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Hematuria por óxido nítrico

Hematuria por óxido nítrico


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No se esperan interacciones medicamentosas entre el NO correctamente dosificado y otros medicamentos, pero los efectos secundarios pueden incluir respiración ruidosa, hematuria, o posiblemente atelectasia. (n. ° de página: 577; Goodman and Gilman Pharmacology 13e)

¿Cuál es la base de esta hematuria? ¿Es debido a la actividad inhibidora de plaquetas del óxido nítrico?


Hematuria por óxido nítrico - Biología

La hematuria se conocía como un sello benigno de algunas enfermedades glomerulares, pero durante la última década, nuevas evidencias señalaron sus implicaciones negativas en la progresión de la enfermedad renal. Los efectos citotóxicos del estrés oxidativo inducido por la hemoglobina, el hemo o el hierro liberado de los glóbulos rojos pueden explicar la lesión tubular observada en las muestras de biopsia humana. Sin embargo, los mecanismos precisos responsables de la hematuria siguen sin estar claros. La presencia de glóbulos rojos (glóbulos rojos) con contornos y formas irregulares en la orina indica la salida de glóbulos rojos del capilar glomerular al espacio urinario. Por tanto, la hematuria glomerular puede ser un marcador de disfunción o daño de la barrera de filtración glomerular. En esta revisión describimos algunos aspectos clave relacionados con la epidemiología y patogénesis de las enfermedades hematúricas, así como sus hallazgos morfológicos renales.

Consejo básico: Los avances recientes sugieren que la hematuria glomerular puede ser un factor pronóstico negativo para el resultado de la función renal. Una barrera de filtración glomerular (GFB) más frágil y que se rompe fácilmente puede ser responsable del sangrado glomerular. Se han asociado varios factores a este proceso patógeno, que incluyen: (1) alteración genética de los componentes de GFB, que conduce a una estructura de GFB más frágil y que se rompe fácilmente (2) depósito aberrante de moléculas tóxicas en el GFB y (3) mejora de la respuesta inflamatoria, como se informa en enfermedades autoinmunes, infecciones o glomerulonefritis primaria. En esta revisión describimos en detalle estos mecanismos patológicos, con especial interés en las enfermedades hematúricas y sus hallazgos morfológicos renales.

  • Citación: Yuste C, Gutierrez E, Sevillano AM, Rubio-Navarro A, Amaro-Villalobos JM, Ortiz A, Egido J, Praga M, Moreno JA. Patogenia de la hematuria glomerular. Mundo J Nephrol 2015 4(2): 185-195
  • URL:https://www.wjgnet.com/2220-6124/full/v4/i2/185.htm
  • DOI:https://dx.doi.org/10.5527/wjn.v4.i2.185

La hematuria es una característica de presentación frecuente de las enfermedades renales y urológicas. Se describe como la presencia de más de 2 glóbulos rojos (RBC) por campo de gran aumento en el sedimento urinario. Cuando la presencia de glóbulos rojos en la orina es masiva, el color de la orina es rojo y se denomina hematuria macroscópica. La hematuria microscópica (HM) se detecta mediante examen microscópico o tira reactiva, por lo que se desconoce su incidencia real [1,2]. Según su origen la hematuria puede ser glomerular o no glomerular, sin embargo en esta revisión nos centraremos exclusivamente en la hematuria glomerular por sus implicaciones en el pronóstico renal. Los mecanismos patogénicos precisos responsables de la hematuria glomerular siguen sin estar claros. Sin embargo, la identificación del defecto molecular específico responsable de diferentes trastornos genéticos comúnmente asociados con la hematuria ha puesto de relieve posibles mecanismos. Estas enfermedades genéticas originan el daño de la barrera de filtración glomerular (GFB), lo que lleva a una estructura más frágil y que se rompe fácilmente. A veces, por alteración directa de la membrana basal glomerular (MBG) [como se informó en el síndrome de Alport (AS), nefropatía por membrana basal delgada (TBMN) o angiopatía hereditaria, nefropatía, aneurismas y síndrome de calambres musculares (HANAC)] o estructura de podocitos [Miosina enfermedad renal asociada a cadena pesada 9 (MYH9)], y otros por depósito aberrante de compuestos tóxicos como en trastornos de almacenamiento (glomerulopatía por fibronectina, glomerulonefritis inmunotactoide y fibrilar). Las mutaciones genéticas heredadas también pueden conducir a una regulación anormal de la vía alternativa del complemento y, por lo tanto, al depósito glomerular C3 [glomerulopatías C3 como nefropatía de la proteína 5 relacionada con el factor H del complemento (CFHR5) o enfermedad por depósito denso], lo que induce una potente respuesta inflamatoria que da como resultado la formación de fagocitos. quimiotaxis, con opsonización y lisis de células que pueden explicar fácilmente la hematuria. La hematuria también puede ser producida por estado inflamatorio como se reporta en enfermedades autoinmunes [anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA), vasculitis, enfermedad de GBM, lupus eritematoso sistémico o crioglobulinemia], infecciones (glomerulonefritis endocapilar) o glomerulonefritis primaria [nefropatía por IgA (IgAN) , Membranoproliferativo, Crescentic] (Tabla 1). En esta revisión describiremos los mecanismos moleculares responsables de los hallazgos histopatológicos en estas enfermedades para explicar la patogenia de la hematuria y su relación con la evolución renal.

Capa de células endoteliales glomerularesTrastornos de GBMDepósitos mesangialesTrastornos del diafragma de hendidura podocitarioDepósito subendotelial / subepitelialOtros
ANCAPrimarioIgANEnfermedad MYH9GN primarioWRN
EndocapilarAlportHSPEnfermedad de FabryMBPSCD
TBMDEndocapilar
HANACMedia luna
? LPHS
GN secundario
SecundarioLES
Enfermedad anti-GBMCrioglobulinemia
Glomerulopatía C3
Nefropatía por CFHR5Depósito fibrilar
Fibronectina
Fibrilar
Inmunotactoide

La hematuria se ha considerado tradicionalmente como un sello distintivo de algunas enfermedades glomerulares, sin repercusión en la función renal a corto y largo plazo [3]. Sin embargo, durante la última década, nuevas evidencias reportaron implicaciones pronósticas negativas para la hematuria microscópica [4] y macroscópica [5] en la progresión de la enfermedad renal. Así, Vivante et al[4] informó que la hematuria microscópica aislada asintomática persistente en 1 millón de adultos jóvenes israelíes se asoció significativamente con un mayor riesgo de enfermedad renal en etapa terminal (ERT) después de 22 años de seguimiento. Además, la hematuria glomerular persistente en donantes de riñón se ha asociado con un mayor riesgo de proteinuria y progresión de la enfermedad renal 2,3 años después de la donación [6].

