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Desequilibrio de ligamiento en GWAS

Desequilibrio de ligamiento en GWAS


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Veo que muchos estudios sobre GWAS no filtran el desequilibrio de ligamiento o ni siquiera hacen la menor mención de ello. ¿Por qué es este el caso? Me imagino que desea mantener los SNP que solo están en equilibrio de enlace para promover la independencia (y además, sin él, un modelo aditivo no tiene sentido)


Una posible razón para no filtrar el desequilibrio de ligamiento es producir picos / aciertos con múltiples SNP, lo que indica claramente una región de un genotipo causal. Por ejemplo, en el diagrama de Manhattan a continuación, cada punto representa un SNP, cuanto más alto está en el diagrama, más se relaciona con el fenotipo. Vemos que en cada uno de los picos múltiples puntos son significativos debido al desequilibrio de ligamiento. Si, en cambio, hubiéramos prefiltrado todos estos puntos, entonces un pico tiene una mayor opción de representar algún tipo de error en la recopilación de datos, ya que existe alguna probabilidad de que haya algún error en cada SNP, pero no muchas posibilidades de error. ocurriendo en todos los SNP de un pico.

No tengo claro por qué no podar el equilibrio de enlace evitaría que un aditivo o cualquier modelo funcione. Después de todo, un GWAS es solo una serie de regresiones entre los genotipos de un SNP y un fenotipo. En este único marco de referencia SNP, el LD no afecta el cálculo de las betas. Al alejarnos, todos los SNP significativos deben agruparse debido al LD, lo que indica solo unas pocas regiones y no provoca un aumento en la tasa de errores falsos.


Se requieren secuencias del genoma completo para resolver completamente la estructura de desequilibrio de ligamiento de las poblaciones humanas

La comprensión de las estructuras de desequilibrio de ligamiento (LD) en el genoma humano sustenta gran parte de la genética médica y proporciona una base para el mapeo de genes de enfermedades y la investigación de mecanismos biológicos como la recombinación y la selección. La secuenciación del genoma completo (WGS) brinda la oportunidad de determinar las estructuras de LD a máxima resolución.

Resultados

Comparamos mapas LD construidos a partir de datos WGS con mapas LD producidos a partir del conjunto de datos HapMap basado en matrices, para poblaciones representativas de Europa y África. WGS proporciona una densidad de SNP hasta 5,7 veces mayor que los datos basados ​​en matrices y logra una resolución mucho mayor de la estructura LD, lo que permite la identificación de hasta 2,8 veces más regiones de recombinación intensa. La ausencia de sesgo de verificación en el genotipado de variantes mejora la representatividad de la población de los mapas WGS y destaca el grado de variación no capturada utilizando metodologías de genotipado de matrices. La captura completa de patrones de LD utilizando WGS permite una mayor potencia de estudio de asociación de todo el genoma (GWAS) en comparación con GWAS basado en matrices, y WGS también permite el análisis de variaciones raras. El impacto de los problemas de verificación de marcadores en las matrices ha sido mayor para las poblaciones de África subsahariana, donde se requieren tamaños de muestra más grandes y densidades de marcadores sustancialmente más altas para resolver completamente la estructura de LD.

Conclusiones

WGS proporciona el mejor recurso posible para el mapeo LD debido a la densidad máxima de marcadores y la falta de sesgo de verificación. Los mapas de WGS LD proporcionan un recurso valioso para estudios de genética de poblaciones y médicos. La creciente disponibilidad de datos de WGS para grandes poblaciones permitirá mejorar la investigación utilizando LD, como GWAS y estudios de biología de recombinación.

Material complementario electrónico

La versión en línea de este artículo (doi: 10.1186 / s12864-015-1854-0) contiene material complementario, que está disponible para usuarios autorizados.


Resultados

TWAS es complementario a GWAS

Lin y col. (2017) informaron que en las especies de maíz de polinización cruzada, TWAS y GWAS identifican conjuntos complementarios de genes candidatos asociados a rasgos. Para extender estos hallazgos a una especie autopolinizada, realizamos GWAS y TWAS de forma independiente para el mismo fenotipo utilizando el mismo panel de diversidad de Arabidopsis. Los datos utilizados para estas comparaciones se resumen en "Materiales y métodos".

Repetimos GWAS basado en polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) publicado anteriormente para el tiempo de floración a 16 ° C (FT16) en un panel de 970 accesiones de Arabidopsis, y detectamos los mismos dos loci (Alonso-Blanco et al., 2016), LOCUS FLORECIENTE C (AtFLC) y RETRASO DE GERMINACIÓN1 (AtDOG1 Figura 1A). Paralelamente, se realizó TWAS en el subconjunto de accesiones de este panel para el cual estaban disponibles tanto los datos de la secuencia de ARN del tejido foliar como los fenotipos FT16 (norte = 690 muestras). Este análisis identificó 14 genes asociados a rasgos (Figura 1B Tabla 1), incluido solo uno de los dos genes identificados a través de GWAS, AtFLC. Aunque el otro gen asociado con FT16 a través de GWAS, AtDOG1, se expresa en el tejido foliar, no se asoció con el tiempo de floración a través de TWAS. Un total de 6 de los 14 genes asociados a rasgos de TWAS están incluidos en la base de datos FLOR-ID (Bouché et al., 2016), que incluye 306 genes relacionados con la floración de Arabidopsis curados a mano. Esto es sustancialmente más superposición de lo esperado por casualidad (prueba exacta de Fisher unilateral PAG-valor 5E-8). Las ventanas de 2 Mb centradas en cuatro de estos genes no contienen ningún otro gen asociado a rasgos (Figura 1C). Dos de los seis genes (AGAMOUS-LIKE16 [AtAGL16] y SQUAMOSA PROMOTER UNIENDO PROTEÍNA 15 [AtSPL15]) están separados por sólo 263 kb, pero se sabe que ambos están relacionados con el tiempo de floración (Figura 1C Tabla 1). Cinco de estos seis genes codifican factores de transcripción. Cuatro de estos exhiben interacciones regulatorias. SUPRESOR DE SOBREEXPRESIÓN DE CO1 (AtSOC1 tasa de falso descubrimiento [FDR] 2.6E-06) y AtSPL15 (FDR 4.9E-03) están regulados por AtFLC (FDR 4.5E-23) y AGAMOUS-LIKE24 (AtAGL24 FDR 1.1E-02) interactúa con AtSOC1 (Figura complementaria S1).

