTHB1615986607986 Arkansas7p14.3FS, SS, del
BBS 10BBS10615987610148 Arkansas12q21.2MS, NS, FS, SS, suprimir
BBS 11TRIM32615988602290 Arkansas9q33.1MS, FS
BBS 12BBS 12615989610683 Arkansas4q27MS, NS, FS, suprimir
BBS 13MKS1615990609883 Arkansas17q22SRA
BBS 14CEP290615991610142 Arkansas12q21.32NS
BBS 15WDPCP615992613580 Arkansas2p15NS, SS
BBS 16SDCCAG8615993613524 Arkansas1q43-44NS, SS
BBS 17LZTFL1615994606568 Arkansas3p21.31MS, NS
BBS 18BBIP1615995613605 Arkansas10q25.2NS
BBS 19IFT27615996615870 Arkansas22q12.3SS
BBS 20IFT172617119608040 Arkansas2p23.3SS
BBS 21C8ORF37617406614477 Arkansas8q22.1SRA
Síndrome de Borjeson-Forssman-LehmannPHF6301900300414Discapacidad intelectual grave, epilepsia, microcefalia, baja estatura, obesidad, hipogonadismo y ginecomastiaXLRXq26.2NS, MS, truncado
Síndrome de CarpenterRAB23201000606144Acrocefalia con sinostosis variable, malformaciones cerebrales, facies dismórfica, anomalías en las extremidades, defectos cardíacos, retraso mental, retraso del crecimiento, hipogenitalismo y obesidadArkansas6p12.1-p11.2MS, FS, SS, del
Síndrome CHOPS *AFF4616368604417Deterioro cognitivo, facies tosca, defectos cardíacos, obesidad, afectación pulmonar, baja estatura y displasia esqueléticaANUNCIO5q31.1MS, SS, del, dup, LOF
Síndrome de Chudley-LowryATRX309580300032retraso mental, baja estatura, obesidad leve, hipogonadismo y dismorfismoXLRXq21.1LOF
Síndrome de CohenVPS13B / COH1216550 Retraso del desarrollo, dismorfia facial, microcefalia, distrofia retiniana, obesidad del tronco, laxitud articular y neutropenia intermitenteArkansas8q22.2MS, NS, del, dup, CNV
Síndrome de Kabuki / síndrome de Niikawa-KurokiKMT2D / MLL2 / ALR / KABUK1147920602113Gestalt facial, discapacidad intelectual, malformaciones viscerales y esqueléticas y talla baja posnatal con sobrepesoANUNCIO12q13.12NS, FS, del
Síndrome de KleefstraEHMT1610253607001Retraso mental, obesidad, hipotonía, braquicefalia, rasgos faciales característicos, anomalías cardíacasANUNCIO9q34.3NS, FS, del
Síndrome MORMINPP5E610156613037Retraso mental moderado, obesidad troncal, distrofia retiniana congénita no progresiva y micropeneArkansas9q34.3NS
Síndrome de Prader-WilliMKRN3 / ZNF127 / MAGEL2 / SNRPN176270 Falta de crecimiento & # x00026 dificultades de alimentación en la infancia, obesidad & # x00026 hiperfagia que comienza en la niñez, hipotonía, baja estatura, retraso en el desarrollo, manos y pies pequeños, hipoplasia genital 15q11.2del, disomía uniparental
Síndrome de Rubinstein-TaybiCREBBP180849600140Baja estatura, obesidad, facies dismórfica, dificultades visuales, problemas de alimentación, curvatura de la columnaANUNCIO16p13.3NS, MS, FS, SS, suprimir
Retraso mental vinculado a Shashi-XRBMX Facies tosca, retraso mental, labio inferior prominente, testículos grandes y obesidadXLR NS, SS, MS
Síndrome de Smith MagenisRAI1182290607642Discapacidad intelectual, retraso en el habla y el lenguaje, trastornos del sueño, problemas de comportamiento y obesidadANUNCIO17p11.2microdelo, MS, FS, NS
Síndrome de WAGROBDNF612469612469Tumor de Wilms, aniridia, anomalías genitourinarias, retraso mental y obesidad?ANUNCIO11p13-p12microdelo, inversión de cromo
OBHDNTRK2613886600456Obesidad, hiperfagia y retraso en el desarrollo, deterioro de la memoria y discapacidad de aprendizaje?ANUNCIO9q21.33SRA
Síndrome mamario ulnarioTBX3181450601621Deficiencia de extremidades posteriores, hipoplasia apocrina / glándula mamaria, pubertad tardía, anomalías genitales y obesidadANUNCIO12q24.21MS, NS, del