La lesión renal aguda (IRA) es una complicación común de la hematuria macroscópica grave, con una incidencia de alrededor del 30% en pacientes con NIgA con brotes de macrohematuria macroscópica [7,8] y alrededor del 20% en la nefropatía relacionada con warfarina (WRN) [9]. Guti & eacuterrez et al[5] informó que alrededor del 25% de los pacientes con NIgA no recuperaron la creatinina sérica basal después del cese de la LRA asociada a hematuria macroscópica. En este estudio, la duración del episodio macroscópico fue el factor pronóstico más importante que determinó la recuperación incompleta de la función renal. De manera similar, en la nefropatía por CFHR5, casi todos los pacientes varones que alcanzaron la ERT tuvieron episodios de episodios de hematuria macroscópica después de infecciones del tracto respiratorio superior en la infancia y la adolescencia [10].

Las pautas renales más importantes, Kidney Disease Outcomes Quality Initiative y Kidney Disease: Improving Global Outcome ofrecen un consejo contradictorio sobre el tratamiento de la hematuria. Estas directrices recomiendan evaluar a todos los pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) con tira reactiva [11,12], pero la hematuria no se reconoce como un factor de riesgo de progresión de la ERC y no recomiendan un seguimiento o tratamiento adicional en pacientes con glomerulonefritis con hematuria microscópica aislada [13 ]. Sin embargo, reconocen que la NIgA con hematuria y proteinuria mínima es una enfermedad progresiva [14], lo que indica que, aunque el resultado clínico de muchos pacientes hematúricos es bueno, el riesgo de por vida de los pacientes con ERC puede ser elevado según la enfermedad subyacente específica.

Los datos clínicos y las evidencias de la investigación básica sugieren que la hematuria induce daño renal. La necrosis tubular aguda y los cilindros de eritrocitos obstructivos intraluminales son los hallazgos histológicos más característicos de la LRA durante la hematuria macroscópica. El principal mecanismo de daño es la toxicidad tubular directa de la hemoglobina (Hb), el hemo, el hierro u otras moléculas liberadas por los glóbulos rojos. Se ha propuesto que el paso de los glóbulos rojos a través del GFB induce la distorsión del citoesqueleto de eritrocitos, que es incapaz de mantener la integridad celular, lo que conduce a la ruptura de los glóbulos rojos. Como consecuencia, las moléculas tóxicas normalmente se bloquean dentro del citoplasma RBC y rsquos, como Hb, hemo o hierro, se liberan en el espacio urinario.

La Hb es internalizada en la célula tubular epitelial por el complejo megalina / cubilina. La Hb en las condiciones oxidantes de las células epiteliales se disocia en hemo y globina. La hemo oxigenasa-1 (HO-1) cataliza la conversión de hemo en biliverdina, hierro y monóxido de carbono [15]. En ese momento, la bilirrubina reductasa convierte la biliverdina en bilirrubina y el hierro se almacena como ferritina (Figura 1). HO-1 ahora se reconoce como una molécula protectora con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias contra diversas agresiones en diferentes tejidos [16].

El hemo libre también es extremadamente tóxico. En el plasma y las membranas intracelulares, el hemo puede oxidar los lípidos, desnaturalizar las proteínas y perturbar la integridad celular [17]. En grandes cantidades, el hemo puede ser una fuente de hierro que impulsa la lesión oxidativa después de las agresiones hipóxicas y nefrotóxicas [18]. Indirectamente, el hemo también puede inducir daño renal por sus efectos proinflamatorios, como la inducción de quimiocinas como la proteína quimioatrayente de monocitos 1 a través del factor de transcripción NF-KB sensible a redox [15]. El grupo hemo de la hemoglobina también puede disminuir la disponibilidad de óxido nítrico, promoviendo la vasoconstricción intrarrenal y la isquemia [19]. Por último, otro posible mecanismo implicado en el daño de la hematuria puede estar asociado a un retraso en la eliminación dismórfica de eritrocitos y rsquos, lo que puede explicar el prolongado período de recuperación en pacientes con IRA inducida por macrohematuria.

La presencia de glóbulos rojos dismórficos con contornos y formas irregulares en la orina es casi patognomónica de hematuria glomerular [20] e indica la salida de glóbulos rojos del capilar glomerular al espacio urinario. Por tanto, la hematuria glomerular es un marcador de disfunción o daño de GFB [21].

GFB es una estructura extremadamente compleja y especializada [22,23], con diferentes constituyentes y tipos de células, lo que permite una libre permeabilidad al agua, solutos plasmáticos pequeños y medianos, pero mantiene una selectividad altamente especializada para proteínas y moléculas más grandes de acuerdo con el tamaño y peso molecular [24]. GFB tiene cinco componentes principales: (1) desde el lado vascular, la capa superficial endotelial, una red compleja de glicosaminoglicanos que cubre la capa endotelial así como las fenestraciones (2) la célula endotelial (3) el GBM (4) los podocitos con su procesos interdigitantes del pie y uniones intercelulares especializadas, los diafragmas ldquoslit y (5) finalmente en el lado urinario, el espacio de subpodocitos, un área delimitada entre el cuerpo de la célula podocitaria y los procesos del pie (Figura 2). Además, la célula mesangial también contribuye indirectamente a la estructura de GFB regulando y apoyando el flujo sanguíneo y la estructura capilar glomerular, además de controlar el recambio de la matriz mesangial (Figura 2). La integridad de GFB se mantiene mediante una interacción compleja de interacciones de señalización entre los tres tipos de células constituyentes [24 - 26].

Se ha pensado que en condiciones fisiológicas, el endotelio con sus fenestraciones (50-100 nm) actúa como un tamiz de tamaño molecular, autosuficiente para mantener los glóbulos rojos (6.2-8.2 & mum) alejados del GBM. Sin embargo, la hematuria en algunas enfermedades como TBMN, enfermedades por depósitos fibrilares o enfermedad renal asociada a MYH9 con endotelio típicamente intacto, destacó el papel integrador clave del complejo GFB como tamiz de glóbulos rojos. Por lo tanto, no está claro cómo los glóbulos rojos, 100 veces más grandes que el endotelio glomerular y el poro rsquos, cruzan el GFB. Es posible que una capa de GFB dañada pueda liberar señales inflamatorias o quimiotácticas que promuevan el paso de los glóbulos rojos a través de esta capa; sin embargo, los mecanismos específicos aún no se han descubierto.