GWAS y TWAS de Arabidopsis FT16. Parcelas de Manhattan de GWAS (A) y TWAS (B). Las líneas discontinuas horizontales en cada panel designan el límite de significación de 0.05 FDR. Cada punto representa un solo SNP en GWAS y un solo gen en las parcelas TWAS. Los puntos en (A) y (B) están en cuatro colores diferentes para alternar a través de los estudios de asociación y cromosomas. Seis genes identificados por TWAS incluidos en la base de datos FLOR-ID están etiquetados con texto negro con la flecha (B). C, las ventanas de 2 Mb centradas en cada uno de los seis genes identificados mediante TWAS que se incluyen en la base de datos FLOR-ID. Cada punto representa un solo gen. Los genes centrados están resaltados en rojo y etiquetados con texto rojo, mientras que otros genes importantes están etiquetados con texto negro.

GWAS y TWAS de Arabidopsis FT16. Parcelas de Manhattan de GWAS (A) y TWAS (B). Las líneas discontinuas horizontales en cada panel designan el límite de significación de 0.05 FDR. Cada punto representa un solo SNP en GWAS y un solo gen en las parcelas TWAS. Los puntos en (A) y (B) están en cuatro colores diferentes para alternar a través de los estudios de asociación y cromosomas. Seis genes identificados por TWAS incluidos en la base de datos FLOR-ID están etiquetados con texto negro con la flecha (B). C, las ventanas de 2 Mb centradas en cada uno de los seis genes identificados mediante TWAS que se incluyen en la base de datos FLOR-ID. Cada punto representa un solo gen. Los genes centrados están resaltados en rojo y etiquetados en texto rojo, mientras que otros genes importantes están etiquetados en texto negro.

Catorce Arabidopsis genes asociados con el tiempo de floración a través de TWAS

FDR de TWAS NS, no significativo.

Los genes están relacionados funcionalmente con el tiempo de floración, pero no hay evidencia de que los mutantes alteren los tiempos de floración.

Catorce Arabidopsis genes asociados con el tiempo de floración a través de TWAS

FDR de TWAS NS, no significativo.

Los genes están relacionados funcionalmente con el tiempo de floración, pero no hay evidencia de que los mutantes alteren los tiempos de floración.

La información sobre los otros ocho genes asociados a rasgos identificados mediante TWAS se resume en la Tabla 1. Supresión antisentido de FACTOR DE INTERACCIÓN FITOCROMO3 (AtPIF3) conduce a una floración temprana (Oda et al., 2004). Existe evidencia de que tres de los otros genes asociados a rasgos (INHIBIDOR DE ARABIDOPSIS CDK1 [AtACK1], HELICASA DE ARN 30 [AtRH30], y VITAMINA C DEFECTUOSA 5 [AtVTC5]) están involucradas en redes reguladoras de floración (Dowdle et al., 2007 Kotchoni et al., 2009 Duan et al., 2016 Mahrez et al., 2016 Szklarczyk et al., 2019). AtACK1 codifica un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina y es un regulador negativo de la división celular (Han et al., 2005). Su expresión está alterada en el mutante de floración temprana BRR2a-T895I (Mahrez et al., 2016). Basado en la base de datos STRING (Szklarczyk et al., 2019), AtRH30 tiene al menos dos "socios funcionales" previstos involucrados en la floración, PROTEÍNA INTERACTIVA SNW / ESQUÍ y PROTEÍNA RICA EN GLICINA2. AtVTC5 codifica una guanosina difosfato (GDP) ‐l ‐ galactosa fosforilasa necesaria para la biosíntesis del ácido ascórbico (Dowdle et al., 2007). El ácido ascórbico puede afectar el tiempo de floración en Arabidopsis (Kotchoni et al., 2009). Es más, AtVTC5 es un objetivo putativo del gen de la floración, AtFLC (Duan et al., 2016). No hemos identificado evidencia que relacione los cuatro genes restantes con el tiempo de floración.

Para realizar una comparación justa entre GWAS y TWAS, se realizaron estudios de asociación en el subconjunto de muestras de Arabidopsis para las que estaban disponibles todos los genotipos, datos de expresión y datos fenotípicos (norte = 631). Usando estos datos, GWAS y TWAS identificaron 1 locus y 10 genes asociados con FT16, respectivamente (Figura complementaria S2 Tabla 1). El hallazgo de que muchos (1/1 de GWAS y 7/10 de TWAS) de estos genes asociados a rasgos se pueden vincular al tiempo de floración mediante estudios independientes demuestra que ambos métodos identifican verdaderos positivos a altas tasas.

Para ampliar estas conclusiones, se realizaron TWAS adicionales para cinco rasgos de desarrollo altamente correlacionados (tres para el tiempo de floración y dos para el número de hojas), utilizando datos de Grimm et al. (2017). El número de muestras que aportan valores fenotípicos, genotipo y niveles de expresión varían de 574 a 620, según el rasgo (Tabla complementaria S1). En los cinco rasgos, los TWAS identificaron 41 genes asociados a rasgos, que constan de 16 genes únicos, utilizando un límite de FDR de 0,05 (Tabla complementaria S1). Diez de estos 16 genes también habían sido identificados por FT16 TWAS. Uno de los seis genes restantes es LOCUS FLORECIENTE (AtFT AT1G65480), que se asoció con el rasgo número de hoja de roseta (RL) AtFT los mutantes exhiben un mayor número de hojas (Onouchi et al., 2000). El número de genes relacionados con la floración conocidos identificados por TWAS varió de 4 a 6 / rasgo (Tabla complementaria S1). No es sorprendente que los genes relacionados con la floración estuvieran asociados con el número de hojas porque estos dos rasgos están altamente correlacionados y positivamente con el tiempo de floración en Arabidopsis (Piñeiro y Coupland, 1998 Grimm et al., 2017). El GWAS correspondiente (Tabla complementaria S1) identificó cinco loci únicos, que incluyen AtDOG1. Ninguno de estos genes candidatos se superpuso con los identificados mediante TWAS (Figura complementaria S3). Usando un superconjunto de muestras (norte = 860-936 aquellos con genotipo pero sin datos de expresión), Grimm et al. (2017) identificaron a través de GWAS 30 genes candidatos para estos 5 rasgos. Solo uno de estos AtFLC, también fue identificado a través de TWAS. La superposición muy limitada entre los genes asociados a rasgos de GWAS y TWAS para estos cinco rasgos de desarrollo de Arabidopsis proporciona un apoyo adicional para la complementariedad de estos enfoques en una especie autopolinizada.