Síndrome sin nombre1CUL4B300354300304Pubertad tardía, hipogonadismo, macrocefalia, baja estatura, obesidad central, problemas de comportamiento, pie cavo, dedos anormalesXLRXp24MS, SS, del
Síndrome sin nombre2UBE2A300860312180Facies dismórfica, cabeza grande, sinófiros, rayita baja, genitales pequeños, convulsiones, retraso mental, sobrepeso y obesidadXLRXp24MS, NS, del
B] SÍNDROMES DE CRECIMIENTO EXCESIVO
NOMBREGENEFenotipo MIMGen / Locus MIMCARACTERÍSTICAS CLÍNICASMODO DE HERENCIAPOSICIÓN CROMOSÓMICADEFECTO GENÉTICO
Síndrome de Bannayan-Riley-RuvalcabaPTEN153480601728Macrocefalia, pseudopapiledema, hemangioma múltiple, lipomatosANUNCIO10q23.31MS, NS, SS, supr.
Síndrome de Beckwith-WeidemannICR1 / H19 / KCNQ1OT1 / CDKN1130650variosMacrosomía, macroglosia, paladar hendido, visceromegalia, pliegues del lóbulo de la oreja, hipoglucemia neonatal, tumores embrionarios, hemihipertorfiaANUNCIO11p15.5del, MS
Síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber-14900-Hemangioma cutáneo grande con hipertrofia de los huesos y tejidos blandos relacionados-8q22.3
Síndrome de Parkes WeberRASA1608355139150múltiples malformaciones arteriovenosas debajo de la piel, hipertorfia esquelética-5q13.3MS, FS, NS, supr.
Síndrome de proteusAKT1176920164730sobrecrecimiento asimétrico y desproporcionado de una o más regiones del cuerpo, malformaciones vasculares, nevos y tejido adiposo anormalmosaicismo14q23.31
Síndrome de Silver-Russell-180860-Cara triangular con frente ancha y puntiaguda, mentón pequeño con boca ancha, retraso del crecimiento (estatura baja, RCIU), hemihiperplasia-7p11.2
Síndrome de Simpson-Golabi-BehmelGPC3312870300037Crecimiento excesivo pre y postnatal, facies tosca, defectos cardíacos, otras anomalías congénitasXLRXq26.2EM, SS, NS
Síndrome de SotosNSD1117550606681macrocefalia, crecimiento excesivo, retraso en el desarrollo, edad ósea avanzada, hipotonía, hiperreflexia, retraso motor, manos y pies grandes, pueden estar asociados con tumoresANUNCIO5q35NS, FS, del
Síndrome de WeaverEZH2277590601573macrocefalia, hipertonía leve, edad ósea avanzada, protuberancia frontal, pulgar ancho, contracturas de los codos, dificultad de aprendizaje, anomalías en las extremidadesANUNCIO7q36.1NS, MS, del
C] SÍNDROMES GENÉTICAMENTE NO ELUCIDADOS
NOMBREGENEFenotipo MIMGen / Locus MIMCARACTERÍSTICAS CLÍNICASMODO DE HERENCIAPOSICIÓN CROMOSÓMICADEFECTO GENÉTICO
Síndrome de Camera-Marugo-Cohen-604257-Obesidad, baja estatura, deficiencia mental, hipogonadismo, micropene, contracturas de los dedos, labio-paladar hendido---
Síndrome de Clark-Baraitser-300602 Macrocefalia, retraso mental, & # x02018square & # x02019 frente, rasgos prominentes, estatura alta, orejas grandes, obesidad y macroorquidia---
Síndrome de MEHMO-300148-Retraso mental, ataques epilépticos, hipogonadismo, microcefalia y obesidad? MitocondrialXp22.13-p21.1-
Síndrome de MOMES-606772-Retraso mental, obesidad, blefarofimosis, astigmatismo, hipoplasia maxilar, prognatismo mandibular?ARKANSAS--
Síndrome de MOMO-157980 Macrosomía, obesidad, macrocefalia, anomalías oculares---
Síndrome de Morgagni-Stewart-Morel-144800-Hiperostosis frontalis interna, galactorrea, hiperprolactinemia, diabetes mellitus, hiperfosfatasia, obesidad, hipertricosis?ANUNCIO--
Síndrome de deleción 1p36-607872-Hipotonía, retraso en el desarrollo, anomalías del crecimiento, obesidad y dismorfia craneofacial-1p36del
Síndrome de deleción 2p25.3MYTL1616521-Discapacidad intelectual, obesidad, problemas de comportamiento, alteraciones del sueñoANUNCIO2p25.3del