Según su localización primaria e histopatológica, los trastornos hematúricos se pueden clasificar en: (1) Lesiones de las células endoteliales glomerulares y de la capa superficial (2) Trastornos primarios y secundarios de GBM (3) Enfermedades con depósito mesangial (4) Enfermedades con depósito subendotelial y subepitelial ( 5) Trastornos asociados a podocitos y (6) Varios (Tabla 2).

EnfermedadDefecto molecularPredominioDefecto glomerular principal Expresión clínica
HematuriaProteinuriaProgresión de la ERC
Trastorno genético
Daño estructural de GFB
Daño estructural de GBM
ALPORTLigado al X: COL4A5 AR: COL4A3 / COL4A41/50000GBMMHVariable100% aproximadamente 20-30 años
TBMDCOL4A3 / COL4A41%GBMMHGeneralmente ausente20% ERC
HANACCOL4A13 familiasGBMMH o brutoNo descritoVariable
Daño estructural a los podocitos
MYH9Cadena pesada de miosina IIA no muscular1:100000NingunoMHVariableESRD en la edad adulta joven
Trastornos de almacenamiento
Fibronectina GNFibronectina44 casosMesangial / subendoth60% HM93% grado variableESRD a los 20-60 años
FibrilarFibrillas de 10-30 nmRaroMesangial / GBMMH 47% -73% Bruto 5%Presente 41% -55% nefrótico50% ESRD en pocos años
Inmunotactoide& gt fibrillas de 30 nm10 veces más raro que FGNMesangial / subepith / subendothMH 80%100%17% ESRD en 3 años
Enfermedad de Fabry y rsquosAlmacenamiento lisosómico1:3100- 1:1600Todas las celdasMHGeneralmente nefróticoESRD después de los 50 años
Complemento mediado
Glomerulopatía C3Vía alternativa1-2 y tiempos 10 6 Mesangial / GBMMH 87%38%Variable
Trastornos inflamatorios
Autoinmune
ANCAAb vs endotelio10-20 y tiempos 10 6 EndotelioMHVariableVariable
Anti GBMAb vs COL40.5-1 y veces 10 6 / añoGBMMHVariableVariable
Infecciones (endocapilares)
GN primaria (NIgA, membranoproliferativa, semiluna)
IgANIgA1 deficiente en galactosa10%-16%MesangialMH siempre 75% brutoProteinuria habitual nefrótica rara20% ESRD 20 años después del diagnóstico
Diverso
WRNDesconocido16,5% sin ERC 33% ERCNingunoGeneralmente MHNingunoProgresión acelerada de la ERC
LPHSDesconocidoDesconocidoGBM (?)MH o brutoAusente o mínimoTFG y GT 60

A pesar del tamaño relativamente grande de las fenestraciones endoteliales glomerulares, juegan un papel importante en la selectividad de la permanente GFB debido a su capa de glicocáliz de recubrimiento, compuesta principalmente por proteoglicanos [27]. El glucocáliz de células endoteliales glomerulares y su capa superficial asociada retienen más del 95% de las proteínas circulantes.

La capa endotelial glomerular es el principal objetivo de los ANCA, que atacan a los vasos pequeños y causan vasculitis, lo que lleva a una glomerulonefritis necrotizante y en media luna. Las vasculitis ANCA presentan una incidencia anual global de aproximadamente 10-20 casos / millón de personas, con un pico de edad de inicio de 65-74 años [28]. ANCA puede inducir la producción y liberación de especies reactivas de oxígeno y enzimas líticas por neutrófilos infiltrados [29], sistema del complemento vía la vía alternativa [30], así como las células endoteliales como un circuito de enfermedad de amplificación, lo que resulta en la lisis del endotelio [31]. En estadios iniciales de vasculitis-ANCA, la lesión endotelial podría explicar el inicio de la hematuria, aunque en estadios avanzados podría explicarse por una alteración severa de GFB que generalmente afecta a todas sus capas. Aunque la hematuria se ha considerado clásicamente un marcador de la actividad de la lesión glomerular en los ANCA, un informe reciente no mostró repercusión de la hematuria persistente (determinada por tira reactiva) en la TFG al año [32]. Sin embargo, en este estudio, la hematuria persistente se asoció a un estado basal de FG y ANCA bajos.

También se ha informado daño de las células endoteliales en la glomerulonefritis endocapilar (GN) y la GN asociada a infecciones. Con una incidencia decreciente en las últimas décadas en los países desarrollados [33], la GN endocapilar es ahora más frecuente en pacientes frágiles, como ancianos, alcohólicos y usuarios de drogas intravenosas [34]. La presentación típica es síndrome nefrítico o insuficiencia renal aguda 15 días después de una infección [35], en la que casi siempre hay hematuria. Aunque el pronóstico es excelente para los niños, en el 20% -74% de los adultos persiste la insuficiencia renal [34 - 37]. Los complejos inmunes producidos en el lugar o depositados de la circulación inducen una respuesta inflamatoria grave que da como resultado la quimiotaxis de los neutrófilos y la hipercelularidad endocapilar, lo que da lugar a hematuria. La GN endocapilar se ha propuesto recientemente como una glomerulopatía C3, porque el antígeno nefrogénico desencadena la activación de la vía alternativa del complemento.

Como se informó anteriormente, GBM tiene un papel clave en la permeabilidad de la barrera de filtración glomerular. El GBM está compuesto por una densa malla gelatinosa de colágeno tipo IV (COL4) y laminina, junto con proteoglicanos sulfatados. Las causas de la lesión de GBM se pueden clasificar en los trastornos de GBM primarios, como las nefropatías del colágeno y las enfermedades secundarias de GBM, incluidas las enfermedades con GBM como objetivo.

Trastornos primarios de GBM: Las nefropatías de colágeno son los principales trastornos de GBM primarios. El colágeno tipo IV es el componente principal de la GBM, por lo que sus mutaciones producen mallas anormales que enrollan la triple hélice del colágeno. Las enfermedades asociadas al colágeno tipo IV son los trastornos hereditarios más comunes que se presentan con hematuria microscópica aislada resultante de mutaciones en los genes del colágeno tipo IV [38], especialmente en sus cadenas alfa 3 (COL4A3) y 4 (COL4A4) [39].