TWAS se ve menos afectado por LD que GWAS

GWAS explota LD entre marcadores y variación funcional. En especies con LD alta, los marcadores a menudo están estrechamente ligados a múltiples genes. En tales casos, a menudo es difícil asociar un solo gen causal a un rasgo (Atwell et al., 2010). Para probar si TWAS puede superar este desafío en una especie con altos niveles de LD, realizamos GWAS y TWAS para el color de la pubescencia en la soja, que tiene un LD promedio de ∼100 kb (Zhou et al., 2015).

Los datos de los rasgos de color de la pubescencia estaban disponibles para 75 de 102 líneas de soja para las cuales estaban disponibles tanto los datos de expresión como los genotipos de SNP (Tabla complementaria S2). Estas líneas tenían tawny (norte = 34) o gris (norte = 41) color de la pubescencia. los T locusGlyma.06g202300), que controla el color de la pubescencia (Toda et al., 2002), codifica un flavonoide 3′-hidroxilasa (F3′H). El dominante (T) y recesivo (t) los alelos confieren color leonado y gris, respectivamente. GWAS (Figura 2A) y TWAS (Figura 2B) se realizaron por separado para el color de la pubescencia utilizando métodos estadísticos comparables.

Análisis del color de la pubescencia de la soja mediante GWAS y TWAS. Parcelas de Manhattan de GWAS (A) y TWAS (B). Las líneas discontinuas horizontales designan el límite de significación de 0.05 FDR. Cada punto representa un solo SNP en GWAS y un solo gen en las parcelas TWAS. El locus causal conocido (T) está resaltado. Las regiones que rodean el T gen de los análisis GWAS y TWAS se amplían en las partes (C) y (D), respectivamente. Los puntos rojos en estos paneles designan el SNP (C) y el gen (D) asociados a rasgos más significativos en cada análisis. En (D), el gen causal, T, está etiquetado y las flechas indican las direcciones en las que se transcriben los genes. Las flechas grises representan genes que no se expresan en las muestras de ARN utilizadas en el TWAS. E, diagramas de violín y diagramas de caja de expresión del T gen en líneas de soja con pubescencia gris y leonada. La unidad de expresión es TPM. Los gráficos de violín muestran las curvas de densidad de probabilidad de T expresión en dos grupos de líneas de soja, el ancho de la curva corresponde con la frecuencia aproximada de los valores de expresión en cada región. El recuadro de la gráfica de recuadro muestra los percentiles 25–75. La línea negra dentro del recuadro muestra que los bigotes medianos representan 1,5 veces los puntos del rango intercuartílico representan valores atípicos.

Análisis del color de la pubescencia de la soja mediante GWAS y TWAS. Parcelas de Manhattan de GWAS (A) y TWAS (B). Las líneas discontinuas horizontales designan el límite de significación de 0.05 FDR. Cada punto representa un solo SNP en GWAS y un solo gen en las parcelas TWAS. El locus causal conocido (T) está resaltado. Las regiones que rodean el T gen de los análisis GWAS y TWAS se amplían en las partes (C) y (D), respectivamente. Los puntos rojos en estos paneles designan el SNP (C) y el gen (D) asociados a rasgos más significativos en cada análisis. En (D), el gen causal, T, está etiquetado y las flechas indican las direcciones en las que se transcriben los genes. Las flechas grises representan genes que no se expresan en las muestras de ARN utilizadas en el TWAS. E, diagramas de violín y diagramas de caja de expresión del T gen en líneas de soja con pubescencia gris y leonada. La unidad de expresión es TPM. Los gráficos de violín muestran las curvas de densidad de probabilidad de T expresión en dos grupos de líneas de soja, el ancho de la curva corresponde con la frecuencia aproximada de los valores de expresión en cada región. El recuadro de la gráfica de recuadro muestra los percentiles 25–75. La línea negra dentro del recuadro muestra que los bigotes medianos representan 1,5 veces los puntos del rango intercuartílico representan valores atípicos.

El GWAS detectó 80 SNP asociados a rasgos que abarcan un intervalo de ∼1,4 Mb (Chr06: 17,632,002-19,029,221) que incluye 68 genes anotados, uno de los cuales es el T lugar. Dentro de este intervalo, el SNP con el FDR más pequeño (Chr06-18468010) se encuentra 263 kb aguas arriba del T locusGlyma.06g202300 Figura 2C). De manera similar, tres GWAS anteriores informaron que el SNP más significativo tenía distancias de ∼100 a 600 kb desde el T locus y SNP asociados abarcaron intervalos de 2 a 4 Mb utilizando paneles de diversidad de 139 a 12,360 líneas (Sonah et al., 2015 Wen et al., 2015 Bandillo et al., 2017). Otra señal asociada a un rasgo detectada en nuestro GWAS (Chr06: 165-167 Mb) no se ha asociado previamente con este rasgo bien estudiado.

A diferencia de los resultados obtenidos a través de GWAS, el T gen fue el único gen asociado a rasgo identificado por TWAS dentro del intervalo de 1,4 Mb definido por los aciertos de GWAS (Figura 2D). T exhibe una expresión génica diferencial significativa (Welch dos muestras t prueba, PAG-valor 8E-7) entre líneas grises versus leonado (Figura 2E). Por lo tanto, a pesar de la existencia de LD local extenso (el LD promedio por pares entre estos 80 SNP asociados a rasgos es 0.8), TWAS identificó correctamente el gen causal (T) asociado con el color de la pubescencia.