AD = autosómico dominante, AR = autosómico recesivo, XLR = recesivo ligado a X, MS = mutación sin sentido, NS = sin sentido, SS = sitio de empalme, LOF = pérdida de función, del = deleción, dup = duplicación.

Para obtener una descripción completa y referencias, consulte Herencia mendeliana en línea en Man: omim.org utilizando los números MIM. Información adicional en Gene Reviews: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH, et al., Editores. GeneReviews & # x000ae [Internet]. Seattle (WA): Universidad de Washington, Seattle 1993 & # x020132017. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1116/


MA parcelas. Gráficos MA representativos que comparan los resultados de la matriz dentro de D. simulanos y entre especies.

Matriz de datos sin máscara. Datos procesados ​​para las 48 matrices de Affymetrix utilizadas para analizar las siete especies después del suavizado de Loess y la corrección de fondo + normalización usando MAS5 sin enmascaramiento (ver texto). La lista incluye genes con regiones codificantes de proteínas del Drosophila melanogaster anotación del genoma (versión 4.3). Las columnas son las siguientes: A. Ensembl - la anotación CG / CR proporcionada por Affymetrix, B. Chromosome, C. Strand - + sentido / - antisentido, D / E. Start / Stop desde la versión 4.3, F. Affymetrix Probe Set ID, G-I. Replica para Drosophila melanogaster, J-L. D. sechellia, M-0. D. mauritiana, P-R., D. teissieri, S-U. D. yakuba, V-Y. D. santomea, Z-BB Replica para los 10 cruces (3 cada uno) de D. simulanos.

Matriz de datos con máscara. Datos procesados ​​para las 48 matrices de Affymetrix utilizadas para analizar las siete especies después del suavizado de Loess y la corrección de fondo + normalización usando MAS5 después del enmascaramiento de la sonda (ver texto). A-F. Igual que el archivo adicional 2, G. Número de sondas en el conjunto de sondas eliminadas por enmascaramiento, H-N. Valores medios para las siete especies, O-BJ. ver archivo adicional 2.

Análisis de ventana deslizante entre especies. Valores p determinados para cada ventana en el análisis entre especies. El valor p se enumera en la fila del primer gen de la ventana considerada. A-G. Igual que el archivo adicional 3. H. número de genes utilizados para calcular valores, I. estadística de valor propio, J. valor p, para un tamaño de ventana de 2 genes, L-BL. Lo mismo para los tamaños de ventana 3 & # x0201320.

Ventanas fusionadas entre especies 1. Se encontró que las ventanas fusionadas eran significativas con un valor de p = 0,05 en el análisis entre especies. A-G. Igual que el archivo adicional 3. H-Z. Tamaños de ventana 2 & # x0201320.

Ventanas fusionadas entre especies 2. Resultados de repetir el análisis de ventana deslizante al eliminar una especie a la vez. Cada tamaño de ventana presenta el número de ventanas significativas encontradas en el análisis de todas las especies y los números entre paréntesis reflejan el rango de ventanas significativas identificadas al repetir el análisis eliminando una especie a la vez.

Drosophila simulans análisis de ventana deslizante. p-valores determinados para cada ventana en el D. simulanos análisis. El valor p se enumera en la fila del primer gen de la ventana considerada. A-BL igual que el archivo adicional 4.

Ventanas fusionadas Drosophila simulans 1. Se encontró que las ventanas fusionadas eran significativas con un valor p = 0.05 en el D. simulanos análisis. A-G. Igual que el archivo adicional 5. H-Z. Tamaños de ventana 2 & # x0201320.

Ventanas fusionadas Drosophila simulans 2. Conjuntos de genes parálogos y representación de estos conjuntos entre ventanas significativas identificadas en el valor p & # x0003c 0,001. C.A. Ubicación de los cromosomas y nombres de pares de genes parálogos. Tenga en cuenta que algunos de estos se combinan en conjuntos de genes paralog más grandes (resaltados en amarillo o verde). D-H. Resultados del análisis entre especies ("AS"), es decir. tamaño de ventana utilizado en el análisis, número de ventanas significativas (los números corresponden a Table & # x200B Table1), 1), número de estas ventanas que contienen parálogos, número de parálogos en ventanas significativas, número de parálogos no en ventanas significativas. SOY. Resultados análogos para el análisis dentro D. simulanos ("WS").