AS fue el primer trastorno del colágeno GBM caracterizado. La EA tiene una prevalencia de 1 caso / 50 000 nacidos vivos [10]. El 85% de los casos de SA se deben a mutaciones ligadas al cromosoma X en la cadena de colágeno & alpha5 (COL4A5), mientras que el 15% restante se debe a mutaciones autosómicas recesivas en COL4A3 o COL4A4, aunque una minoría de casos se ha descrito como mutaciones esporádicas autosómicas dominantes . La EA ligada al cromosoma X se caracteriza por hipoacusia neurosensorial, anomalías oculares y nefropatía progresiva. Estas alteraciones son más graves en los varones. El Alport autosómico reccesivo tiene las mismas características clínicas que la EA ligada al cromosoma X, con un deterioro de la ERC más agresivo y temprano (la edad media en la ERT es de 21 años [40]) sin preferencia de género y con padres típicamente asintomáticos relacionados genéticamente. La microscopía electrónica muestra engrosamiento y adelgazamiento de GBM, además de división y laminación de la lámina densa [41].Estas alteraciones dan como resultado una expresión persistente de COL4A1 y COL4A2 fetal, siendo frágiles y sensibles a las proteasas, lo que permite la egresión de los eritrocitos en el espacio urinario y, por tanto, la microhematuria persistente. La microhematuria persistente es más frecuente en niños, a menudo con episodios de hematuria macroscópica, lo que sugiere un factor desencadenante exacerbado sobre este GBM crónicamente dañado, aunque este agente promotor aún no ha sido identificado. Es importante destacar que la función renal disminuye progresivamente a ERT antes de la cuarta década en el 90% de los pacientes [42,43].

Mutaciones heterocigotas en el COL4A3, COL4A4 o COL4A5 los genes producen TBMN. TBMN tiene una incidencia del 1% y se caracteriza por un GBM & lt 150 nm. El GMB ligeramente más compacto, debido a la falta de moléculas no colágenas, es más frágil, lo que podría explicar la hematuria aislada persistente. La presentación típica de TBMN y rsquos incluye microhematuria y proteinuria mínima o nula, con tasa de filtración glomerular y presión arterial normales. Sin embargo, evidencias recientes mostraron un pronóstico peor de lo que ha sido [44], donde la microhematuria progresa a proteinuria, a quistes renales [45] y a ERC en el 26,6% de todos los pacientes, y en el 48% de todos los pacientes & gt 50 años [10,46].

El síndrome HANAC es una enfermedad sistémica de la membrana basal extraordinariamente infrecuente, debida a una mutación heterocigótica en COL4A1[47]. El síndrome de HANAC puede presentarse con episodios micro o macroscópicos, relacionados o no con una tasa de filtración glomerular alterada y / o quistes renales. La ERT aún no ha sido descrita probablemente debido al bajo número de pacientes reportados hasta la fecha. La microscopía electrónica mostró engrosamiento y división en las membranas basales (incluidos los túbulos, capilares y GBM) [48]. Los episodios de hematuria micro y macroscópica pueden ser el resultado de la remodelación anormal de la matriz extracelular y la composición alterada de todas las membranas basales [47].

Aunque el síndrome de hematuria por dolor lumbar (LPHS) no es una nefropatía del colágeno, lo incluimos aquí debido a sus similitudes con las características histolopatológicas de TBMN y AS. Más frecuente en mujeres (70%), el LPHS se presenta con hematuria recurrente hacia la tercera década de la vida. La microscopía electrónica mostró MBG anormalmente delgado o grueso [49]. Se ha propuesto que las anomalías en la GBM permiten que los glóbulos rojos se filtren al espacio urinario y provoquen obstrucción intratubular y coágulos. La obstrucción intratubular podría inducir edema intersticial e hipertensión intraglomerular que origina una mayor hemorragia glomerular.

Trastornos secundarios de GBM: Algunos trastornos atacan a la GBM, como la enfermedad anti-GBM y la glomerulopatía C3. La enfermedad anti-GBM se caracteriza por autoanticuerpos contra el dominio no colágeno 1 de la cadena alfa3 del colágeno tipo IV. La enfermedad anti-GBM muestra una incidencia de 0,5 a 1 caso / millón de personas por año [50]. Se ha propuesto que la enfermedad anti-GBM podría desencadenarse en pacientes genéticamente predispuestos (alelo HLA-DRB1 * 1501 y genes de las familias FCGR y KLK [51]) por factores de inmunidad ambientales o celulares / humorales. Estos autoanticuerpos atacan al GBM alterando su estructura intrínseca, explicando la hematuria casi siempre presente, con síndrome nefrítico y glomerulonefritis semilunar.

Por otro lado, la glomerulopatía C3 introducida recientemente, como una patología glomerular con acumulación de C3 sin depósito significativo de inmunoglobulinas [52]. La glomerulopatía C3 se ha asociado clínicamente a hematuria, proteinuria y diferentes grados de disfunción renal [53]. La glomerulopatía C3 es secundaria a una regulación aberrante de la vía alternativa del complemento, ya sea genética o adquirida. Las glomerulopatías C3 incluyen enfermedad de depósitos densos (DDD), glomerulonefritis C3 y factor H del complemento (CFHR) mutaciones de genes [54], como híbridos CFHR3-1 gen y una duplicación interna dentro del CFHR5 gen [55]. La incidencia de glomerulopatía C3 y rsquos se ha estimado en 1-2 casos / millón de personas, independientemente del sexo, aunque se ha informado de una mayor gravedad en varones. La DDD se caracteriza por un depósito denso intramembranoso, lineal, hiperosmiófilo en la lámina densa, restringido a las membranas basales tubulares y capsulares de Bowman & rsquos. Se observa hematuria en el 87% de los casos, principalmente hematuria microscópica (68%) [53] y que persiste durante el seguimiento. La hematuria puede explicarse por la alteración de la MBG, aunque también se han descrito depósitos mesangiales, subendoteliales y subepiteliales [53]. Dos evidencias sugirieron el papel de una infección que desencadena glomerulopatías C3, en primer lugar, la concurrencia de episodios macroscópicos de hematuria con infecciones del tracto respiratorio superior en la nefropatía por CFHR5 [54], y en segundo lugar, los títulos elevados de antiestreptolisina-O (una sustancia producida por la bacteria Streptococcus del grupo A) en la glomerulopatía C3 [53]. Aunque la proteinuria se ha señalado como el factor pronóstico más importante, en la cohorte de Athanasiou [56] todos los pacientes que alcanzaron la ERT presentaron episodios de hematuria macroscópica asociados con fiebre, infecciones del tracto respiratorio superior en la infancia y la adolescencia.

La NIgA es la causa más común de hematuria glomerular. La NIgA tiene una prevalencia incierta (10-16%) [57] y se caracteriza por la presencia de hematuria microscópica aislada persistente, con episodios macroscópicos ocasionales asociados a infecciones del tracto respiratorio superior o gastrointestinal. La hematuria puede ir acompañada de proteinuria, a veces en el rango nefrótico. Aunque se ha considerado benigno, casi el 20% de los pacientes desarrollan ERT dentro de los 20 años posteriores al diagnóstico [58 - 61]. La hipercelularidad mesangial es el hallazgo histológico habitual, siendo el grado de fibrosis intersticial y atrofia tubular los predictores más fuertes del resultado renal [62]. Sin embargo, el papel de la hematuria y rsquos sobre el resultado de la NIgA no se ha abordado adecuadamente. Los episodios de hematuria macroscópica tienen implicaciones negativas sobre el pronóstico a largo plazo [5] y, aunque se ha informado que el pronóstico de los pacientes con NIgA con HM aislada es bueno, casi el 50% de la cohorte más grande presentó remisión espontánea de HM durante el seguimiento [63].