Como se discutió anteriormente, el patrón de desintegración de LD afecta el poder de resolución de GWAS basado en SNP. De manera similar, el poder de resolución de TWAS sería limitado si los patrones de expresión de genes vecinos estuvieran altamente correlacionados, lo que podría resultar en señales falsas positivas, como se ha informado en TWAS humano (Wainberg et al., 2019 Mancuso et al. 2019) . Nosotros (Lin et al., 2017 Zheng et al., 2020) y otros (Kremling et al., 2019) no hemos observado este problema en el maíz. Si los patrones de expresión de los genes vecinos de Arabidopsis estuvieran altamente correlacionados, habríamos esperado identificar muchos genes estrechamente vinculados asociados con los rasgos de desarrollo recientemente analizados de esta especie (es decir, tiempo de floración y número de hojas). Pero éste no era el caso. Estos datos, por lo tanto, indican que TWAS se ve menos afectado por LD que GWAS, incluso en especies de LD alta.

Efecto de la selección de tejidos en TWAS

Los patrones de expresión génica difieren entre órganos, tejidos, entornos y etapas de desarrollo, lo que lleva a la cuestión de la importancia de identificar la fuente de secuencia de ARN adecuada para realizar TWAS para un rasgo determinado. Para abordar esta pregunta, utilizamos datos de secuencia de ARN de siete tejidos de maíz derivados de un panel de diversidad de plantas endogámicas de maíz (Kremling et al., 2018) para realizar TWAS para el color cualitativo del endospermo. Los fenotipos de color del endospermo están disponibles para 229 de las 300 endogámicas en este panel (Tablas complementarias S3 y S4). los endospermo amarillo1 (y1) y gorra blanca1 (wc1), que se sabe que regulan el color del endospermo (Buckner et al., 1996 Tan et al., 2017), tienen diversos patrones de expresión en los genotipos y tejidos analizados en este estudio (Figura 3).

Efectos de la fuente de tejido en los resultados de TWAS para el color del endospermo del maíz. A, parcelas de Manhattan de TWAS realizadas para el color del endospermo del maíz en cada uno de los siete tejidos, cada punto representa un solo gen. Los puntos grises adyacentes a wc1 designado GRMZM2G089421. Las líneas discontinuas horizontales designan el límite de significación de 0.05 FDR. Los triángulos rojo y azul representan los loci causales conocidos, y1 y wc1, respectivamente. Las distribuciones de los niveles de expresión del y1 (B) y wc1 (C) genes en líneas endogámicas con endospermos amarillo (amarillo) y blanco (gris). Las gráficas de densidad muestran la densidad de probabilidad en cada ancho de banda. La suma de densidades × ancho de banda es igual a 1.

Efectos de la fuente de tejido en los resultados de TWAS para el color del endospermo del maíz. A, parcelas de Manhattan de TWAS realizadas para el color del endospermo del maíz en cada uno de los siete tejidos, cada punto representa un solo gen. Los puntos grises adyacentes a wc1 designado GRMZM2G089421. Las líneas discontinuas horizontales designan el límite de significación de 0.05 FDR. Los triángulos rojo y azul representan los loci causales conocidos, y1 y wc1, respectivamente. Las distribuciones de los niveles de expresión del y1 (B) y wc1 (C) genes en líneas endogámicas con endospermos amarillo (amarillo) y blanco (gris). Las gráficas de densidad muestran la densidad de probabilidad en cada ancho de banda. La suma de densidades × ancho de banda es igual a 1.

Ambos y1 y wc1 los genes se asociaron con el color del endospermo a través de TWAS utilizando datos de expresión de los granos (Figura 3A). Se obtuvieron resultados similares utilizando datos de expresión de la base de la hoja. Además, el wc1 gen, pero no el y1 gen, se asoció con el color del endospermo cuando se utilizaron datos de expresión de dos tejidos adicionales, brote y raíz. Curiosamente, nuestra capacidad para detectar una asociación de y1 gen con color del endospermo utilizando datos de expresión de la base de la hoja se debió al hecho de que, en contraste con la situación en los granos, las líneas endogámicas que tenían endospermos blancos acumularon niveles más altos de y1 transcripción en el tejido de la base de la hoja que aquellos con endospermos amarillos (Figura 3B).

Para ampliar esta exploración, utilizamos los mismos siete conjuntos de datos de expresión para realizar TWAS en el rasgo del tiempo de floración, días hasta la antesis (DTA Peiffer et al., 2014). El número de consanguíneos para los que tanto los datos de expresión como los fenotipos varió de 191 a 258, con un promedio de 238 (Tabla complementaria S5). Un total de 24 genes únicos se asociaron con el tiempo de floración en los 7 TWAS con los más relajados. PAG-valor de corte de 1E-04 (Figura 4 Tabla complementaria S5). Se identificaron cuatro genes que se sabe que funcionan en la floración (Liang et al., 2019 Castelletti et al., 2020) en uno o más de los siete tejidos. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN MADS 69 (ZmMADS69) se identificó en tres de siete tejidos. Curiosamente, aunque el ZmMADS69-genes regulados, RELACIONADO CON APETALA2.7 y ZEA CENTRORADIALIS8, se identificaron utilizando datos de expresión de la punta de la hoja, ZmMADS69 per se no se identificó con este conjunto de datos. Al menos uno de los cuatro genes conocidos relacionados con la floración se detectó en cinco de los siete tejidos, incluidas la raíz y los granos, que obviamente no están asociados con el rasgo DTA. Dos de los 24 genes (ZmMADS69 y GRMZM2G430526) se identificaron en un conjunto de cinco genes asociados con DTA de otro TWAS que se basaba en los mismos datos fenotípicos, pero datos de expresión independientes (Lin et al., 2017). Esto es más superposición de lo esperado por casualidad (prueba exacta de Fisher unilateral, PAG-valor 2E-5). El análisis de los datos de expresión de múltiples tejidos, incluso algunos de los cuales parecerían no estar relacionados con la floración, detectó loci adicionales asociados con el rasgo DTA.

Genes de maíz asociados con DTA a través de TWAS. A, Relaciones reguladoras entre cuatro genes de floración conocidos (Liang et al., 2019 Castelletti et al., 2020) (B) los 24 genes identificados a través de TWAS identificados utilizando datos de expresión de siete tejidos. Los glóbulos rojos representan genes que se asociaron significativamente con el rasgo DTA en la fuente indicada de datos de expresión. Significativo PAG-Se indican los valores. Las celdas grises representan pruebas que no fueron significativas.