Clases de genes sobrerrepresentadas. Clases de genes sobrerrepresentados en grupos de coexpresión identificados mediante DAVID (ver texto). Los resultados se presentan para el análisis entre especies y para el análisis dentro de D. simulanos para un tamaño de ventana de 2 en el punto de corte del valor p del valor p = 0,001. Se presentan las clases con valores p & # x0003c 0.05 según lo determinado por DAVID.


Introducción

La regulación a nivel de transcripción es uno de los principales mecanismos por los que las bacterias adaptan su metabolismo a entornos cambiantes. En respuesta a estas dinámicas ambientales o internas, el control de la expresión génica se ejerce principalmente mediante factores de transcripción (TF), proteínas que se unen específicamente a los sitios de unión de TF (TFBS) o cis-motivos reguladores y, a su vez, cambian el patrón de expresión de los genes posteriores 1,2.

Los genomas bacterianos se organizan en forma de operones, un grupo de genes en tándem que comparten un terminador y un promotor, cada uno de los cuales contiene uno o más TFBS. El número máximo de operones co-regulados bajo el control directo de ciertos TF (s) se denomina regulón, un término que fue introducido por primera vez por Maas. et al. en 1964 3. Estudiar la coordinación del comportamiento celular en respuesta a señales internas o externas a nivel de transcripción como aspecto crucial en la genómica microbiana depende de nuestra capacidad para dilucidar correctamente todos estos regulones o por otros medios, la red reguladora transcripcional global (TRN) de una bacteria.

Aunque la forma más deseada de dilucidar el conjunto completo de regulones en una bacteria es el experimento, existen serios desafíos. Además de ser muy costoso y lento 4, la elucidación de todos los regulones en laboratorio requiere que los investigadores sepan exactamente qué condiciones desencadenarán qué regulones. Por tanto, se deben conocer todas las condiciones que conducirán a la activación de todos los regulones, procedimiento que parece aún imposible 5. Además, muchos estudios de elucidación de TRN bacterianos utilizan perfiles de expresión génica para predecir las interacciones de los TF y sus TFBS diana 6,7,8. Sin embargo, hay dos problemas en esta suposición: (a) no siempre una situación coexpresada denota corregulación 9 y (b) la regulación postranscripcional de TF también puede ocurrir y en esta situación el nivel celular de TF es constante sin embargo, la actividad se ve alterada. Estos problemas también pueden comprometer todas las predicciones.

Con este fin, se han diseñado herramientas computacionales para dilucidar todos los operones co-regulados codificados en genomas bacterianos con el objetivo principal de encontrar los conjuntos máximos de operones que comparten conservados cis-motivos reguladores (o en resumen, motivos) 10,11,12. Para esto ab initio inferencia de regulon, los motivos deben escanearse en busca de todos los operones mediante la técnica de huella filogenética. Desde su introducción en 1988 13, la huella filogenética ha mejorado enormemente el proceso de identificación de motivos computacionales mediante el uso de un análisis genómico comparativo de organismos estrechamente relacionados 14. Encontrar motivos de todos los operones en los genomas bacterianos permite un análisis adicional de los motivos conservados y similares agrupados con la opinión de que mostrarán un patrón de regulación similar, por lo que se clasificarán como un regulón. La predicción de regulones o reconstrucción de TRN es clave para comprender la función genética y la evolución de la bacteria que se está estudiando.