Aunque se desconoce el mecanismo de la hematuria, durante los episodios de hematuria macroscópica se ha detectado un aumento de los inmunocomplejos circulantes compuestos por IgA1 deficiente en galactosa complejados con anticuerpos antiglicanos [64]. Estos inmunocomplejos circulantes se depositan en el mesangio, induciendo la proliferación celular y la secreción de varios mediadores inflamatorios (incluidas citocinas, factores de crecimiento y aldosterona / angiotensina) que pueden liberarse al espacio urinario e inducir daño tanto a los podocitos como a las células epiteliales tubulares proximales [ sesenta y cinco]. Por lo tanto, estos mediadores podrían comprometer la función de barrera de filtración de GBM, permitiendo la egresión de los glóbulos rojos. El mismo mecanismo patológico se ha observado en la púrpura de Henoch-Sch & oumlnlein (HSP), un trastorno sistémico caracterizado por la coincidencia de NIgA y vasculitis leucocitoclástica. En pacientes con HSP, la concentración plasmática de complejos IgA1 deficientes en galactosa también aumenta y los depósitos subendoteliales, las semilunas y la necrosis del penacho glomerular son incluso más frecuentes que en la NIgA [65].

Muchas nefropatías se caracterizan por la presencia de depósitos en espacios subendoteliales y subepiteliales, induciendo un deterioro significativo de la integridad del BFG y por tanto hematuria.

Glomerulonefritis primaria: Las GN membranoproliferativas, endocapilares y crecientes son las principales GN primarias asociadas con depósitos subendoteliales y subepiteliales. Se ha propuesto que los leucocitos y el inmunocomplejo pueden producir una respuesta inflamatoria grave que activa las células glomerulares e interfiere con la estructura del GBM, lo que lleva a la hematuria.

Enfermedad por depósitos de fibrillas: La glomerulopatía por fibronectina (GFND) es una nefropatía autosómica dominante poco frecuente debida a una mutación en la fibronectina 1 (FN1) gen expresado [66]. FN1 es una glicoproteína dimérica constituyente de la matriz extracelular. Sus mutaciones alteraron el ensamblaje proteína-dímeros en fibrillas en la matriz extracelular y producen un desequilibrio entre la fibronectina soluble e insoluble, lo que lleva a su depósito patognomónico en el mesangio y el área subendotelial [66,67]. Además del depósito de fibronectina, se han descrito depósitos de IgA, C1q y fibrinógeno [68]. La GFND puede presentarse en diferentes edades, aunque principalmente en la adolescencia o en la edad adulta temprana. La GFND se caracteriza por microhematuria, proteinuria e hipertensión. Los pacientes con GFND progresan a ERT entre la segunda y la sexta década de la vida [66]. En estos pacientes, la ERT puede reaparecer después del trasplante renal [69].

La GN fibrilar e inmunotactoide presentó depósito de fibrillas o microtúbulos en mesangio, MBG o ambos. La GN inmunotactoide se puede diferenciar de la fibrilar debido a sus fibrillas típicamente más anchas con alineación focal paralela. La patogenia no está clara, sin embargo, su respuesta a la inmunosupresión señaló una enfermedad autoinmune subyacente [70]. La GN fibrilar presenta depósitos que infiltran tanto el mesangio como la lámina densa [71], lo que implicaba un deterioro severo del BFG que permitía la egresión de los eritrocitos, lo que explica la patogenia de la hematuria en estas enfermedades.

Los podocitos son células epiteliales altamente especializadas, con procesos interdigitales del pie y uniones intercelulares especializadas que se denominan diafragmas ldquoslit y rdquo, que desempeñan un papel clave en la integridad de GFB. Las mutaciones en proteínas implicadas en el diafragma de hendidura y los procesos del pie se han asociado principalmente con el síndrome nefrótico familiar. Un tipo de hematuria benigna familiar anterior, la enfermedad renal asociada a MYH9, se ha descrito recientemente como una variación genética en MYH9 gene. MYH9 codifican la cadena pesada de la miosina IIA no muscular, una proteína principal del aparato contráctil de actina-miosina y podocitos rsquos, necesaria para mantener la integridad de la pared capilar [72]. Otros síndromes autosómicos dominantes como la anomalía de May-Hegglin y los síndromes de Flechtner y Epstein también incluyen anomalías en MYH9 gen, con una incidencia total & lt 1: 100000 [38]. MYH9 las mutaciones genéticas presentaron grados variables de sordera neurosensorial y glomerulopatía [73], generalmente en personas africanas. La hematuria y / o la proteinuria suelen estar presentes desde la niñez, con una progresión a ERT en la edad adulta temprana [74]. La microscopía electrónica mostró un engrosamiento focal ocasional y una división de la MBG [74,75]. MYH9 las mutaciones producen un podocito y una pared capilar más frágiles que permiten la salida de los eritrocitos, lo que explica la presencia de hematuria [75].

La enfermedad de Fabry & rsquos también presenta hematuria. La enfermedad de Fabry & rsquos es un trastorno ligado al X por almacenamiento lisosómico, mucho más común de lo que ha sido (1: 3100 [76] -1: 1600 [77]) y más frecuente y agresivo en los hombres. Este deterioro lisosómico conduce a acumulaciones intracelulares de globotriaosilceramida en casi todas las células humanas [78]. La acumulación de globotriaosilceramida induce autofagia en los podocitos y daño de las células endoteliales, lo que da como resultado esclerosis focal y segmentaria, así como un deterioro significativo en el GFB, lo que conduce a proteinuria y hematuria [79].