Genes de maíz asociados con DTA a través de TWAS. A, Relaciones reguladoras entre cuatro genes de floración conocidos (Liang et al., 2019 Castelletti et al., 2020) (B) los 24 genes identificados a través de TWAS identificados utilizando datos de expresión de siete tejidos. Los glóbulos rojos representan genes que se asociaron significativamente con el rasgo DTA en la fuente indicada de datos de expresión. Significativo PAG-Se indican los valores. Las celdas grises representan pruebas que no fueron significativas.

Para explorar más los efectos del uso de datos de expresión de tejidos no relacionados, se realizaron TWAS para 24 rasgos relacionados con carotenoides en granos (Owens et al., 2014) utilizando datos de expresión de plántulas de maíz (Hirsch et al., 2014). Aunque Owens et al. El conjunto de datos contiene concentraciones de carotenoides para más de 200 purasangre, datos de expresión de Hirsch et al. estaban disponibles solo para aproximadamente la mitad de estas muestras (Tabla complementaria S6). Usando un algo relajado PAG-valor de corte de los datos 1E-04 (consulte "Materiales y métodos") para controlar el número limitado de muestras (∼100), se identificaron 16 genes únicos asociados a rasgos para los 24 rasgos relacionados con carotenoides (Tabla complementaria S6) . GRMZM2G143202 (DEFICIENTE DE LUTEIN1) tuvo el más significativo PAG-valor (es decir, 5E-6) y codifica una proteína del citocromo P450 necesaria para la biosíntesis de la luteína (Tian et al., 2004). Otro gen de la familia del citocromo P450, GRMZM2G013357 se asoció con dos rasgos carotenoides, "β-criptoxantina / zeaxantina" y "provitamina A". GRMZM2G087207 participa en la actividad de la hidroximetilglutaril-CoA sintasa, que participa en el suministro de un precursor de la biosíntesis de β-caroteno (Qiang et al., 2020). Solo 1 de los 16 genes candidatos, es decir, DEFICIENTE DE LUTEIN1, identificado a través de TWAS también se detectó a través de un GWAS basado en el mismo conjunto de datos fenotípicos pero utilizando datos de casi el doble de consanguíneos (norte = 210), a pesar de que este GWAS identificó 58 genes candidatos (Owens et al., 2014). El éxito del uso de datos de expresión de plántulas para identificar presuntamente verdaderos positivos para los rasgos de carotenoides en los granos apoya aún más nuestra conclusión de que es posible usar datos de expresión de tejidos no relacionados para identificar genes causales a través de TWAS.


¿Cómo pueden exactamente los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) hacer posible identificar los genes predisponentes en enfermedades multifactoriales?

Este enfoque está impulsado por las nuevas tecnologías que permiten evaluar simultáneamente decenas o cientos de miles de polimorfismos, generalmente polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Esta técnica se aplica a un conjunto de casos (individuos con la enfermedad) y un conjunto de controles emparejados, y se evalúan las diferencias en las frecuencias de SNP entre los dos grupos para identificar los SNP que pueden estar asociados con la enfermedad. Con tantos SNP que se están probando, la situación es un poco complicada estadísticamente, ya que existe el peligro de asociaciones de falsos positivos, es decir, asociaciones que ocurren por pura casualidad y no porque el SNP esté relacionado con la enfermedad. Entonces, en general, la significancia se ajusta sobre la base de obtener una 'tasa de descubrimiento falso' del 5%; es decir, de todos los SNP denominados asociados con la enfermedad, se espera que solo el 5% sean SNP verdaderamente no asociados. mostrando una asociación por azar en las muestras.


Discusión

En este estudio, informamos la caracterización de la diversidad y homocigosidad en todo el genoma en la almendra, que se utilizaron para proporcionar información de gran interés para la investigación fundamental y fines de reproducción.

El cálculo de las distancias de IBS por pares resultó en la identificación de 11 grupos clonales (Cuadro complementario S2), proporcionando así datos valiosos para la racionalización de las colecciones de germoplasma. La composición de CG1 está de acuerdo con la literatura científica previa, lo que indica sinonimia entre los cultivares Tuono y Troito 37. No podemos excluir que algunos de los cultivares incluidos en el mismo GC puedan diferir para algunas mutaciones clonales. Con respecto a CG1, se informó anteriormente que el cultivar Supernova se derivó de “Tuono” por mutagénesis experimental 38.

Análisis de la estructura genética de la almendra asignados cultivares a cuatro poblaciones ancestrales (Fig. 1a), aunque se debe tener precaución al interpretar los resultados de agrupación de ADMIXTURE 39 . Los cultivares clasificados como mezclados, correspondientes a

El 20% del total, podría reflejar la hibridación entre diferentes poblaciones ancestrales. Generalmente se piensa que la almendra fue introducida en Italia por los antiguos griegos y fenicios 37, y desde allí se extendió a Francia y España, posiblemente a través de la expansión de los antiguos romanos en el área mediterránea. Sin embargo, la población italiana de almendras carecía casi por completo de la ascendencia C4, que era significativa para los acervos genéticos españoles y franceses. Esta evidencia puede explicarse por nuevas introducciones históricas de germoplasma de almendra en España y Francia, posiblemente del norte de África en relación con la dominación árabe de la Península Ibérica y el período colonial 37.

De acuerdo con investigaciones previas basadas en marcadores SSR 6,7,8, el estudio de la estructura de la población también indicó diferenciación genética entre cultivares mediterráneos y estadounidenses, estos últimos en su mayoría referidos al grupo ancestral C4 (Fig.1). Es muy probable que este resultado refleje el efecto fundador asociado con la reciente introducción de la almendra al Nuevo Mundo. Es importante destacar que el modelado de la migración utilizando el algoritmo TreeMix (Fig. 1d) indicó que el germoplasma francés jugó un papel importante como fuente parental para el mejoramiento de la almendra de California, de acuerdo con la literatura anterior 40,41,42.