Lactococcus lactis es uno de los miembros mejor estudiados de las bacterias del ácido láctico (LAB) y se puede clasificar en diferentes subespecies. De estos, L. lactis subsp. lactis y L. lactis subsp. cremoris muestra un alto potencial biotecnológico que va desde sus amplias aplicaciones en la producción de productos lácteos fermentados 15 hasta la formación de sabor 16 y la producción de ácido láctico (subsp. lactis y cremoris) 17 a su implementación como sistemas de administración de fármacos para muchas proteínas terapéuticas (subsp. lactis) 18,19. Además, diferentes cepas de L. lactis subsp. lactis se conocen como productores de bacteriocina. La nisina lantibiótica, la bacteriocina más estudiada y utilizada, es el primer péptido antimicrobiano aprobado por la FDA para ser utilizado como conservante de alimentos y es producido por muchas cepas de L. lactis subsp. lactis 20. Según otras investigaciones, también se han propuesto nuevas aplicaciones de la nisina en el campo biomédico, como su potencial en el tratamiento de infecciones intestinales de colon 21, mastitis subclínica bovina 22 así como su papel sinérgico en el tratamiento de tumores de cabeza y cuello y cáncer colorrectal 23 , 24 e infecciones resistentes a los fármacos 25,26,27. Debido a los potenciales mencionados anteriormente, se han realizado muchos estudios para revelar la base molecular de la producción de nisina, así como otras características importantes de esta bacteria para comprender los conceptos básicos biológicos y la mejora de estos potenciales, como los estudios sobre la producción de nisina o la célula bacteriana. Mejora del crecimiento en diferentes condiciones ambientales para diversas industrias.

L. lactis subsp. lactis IO-1 es una cepa muy potente en la producción de L-lactato a partir de xilosa y glucosa, y se sugiere como un candidato prometedor para ser utilizado en la industria del plástico verde para la producción de ácido poliláctico (PLA) 28. La cepa también produce una variante natural de la nisina, la nisina Z 29, que se diferencia del péptido de nisina A típico en un solo aminoácido, lo que da como resultado una mayor solubilidad de la nisina Z a pH fisiológico, lo que la convierte en una candidata más adecuada para aplicaciones biomédicas.

Dado que también se ha demostrado que la producción de antibióticos está estrictamente regulada en el nivel transcripcional 30, en el presente trabajo hemos considerado reconstruir la TRN global de L. lactis subsp. lactis IO-1 mediante un enfoque exitoso basado en huellas filogenéticas que ha brindado la oportunidad de comprender y estudiar mejor los comportamientos reguladores del organismo al predecir todos sus regulones a partir de los datos genómicos.


Capítulo 18

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Desarrollo de la inmunidad de las células T

D Uso de herramientas de rastreo de linaje

El uso combinado de tejidos específicos Cre Los ratones recombinasa y los ratones informadores Rosa26 proporcionan una herramienta para determinar la relación de linaje entre las poblaciones de células en los tejidos linfoides. Se han generado varias cepas de ratones informadores lox-stop-lox codificadas por lacZ, fluorescentes, bioluminiscentes y diferentes. Las cepas más populares que se utilizan actualmente son las cepas informadoras Rosa26 eYFP y Rosa26 ACTB-tdTomato / EGFP. 41,42 Las células Rosa26 eYFP no son fluorescentes y solo después de la escisión mediada por Cre de la parada transcripcional pueden comenzar a expresar eYFP. Por el contrario, las células indicadoras Rosa26 ACTB-tdTomato / EGFP expresan la proteína fluorescente dtTomato unida a la membrana a niveles altos en todos los tejidos y luego expresan una eGFP unida a la membrana después de la recombinación mediada por Cre. La ventaja de esta segunda cepa de ratones es que el elemento promotor ACTB impulsa una expresión más fuerte de proteínas fluorescentes en comparación con el locus Rosa26 nativo. En nuestras manos, el análisis de expresión de mGFP en tejidos linfoides del reportero Rosa26 ACTB-tdTomato / EGFP reveló un aumento de 10 veces en la fluorescencia en comparación con los ratones Rosa26 eYFP tanto por citometría de flujo como por imágenes multifotónicas. Debido a que la deleción mediada por Cre de la señal de parada transcripcional flanqueada por lox en los indicadores genéticos es permanente, toda la progenie de las células que expresan o han expresado Cre están marcadas genéticamente. En un futuro próximo, creemos que las líneas de ratones Cre específicas del estroma proporcionarán una poderosa tecnología para rastrear la relación de linaje entre diferentes poblaciones de células del estroma.


Ver el vídeo: Regulation of Gene Expression: Operons, Epigenetics, and Transcription Factors (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Renne

    Estas cosas útiles son diferentes)) Karoch Prikona

  2. Gauvain

    Le pido perdón, eso no me conviene en absoluto.

  3. Kennan

    Hasta aquí todo bien.

  4. Kizuru

    Lamento interferir, pero sugiero ir hacia el otro lado.

  5. Dominique

    Confirmo. Me una de todo lo anterior. Intentemos discutir el asunto. Aquí, o por la tarde.



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