Existen varias enfermedades asociadas a la hematuria sin ningún hallazgo histopatológico evidente que la justifique. La coagulopatía por warfarina (índice internacional normalizado & gt 3,0) puede inducir AKI, la denominada WRN [80]. La LRA podría deberse a la obstrucción intratubular de los cilindros de eritrocitos durante la hemorragia glomerular, aunque también se han señalado ateroembolia [81], nefritis intersticial [82] y efectos directos de la warfarina sobre el glomérulo [83]. La incidencia real de WRN podría ser del 16% en pacientes sin ERC y del 37% en pacientes con ERC [84]. Se han descrito varios factores de riesgo para WRN, que incluyen: (1) tratamiento con aspirina (2) fármacos que aumentan la presión hidrostática glomerular, como los bloqueadores de los canales de calcio dihidropiridínicos (3) niveles bajos de albúmina sérica y (4) insuficiencia cardíaca congestiva concurrente [85 ]. La corrección de la coagulopatía por warfarina con vitamina K previene la WRN y podría promover la recuperación en modelos animales [86]. En WRN, el 66% de los pacientes con episodios de hematuria macroscópica muestran deterioro de la función renal. La WRN se asocia con una progresión acelerada de la ERC y una tasa de mortalidad, aunque esto se relacionó con las comorbilidades del paciente e iexcl & rsquos [9]. Se ha especulado que esta coagulopatía iatrogénica por warfarina se puede observar en pacientes con GFB permeable y previo y ldquofrágil y rdquo (como GN subclínico o TBMD), lo que permite la regresión de glóbulos rojos.

La anemia de células falciformes (ECF) es un trastorno multisistémico con herencia homocigótica o heterocigótica del gen mutado de β-globina, que lidera la producción de hemoglobina S (HbS), con una incidencia global de 30 / millón de personas. La HbS produce glóbulos rojos anormalmente densos y rígidos con tendencia a la formación de hoz. El 3-4% de los pacientes con ECF presentaron hematuria, aunque es más frecuente en heterocigotos con el rasgo drepanocítico. Los eritrocitos falciformes tortuosos pueden extravasar fácilmente la pared capilar del glomérulo, aumentando la viscosidad de la sangre y promoviendo la formación de microtrombos y necrosis isquémica en los vasa recta, y por tanto induciendo cambios estructurales y hematuria [87]. La hematuria es principalmente recurrente y macroscópica, pudiendo ser asintomática o dolorosa debido al paso de coágulos a través del uréter. Además, la hemoglobinuria también es frecuente en estos pacientes debido a su crisis de anemia hemolítica recurrente.

Hallazgos recientes sugieren un papel patogénico de la hematuria glomerular en la enfermedad renal. Por tanto, la aparición de IRA macroscópica asociada a hematuria en la nefropatía por IgAN se asocia con un deterioro persistente posterior de la función renal en una proporción significativa de pacientes. Una anticoagulación excesiva, como resultado de la terapia con warfarina, también puede resultar en AKI asociada a hematuria macroscópica y puede comprometer la función renal a largo plazo. Finalmente, la microhematuria aislada persistente también puede inducir ESRD. El mecanismo patogénico intrínseco de la hematuria glomerular sigue sin estar claro. Los eritrocitos dismórficos urinarios señalaron la disfunción o daño de GFB como una posible alteración asociada a este proceso patológico. Tres posibles mecanismos patológicos pueden estar implicados en la disfunción de GFB y la aparición posterior de hematuria, incluida la alteración genética de los componentes de GFB, el depósito aberrante de moléculas tóxicas en el GFB y una respuesta inflamatoria mejorada. Sin embargo, aunque se han identificado algunos de los mecanismos implicados en el daño renal asociado a la hematuria, es necesario caracterizar nuevos efectos patogénicos de la hematuria para identificar nuevas dianas terapéuticas potenciales. Los estudios futuros, en esta línea, serán de gran interés.


Introducción

La hematuria glomerular, cuando no se acompaña de proteinuria leve a grave, se ha considerado una manifestación benigna de las enfermedades glomerulares que no influye en el pronóstico a largo plazo. Sin embargo, la hematuria macroscópica puede inducir LRA a través de un efecto nocivo directo sobre los túbulos renales. La información sobre la patogenia y las consecuencias a largo plazo de dicha LRA inducida por macrohematuria es notablemente escasa. El objetivo de este artículo es revisar los datos clínicos sobre hematuria y enfermedad glomerular, así como la fisiopatología de la IRA asociada a hematuria.


Inhibición inducible de óxido nítrico sintasa en cistitis hemorrágica inducida por ciclofosfamida en ratas

La ciclofosfamida (CP) es un agente antineoplásico que se usa solo o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de muchas enfermedades neoplásicas. La cistitis hemorrágica (HC) es una toxicidad potencial importante y un efecto secundario limitante de la dosis de la PC. Recientemente, se ha demostrado que los mediadores inflamatorios endógenos están involucrados en la cistitis al aumentar la producción de óxido nítrico (NO) en el tejido diana. El objetivo de este estudio fue evaluar la relación entre el NO y la cistitis hemorrágica HC inducida por CP en ratas. Un total de 30 ratas hembras Spraque-Dawley se dividieron en 4 grupos. El grupo 1 sirvió como control, tres grupos recibieron una dosis única de CP (100 mg / kg) por vía intraperitoneal (i.p.): el grupo 2 recibió solo CP. El grupo 3 recibió el precursor de NO L-arginina (80 mg / kg / día), y el grupo 4 recibió el inhibidor selectivo inducible de NO sintasa (iNOS) S-metilisotiourea (SMT 20 mg / kg / día) antes y el día después de la inyección de ciclofosfamida . La inyección de CP provocó una cistitis grave. La SMT, pero no la L-arginina, produjo una marcada inhibición del daño vesical inducido por CP. Concluimos que el NO producido por iNOS es un mediador importante en la patogenia de la cistitis inducida por CP.

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Hematuria como factor pronóstico

La importancia pronóstica de la hematuria se ha estudiado más a fondo en la nefropatía por IgA. La mayoría de los estudios, aunque no todos, encontraron una asociación negativa entre la hematuria macroscópica y el pronóstico renal a largo plazo (tabla 1). Sin embargo, esta asociación negativa desapareció con frecuencia en el análisis multivariado [36, 37]. Una posible explicación para esta observación es que la hematuria macroscópica debería ser más prevalente en las subclases histológicas con un aumento mínimo de la celularidad mesangial o glomerulonefritis proliferativa focal, pero es un hallazgo raro en procesos más avanzados como la glomeruloesclerosis focal segmentaria y la glomerulonefritis crónica avanzada. [38]. Además, los episodios de hematuria macroscópica son más frecuentes durante las primeras etapas de la enfermedad, mientras que tienden a ser progresivamente infrecuentes en las etapas más avanzadas, cuando comienza el deterioro de la función renal. Aunque el informe inicial describió la recuperación completa de la función renal basal tras la IRA asociada a hematuria en la nefropatía por IgA [29], una evaluación posterior de una serie más amplia reveló que hasta el 25% de los pacientes pueden no recuperar la creatinina sérica basal [1]. La duración de la hematuria durante 15 días fue el único factor pronóstico significativo de recuperación incompleta según el análisis multivariado. La edad & gt55 años, el sexo masculino, la creatinina sérica basal más alta y la ausencia de episodios de hematuria macroscópica previos también fueron factores de riesgo significativos para la persistencia de la insuficiencia renal después de la desaparición de la hematuria macroscópica por análisis univariante [1]. Los pacientes de edad avanzada parecen ser particularmente propensos a una recuperación incompleta de la función renal previa después de tales episodios. La gravedad histológica de la NTA también fue un factor de riesgo significativo para la recuperación parcial de la LRA [1, 16].