La estimación de la EII por pares a través del parámetro PI_HAT indicó correctamente el parentesco para los pares de cultivares parentales / descendientes conocidos que se producen en la colección de almendras genotipada en este estudio, ya que estos se asociaron con valores que van desde 0,26 a 0,45. La discrepancia con el valor teórico de PI_HAT de 0,5 (es decir, el 50% de los alelos que se originan en los mismos cromosomas ancestrales) podría deberse a la violación del supuesto de apareamiento aleatorio utilizado para la estimación de PI_HAT 17 y la sub-denominación de loci heterocigotos asociados con el método GBS 43. Además de confirmar el parentesco conocido, el análisis de la EII reveló varias relaciones familiares que no se informaron en la literatura (Fig. 2 y Tabla complementaria S3). Este resultado, además de contribuir a descubrir el pedigrí del germoplasma cultivado de almendra, brinda información útil para evitar la hibridación de individuos emparentados en los programas de mejoramiento, minimizando así el riesgo de depresión endogámica.

Un gran grupo familiar estaba compuesto por varios cultivares estadounidenses, incluido el "Nonpareil". Esto es consistente con el uso recurrente de "Nonpareil", considerado como estándar para las características superiores de árboles y frutos secos, en los programas de mejoramiento de EE. UU. 14,44. Varios cultivares mostraron parentesco con CG1 y CG9, que contienen los cultivares italianos Tuono y Cristomorto, de acuerdo con el uso extensivo de estos dos cultivares en el mejoramiento como fuente de autocompatibilidad. Sorprendentemente, el cultivar italiano Rachelina, que no figura en los principales registros genealógicos, mostró el mayor número de relaciones de parentesco (22), no solo con el germoplasma italiano, sino también con los cultivares franceses Rabasse y Tournefort, y el cultivar ucraniano Picantili. La identificación de parentesco entre "Sultana" y "Texas" indica además el papel de las introducciones francesas como fundadores de los programas de cría de EE. UU. Sorprendentemente, "Sultana" se indicó anteriormente como uno de los pocos cultivares comerciales introducidos en California desde el área de Languedoc en el sur de Francia desde 1850 hasta 1900, lo que representa la base de la industria de la almendra de EE. UU. 37,41,45. Por último, el parentesco entre los cultivares ucranianos ("Crimsky", "Nikitsky", "Nessebre", "Picantili") y los cultivares de Italia y Estados Unidos es coherente con el uso de germoplasma extranjero en los programas de mejoramiento realizados en el Jardín Botánico Nikita de Ucrania 46, 47.

De manera similar al trabajo de Wu et al. 23, que se centró en cultivos Agrios especies, buscamos ROH para estimar el nivel de consanguinidad en cultivares individuales (Fig. 3a y Fig. complementaria S5). Se encontró una alta correlación entre el recuento de ROH por individuo y FPLINK coeficiente de consanguinidad (Fig. 3b). Sin embargo, destacamos que, a diferencia de los ROH, FPLINK es un estimador indirecto de F, basado en el aumento de la homocigosidad asociada con la EII. Varios cultivares estadounidenses se caracterizaron por un alto recuento y longitud de ROH, lo que indica un alto nivel de endogamia. Esto está de acuerdo con nuestro hallazgo de que ocurre un alto nivel de EII dentro del germoplasma de EE. UU. Por el contrario, Lansari et al. 14, basado en el FPAG coeficiente, concluyó que la mayoría de los cultivares de EE. UU. no son consanguíneos, posiblemente debido a la información pedigrí incompleta.

Se sabe que uno de los principales inconvenientes técnicos del GBS es la profundidad de lectura desigual entre las muestras 43. Para evaluar si esto generó un sesgo severo en los loci heterocigotos y, por lo tanto, en la llamada de ROH, realizamos un análisis de regresión entre la profundidad de lectura media por cultivar y el recuento de ROH por cultivar. Encontramos una correlación débil entre las dos variables, aunque dos cultivares, “Mono” y “Ramillete”, asociados con una profundidad de lectura media extremadamente baja, también mostraron el recuento de ROH más alto (Fig. S4 complementaria). Esto indica que: (1) con algunas excepciones, nuestro enfoque de GBS fue exitoso en la cuantificación del nivel de consanguinidad a través de la identificación de ROH (2) cuando están disponibles, las plataformas de matriz SNP, que permiten una llamada precisa de heterocigosidad, deberían preferirse sobre GBS para identificar ROH. Missing data did not have a major impact on ROH call, as most ROHs contained a low percentage of missingness (Supplementary Fig. S3).

Homozygosity mapping 31 , a strategy successfully used in animal science to associate ROHs with traits under anthropic selection 34,48 , was herein applied for the first time to a crop species. Our results defined IBD segments which could have arisen from selection for larger nuts and seeds. In addition, our data suggest that selection for larger nuts, while increasing the weight of the fruit endocarp (the almond shell), did not have a substantial effect on the almond edible part, i.e., the seed (Fig. 5). ROH_ 2_16414730, displaying the highest evidence of association with nut and shell weight, includes two members of the PLAC8 protein family, previously associated with fruit size in tomato, maize, and rice 49 (Supplementary Table S5). Concerning seed weight, an interesting candidate for future functional studies is a Cyclin D3 gene located within ROH_S6_20767156, as it was shown that D-type cyclins play a major role in seed development 50 .

In accordance with the results of HM, GWAS suggested that loci controlling nut weight and seed weight are mostly independent and that there is parallel control of nut and shell weight by several genomic loci (Fig. 6). Many of the GWAS peaks identified for these two traits were located within genes encoding transcription factors or response factors to the phytohormones abscisic acid, auxin and ethylene (Supplementary Table S6). These protein categories are renowned to be major players in fruit growth and development 51 , therefore they are obvious candidates to have a similar physiological role in almond. The highest significance level for nut and shell weight was found for a SNP variant located upstream of a putative aspartyl protease gene (Supplementary Table S6). Remarkably, the recent proteomic study by Rodriguez et al. 52 indicated that the development of the peach endocarp (corresponding to the almond shell), is accompanied by an outstanding variation of protein degradation enzymes, including aspartyl proteases. It is thought that amino acids derived from the degradation of proteins stored in the early immature fruit act as substrates for the phenylpropanoid and lignin pathways activated during endocarp hardening 53 .