Predictores de ESRD en IgAN a

Autor Año Tipo de estudio norteHacer un seguimiento Clasificación morfológica Predictores significativos de ESRD
Género La edad SCr / GFR Proteinuria PA alta Histología Hematuria macroscópica Microhematuria
Espinosa 2009 Cohorte retrospectiva 19 contra 40 1992–2006 Ad hoc Hombre b + b + b + b + b + b - b + b
D'Amico 2000 Revisar 30 estudios Lee o Haas Hombre b + b + + + + - b DAKOTA DEL NORTE
Haas 1997 Retrospectivo 244 1980–94 Haas DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE + b + b + b + b - b DAKOTA DEL NORTE
Frimat 1997 Prospectiva longitudinal 210 5.6 ± 2.6 Sotavento Masculino DAKOTA DEL NORTE + + + + + b DAKOTA DEL NORTE
Beukhof 1986 Retrospectivo 75 1967–83 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE + + + DAKOTA DEL NORTE +
Autor Año Tipo de estudio norteHacer un seguimiento Clasificación morfológica Predictores significativos de ESRD
Género La edad SCr / GFR Proteinuria PA alta Histología Hematuria macroscópica Microhematuria
Espinosa 2009 Cohorte retrospectiva 19 contra 40 1992–2006 Ad hoc Hombre b + b + b + b + b + b - b + b
D'Amico 2000 Revisar 30 estudios Lee o Haas Hombre b + b + + + + - b DAKOTA DEL NORTE
Haas 1997 Retrospectivo 244 1980–94 Haas DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE + b + b + b + b - b DAKOTA DEL NORTE
Frimat 1997 Prospectiva longitudinal 210 5.6 ± 2.6 Sotavento Masculino DAKOTA DEL NORTE + + + + + b DAKOTA DEL NORTE
Beukhof 1986 Retrospectivo 75 1967–83 DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE + + + DAKOTA DEL NORTE +

(+), asociación positiva con ESRD (-), asociación negativa con ESRD NS, ND no significativo, sin datos / no estudiado.


Ok, soy un ganador duro, estoy cortado, en forma muy atlética. pero ganar mucha masa considerable es difícil para mí. Mi metabolismo está por las nubes a los 28 años. No es algo malo, por decirlo así, la mayoría me grita porque como lo que quiero y no gano. pero, esas son personas que realmente no saben mucho sobre fitness o el peso que estoy apuntando .. no un peso de mierda poco saludable. De todos modos, normalmente solo uso suero y creatina.

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EL ARTÍCULO COMIENZA:
Se han observado efectos secundarios del óxido nítrico. Se sabe que produce neurotoxicidad a través del desarrollo de lesiones de Olney, que es el daño a las cortezas cingulada posterior y retropenial del cerebro que se encuentran en un experimento realizado en roedores.

La mayoría de las personas utilizan este tipo de óxido nítrico como suplementos para el culturismo. Se han observado varios casos en los que el uso indebido de estos productos provocó daños graves en el cuerpo y, a menudo, incluso provocó la muerte. Los efectos secundarios señalados son dolor de cabeza y náuseas, fatiga o debilidad extrema y diarrea. Otros también se quejan de desmayos, malestar debido a la frecuencia cardíaca rápida, palpitaciones, boca seca, irritación de la piel y retención de agua en el cuerpo. También hay varios efectos secundarios cuando este producto se toma en grandes dosis, como sibilancias, problemas respiratorios, picazón, vómitos, temblores, urticaria, asma, sudoración intensa y temblores. Cuando una persona sufre una intoxicación, se produce una cantidad extremadamente alta de óxido nítrico en el cuerpo, lo que lleva a la persona a tener una presión arterial baja que puede resultar en la muerte. Cuando una persona sufre un derrame cerebral, las células nerviosas dejan de recibir la cantidad adecuada de oxígeno, lo que permite que el cuerpo produzca óxido nítrico que causa la muerte en una persona.

Se sabe que el óxido nítrico tiene efectos secundarios hematológicos como metahemoglobinemia, efectos cardiovasculares como hipotensión, efectos secundarios respiratorios como atelectasia y estridor, efectos secundarios renales como hematuria y efectos secundarios metabólicos como hiperglucemia. Otros efectos secundarios informados son síntomas de abstinencia, sepsis, infección, celulitis y dolores de cabeza.

Generalmente, se sabe que el uso de óxido nítrico causa efectos a corto plazo, como disminuciones a corto plazo en el rendimiento mental, la capacidad audiovisual y la destreza manual. La exposición a largo plazo también puede causar deficiencia de vitamina B12, entumecimiento y efectos secundarios reproductivos. Biológicamente, se sabe que el óxido nítrico desactiva la forma de cobalamina de B12 por oxidación, por lo que, naturalmente, las personas que están expuestas a este producto o gas pueden manifestar síntomas de deficiencia de vitamina B12 que incluyen neuropatía sensorial, mielopatía y encefalopatía. También se ha realizado un estudio que muestra efectos reproductivos adversos en mujeres embarazadas como resultado de la exposición crónica a este producto o gas.


MATERIALES Y MÉTODOS

Bacterias.

El GBS uropatógeno utilizado en este estudio se cultivó a partir de orina evacuada limpia de una mujer no diabética de 35 años sin factores de riesgo identificados que se presentó en el Hospital de la Universidad de Alabama en Birmingham (UAB) con síntomas compatibles con cistitis no complicada. , que incluyen disuria, bacteriuria de un solo organismo (& # x0003e 100.000 UFC / ml) y esterasa leucocitaria y piuria (& # x0226510 glóbulos blancos [WBC] / & # x003bcl no hilados), notados en el análisis de orina. Se cultivó GBS a 37 ° C en agar Todd-Hewitt (TH) o en caldo Todd-Hewitt (THB). La serotipificación capsular, que identificó este aislado como serotipo III, se realizó como se describe en otra parte (84). El uso de GBS cultivado del paciente en este estudio se promulgó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la UAB (X070722011) y el Comité de Ética Humana (HEC) de la Universidad de Griffith (MSC / 11/10 / HREC). El IRB de la UAB y el HEC de la Universidad Griffith renunciaron a la necesidad de un consentimiento informado específico. En algunos ensayos comparativos, utilizamos la cepa prototipo UPEC CFT073 (ATCC 700928), que se cultivó originalmente de un paciente con pielonefritis (43). Esta cepa se ha utilizado en múltiples estudios de patogénesis en ratones, como se describió anteriormente (32, 38, 82, 92).