Concerning seed weight, the association was found with a SNP residing in a gene putatively encoding a member of the thaumatin-like protein (TLP) superfamily (Supplementary Table S6). Although some of the TLP proteins have been related to biotic stresses, the role of most members of the TLP superfamily remains unknown 54 , thus it cannot be excluded they might also have a role in determining seed growth. With this respect, we highlight that some TLP proteins, referred to as permeatins, accumulate in high concentration in seeds of cereals 54,55 .

No overlap was found between genomic regions identified by GWAS and HM. It should be pointed out that GWAS and HM search for different kind of genomic associations, in the first case with a specific marker allele, and in the second with one or more combinations of alleles at the homozygous state. In addition, different results from the two approaches may arise from the different number of covariates used for association tests. We could not assess whether signals on the same chromosome identified by our study and the one of Fernandez i Marti et al. 24 are overlapping in the same genomic region, as the latter refers to a QTL linkage map obtained by a bi-parental population, rather than the almond genome sequence.

We found that almond displays one of the fastest LD decay ever characterized in a crop species, with R 2 dropping to the threshold value after 130 bp on average (Fig. 4). This might reflect self-incompatibility displayed by most almond cultivars, which favors haplotype block-breaking through recombination. From a genetic perspective, rapid LD decline in almond reinforces the possibility that SNPs identified by this or future GWAS experiments are located within or in close association with genes determining phenotypic variation.


A. Genome-Wide Association Studies (GWAS)

Association mapping identifies signals of marker-trait relationship that can be attributed to the strength of linkage disequilibrium between marker polymorphisms and functional variants across a set of diverse germplasm. General understanding of association mapping has increased significantly since its debut in plants. We have seen a more concerted effort in assembling various association-mapping populations and initiating experiments through either candidate-gene studies or genome-wide association stuides (GWAS).

Much of the basics in assocaition mapping has been reviewed thoroughly in a set of previous review papers and here are several of them for your reference:

A recent review from Peter Visscher and colleagues on GWAS, 10 Years of GWAS Discovery: Biology, Function, and Translation (American Journal of Human Genetics, 2017, 101:5-22). Here is the earlier one: Five years of GWAS discovery (American Journal of Human Genetics, 2012, 90:7–24).

Mixed Model GWAS

We are trying to understand this new one at this time: Quantitative Trait Cluster Association Test (QTCAT) for GWAS, A multi-marker association method for genome-wide association studies without the need for population structure correction


Unraveling behavioral problems in dogs

In this issue of Biología del genoma, Tang et al.[6] report the combination of GWAS and targeted sequencing to map obsessive-compulsive disorder (OCD) in dogs. The authors [6] cleverly transitioned from GWAS to the judicious use of next-generation sequencing to identify new OCD alleles. OCD is a common and debilitating neuropsychiatric disorder characterized by persistent intrusive thoughts and time-consuming repetitive behaviors. It is the fourth most common psychiatric disorder in humans, with a lifetime prevalence of approximately 2%. Twin studies demonstrate a strong genetic component, and first-degree relatives of an affected individual are at an increased risk of developing disease. A GWAS conducted with 1,465 human OCD cases and 400 family trios did not successfully uncover new disease-susceptibility loci [7], suggesting a highly complex underlying genetic architecture.

Canines also present with naturally occurring OCD, which can manifest as repetition of normal canine behaviors. The authors [6] reanalyzed data from an initial canine GWAS [8] promising regions of marginal significance were then selected for targeted sequencing in eight OCD dogs and eight controls [6]. In total, 2,291 case-only variants were discovered, of which a subset of 114 were found to be significantly more common in OCD-risk breeds when genotyped in an independent sample. Gene-based analyses revealed that cadherin 2 (CDH2), catenin alpha 2 (CTNNA2), ataxin 1 (ATXN1) and plasma glutamate carboxypeptidase (PGCP) harbored the most case-only variants these initial canine susceptibility loci, which are all reported to have synaptic functions, may also be associated with human OCD.


Linkage Disequilibrium in GWAS - Biology

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Fondo

Detailed analysis of the linkage disequilibrium (LD) structure of human populations has been vital for the successful mapping of many human disease genes, understanding mechanisms underlying genetic recombination and elucidating patterns of selection and population structure [1]. The development of array-based genotyping (ABG) panels of single nucleotide polymorphisms (SNPs) enabled genome-wide association studies (GWAS) to localise numerous genetic variants with roles in human disease. Recognition that the genome contains ‘blocks’ of low haplotype diversity [2] facilitated the selection of ‘tagging’ SNPs [3] to enable cost-effective genotyping using panels of 500,000 to one million SNPs. Extensive SNP genotyping enabled the International HapMap Project to characterise the LD structure of diverse human populations [1]. The first LD maps of human chromosomes showed a haplotype block structure punctuated by ’steps’ aligning with recombination hotspots [4, 5]. The strong alignment of linkage and LD maps confirms historical recombination as the major determinant of LD structure [5–7].

Array-based LD maps of human chromosomes contain regions with negligible apparent LD between adjacent markers, seemingly reflecting high regional recombination, which are not well defined in the maps. Service et al. [7] assessed the impact of increasing marker density in a number of these regions using ABG data and found that some, though not all, regions were resolved with increasing marker density. For chromosome 22, 53 % of these regions were resolved using 27,060 vs. 9658 SNPs. Differences between populations were apparent, with LD maps from isolated populations (therefore having more extensive LD) containing substantially fewer such regions. Tapper et al. [6] constructed genome-wide LD maps using

500,000 SNP genotypes from 60 HapMap samples with European ethnicity, identifying 3144 poorly resolved regions genome-wide and estimated that

40,000 markers per Morgan would be needed to fully characterise LD structure. Assuming the autosomal linkage map length is

33 Morgans [8] this suggests that

1.3 million SNPs genome-wide would be sufficient to resolve these regions in this population. However, this assumes uniform marker spacing and LD intensity, whilst in reality much higher local marker density may be required for some of these regions. A particular difficulty exists for populations which have reduced LD due to extended population history, such as those from Sub-Saharan Africa, for which considerably higher marker coverage is required for complete coverage.

Given that whole-genome next generation sequencing (WGS) provides maximal genotype density, we consider the advantages of WGS-derived SNP genotypes for the characterisation of LD structure in different populations. We construct LD maps according to the Malécot-Morton model, using the program LDMAP [5, 6]. This model is defined as:

where ( widehat

) is the association between SNPs, the asymptote L is the ‘background’ association between unlinked markers which is increased in small sample sizes and with residual population structure, METRO reflects association at zero distance with values

1 consistent with monophyletic origin and <1 with polyphyletic inheritance, ϵ is the rate of LD decline, and D is the physical distance in kilobases between SNPs [5].

LDMAP constructs maps in linkage disequilibrium units (LDU, equal to ϵD) such that one LDU corresponds to the (highly variable) physical distance over which LD declines to background levels. LDU plotted against the chromosome location forms step-like patterns with intense breakdown in LD, canonically due to recombination hotspots, and plateaus for broader regions of low haplotype diversity (blocks). Overall LDU map lengths are proportional to time since an effective population bottleneck [7, 9]. Hence, populations with shorter LDU maps have been founded more recently, experienced a more recent selective sweep, or have a smaller effective population size (such as some population isolates) compared to those with longer maps (such as Sub-Saharan African populations). The close correspondence between LD patterns and the linkage map reflects the dominant role of recombination in LD structure. In contrast to linkage maps, which are derived from family data and describe recombination over recent generations, LD maps are constructed from population data and reflect the historical impacts of recombination, mutation, selection and population history. Our findings show that WGS based LD maps provide greatly increased resolution of LD structure in both populations and indicate some genome regions in ABG-derived maps are incompletely covered. The findings have implications for interpretation in genome-wide association studies (GWAS) and support the use of WGS for association mapping and for establishing LD structure for studies of mechanisms underlying recombination and for identifying genomic regions subject to selection.


Understanding GWAS: Part 2 – Additional Insights and Tips

This blog post was written by members of the GP2 Complex Disease - Data Analysis Working Group: Hampton Leonard, Mike Nalls, Yeajin Song, and Dan Vitale. Continue reading for more information on the authors.

In our last blog post , we gave an introduction to GWAS, including statistical formulae, workflows, and examples from the most recent Parkinson’s disease GWAS. Now we want to provide you with additional insights and tips for running your own GWAS.

Quality control and imputation processes

  • High quality genotypes (non-palindromic, i.e., no A/T, G/C if possible, with a high Illumina gentrain score indicating cluster quality) with low missingness ( < 1% per sample and per SNP is preferred).
  • Generally focus on common, minor allele frequency > 1%, any less and hope the genotype clusters look very good (you should inspect them).
  • Check samples for high rates of heterozygosity, as this could indicate potential contamination. Low rates of heterozygosity could also be problematic.
  • Be careful of duplicated samples and cryptically related samples.
  • Algorithmically ascertain and parse samples by genetic ancestry (we use a combination of fastStructure and flashPCA ). Let’s maximize diversity but be wary of population substructure and its effects on the outcomes of analyses.
  • Look into SNPs that are not missing by chance, including bias due to missingness by case:control status or haplotype.
  • There is no reason you can’t use multiple imputation reference panels for a single population and use the resulting genotype with the best quality metric. This is particularly useful in admixed sample populations.

Tips on study level analyses

  • Regression – GWAS generally uses linear regression models for continuous outcomes and logistics for discrete outcomes. These quantify risk at an SNP while accounting for covariates.
  • A variety of software packages can be used to run mixed linear models, these models can accurately account for relatedness and fine scale population substructure.
  • PCs – Calculating principal component loadings based on genome-wide genotyping data makes a useful set of covariates for your regression models, effectively allowing you to account for population substructure.

Now let’s meta-analyze

  • Fixed vs. random – These are meta-analysis methods to combine data on a summary statistic level, across data silos and/or publications. Fixed effects meta-analyses are often useful for discovery analyses and generally more powerful, although some of us prefer random effects models as they are more conservative and account for heterogeneity across data silos.
  • Heterogeneity estimates – Often expressed as Cochrane’s Q or I2. Very important as they give an idea of outlier effect bias and generalizability of results.

Scrutiny results

  • Study level lambdas – keep it between 0.95 and 1.05, anything else and you have a problem.
  • Overall lambda and lambda 1000 – calculating lambdas on either the study level or the meta-analysis level can be tricky when you have a case: control imbalance. A massive excess of controls can artificially inflate the lambda statistic. In this case, use lambda1000 as it is scaled to 1000 cases and 1000 controls. Once again, code for this is in our GitHub repo.
  • Linkage disequilibrium (LD) score intercept – alternative / complement to lambda and more robust to LD structure and case: control imbalance.
  • LD peaks in plots showing uniformity – this is pretty straightforward, your results when plotted should look like towers in Manhattan (or your city of choice, sorry D.C.) not a snowstorm.
  • Replication – always good but sometimes you don’t have available datasets. When additional data is not available, try a combination of leave-one-out meta-analyses and cross-validation.

Some post-GWAS analyses

  • Or “what to do once your GWAS meta-analysis is complete”. Note that GP2 will be providing further blog posts and courses on these topics.
  • Conditional analyses – use the most significant SNP in a region as a covariate and rerun the analyses or use a tool like GCTA . You may have multiple independent signals per locus.
  • Fine mapping – This can be done through approximate Bayes factor analysis in packages like coloc including Bayesian colocalization (leveraging genomic reference data for gene expression or similar metrics).
  • Prediction weights and TWAS – A variety of packages exist to leverage external weights from gene expression, methylation, or chromatin studies, etc. to identify putative mechanistically connected genes hiding in your GWAS data.
  • ML – Purpose-built predictions, our favorite package is GenoML because it’s mostly automated and makes machine learning (ML) in genomics easy.

For more information, you can find our code and pipelines at the GP2 GitHub .

This blog was jointly authored by Hampton Leonard, Mike Nalls, Yeajin Song, and Dan Vitale. Please visit GP2’s Complex Disease – Data Analysis Working Group page to learn more about their background.


Ver el vídeo: Equilibrio del ligamiento.. UPV (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Treyton

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  2. Vikasa

    Estas equivocado. Escríbeme por PM, hablamos.

  3. Aurelius

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