Análisis de la adherencia del GBS al uroepitelio vesical.

Inicialmente, buscamos determinar si el aislado de GBS de serotipo III uropatógeno en este estudio era capaz de unirse a las células de la vejiga. in vitro. Para ello, realizamos ensayos de unión utilizando células uroepiteliales de vejiga humana T24 y 5637 (ATCC HTB-4, HTB-9). Treinta mil células de la vejiga se cultivaron en portaobjetos de cámara de pocillos múltiples revestidos con polidisina (BD BioCoat) como se describió anteriormente (83). Se añadieron GBS teñidos con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (0,25 mg ml & # x022121 en solución salina tamponada con fosfato [PBS], 15 min, 37 & # x000b0C) (multiplicidad de infección [MOI], 100 UFC de células & # x022121), y después de 2 h, las monocapas se aclararon con PBS y se fijaron durante 45 min con paraformaldehído al 3% y se marcó F-actina con faloidina Alexa Fluor 594 (Molecular Probes) para colocalizar GBS con superficies de células hospedadoras. El ADN se contratiñó con el colorante nuclear Hoechst 33258. Las células se visualizaron con un microscopio confocal Leica TCS SP2. También realizamos mediciones cuantitativas de la unión del GBS a las células uroepiteliales de la vejiga 5637 mediante el uso de ensayos de protección con antibióticos a los 30 min (unión inicial), 2 h (unión inicial e invasión) y 24 h (supervivencia intracelular), como se describe en otra parte (80 ). Brevemente, se sembraron 5 & # x000d7 104 a 8 & # x000d7 104 células en pocillos de una placa tratada con cultivo de tejido de 24 pocillos (Nunc), se cultivaron durante 24 ha 37 & # x000b0C en 5% de CO2, y desafiado a una multiplicidad de infección de 10 bacterias por célula uroepitelial. Después de 30 min o 2 h, las monocapas se enjuagaron con PBS (cinco veces) y las monocapas se procesaron para el recuento de colonias para determinar el número de GBS adherente o medio fresco con 100 U / ml de penicilina, estreptomicina y se añadió gentamicina para su posterior procesamiento. a las 24 h para medir el GBS intracelular (78, 81). Para algunos ensayos, los sobrenadantes de cultivos por cuadruplicado se recolectaron a los 30 min, 2 hy 24 h para su análisis utilizando un ensayo de proteína multiplex de 8 dianas (Bio-Rad Laboratories, Australia) para evaluar el papel de las células uroepiteliales en las respuestas del huésped a GBS.

Modelo murino de cistitis por GBS.

Se adquirieron ratones hembra C57BL / 6 (de 8 a 10 semanas de edad) en el Animal Resources Centre (Australia) y Jackson Laboratories (Estados Unidos). La orina se recogió 24 h antes de la exposición y se examinó microscópicamente y mediante cultivo para excluir a los ratones con una condición preexistente como se describe en otra parte (85). Los ratones se anestesiaron con isoflurano y la zona periuretral se esterilizó con povidona al 10% y yodo. Los ratones se cateterizaron usando un catéter estéril y se instilaron 40 & # x003bcl de PBS que contenía el inóculo de provocación en la vejiga de una manera transuretral. Los ratones de control recibieron solo PBS. Para las comparaciones con UPEC, otro grupo de ratones recibió una dosis equivalente de la cepa CFT073 (basada en el mismo número de células) que se cultivó a 37 ° C en caldo de lisogenia como se describió anteriormente (13). Se recogió orina a las 22 a 24 h para el recuento de colonias, después de lo cual los ratones se sacrificaron y se extrajeron las vejigas y se homogeneizaron para los recuentos o se procesaron para microscopía para visualizar la unión de GBS a la superficie uroepitelial. Se utilizaron experimentos de dosis escalonadas para determinar la dosis infecciosa del 90% (ID90) del aislamiento de GBS basado en los métodos de Reed y Muench (61). Se usó una dosis de provocación de aproximadamente 3 & # x000d7 10 9 CFU en la mayoría de los ensayos a menos que se indique lo contrario. En algunos experimentos, se recolectaron vejigas de ratones 30 min después de la exposición y se seccionaron y lavaron en PBS (cinco lavados de 5 min cada lavado, en 1 ml, con rotación) y luego se procesaron de manera normal para determinar el número de GBS inicialmente adherentes en la vejiga. También se realizó un análisis de inmunohistoquímica (IHC) en vejigas duplicadas para la evaluación histológica de los infiltrados celulares locales. Este procesamiento se basó en métodos de IHC estándar realizados con Ly-6g (GR-1) anti-ratón de rata (eBiosciences, San Diego, CA) y conjugado IgG-FITC anti-rata de cabra (Southern Biotech, Birmingham, AL). Para visualizar la distribución de GBS teñido con FITC en el uroepitelio de la vejiga, se realizó estereomicroscopía de disección de fluorescencia utilizando un microscopio Olympus SZX16 equipado con una cámara DP72 de dispositivo de carga acoplada (CCD). Se realizó microscopía de campo brillante y epifluorescencia adicional usando un microscopio AxioImager M2 equipado con cámaras AxioCam MRm Rev. 3 y MRc 5 (Carl Zeiss, Australia). Todos los estudios en animales se realizaron con la aprobación y de acuerdo con los estándares éticos del Comité de Ética Animal de la Universidad de Griffith (MSC / 14/08 / AEC) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UAB (080708186).

Ensayos de crecimiento de orina.

Para determinar si el crecimiento de GBS en la orina podría afectar la dinámica de colonización de los organismos en la vejiga, emprendimos in vitro ensayos de crecimiento de orina. Se recogió orina humana de seis voluntarios adultos sanos que no habían tenido UTI ni se habían sometido a ningún tratamiento con antibióticos en las 2 semanas anteriores. Se juntaron volúmenes iguales de orina, se esterilizaron por filtración (filtros de tamaño de poro de 0,45 - & # x003bcm) y se almacenaron a 4 & # x000b0C hasta su uso (dentro de las 48 h). También se realizaron ensayos de crecimiento utilizando orina de ratón. Se inocularon alícuotas duplicadas de 200 - & # x003bcl con aproximadamente 103 UFC de GBS y se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos a 37 & # x000b0C con agitación (200 rpm), y la densidad óptica a 600 nm (OD600) se registró entre 0 y 72 h. Los experimentos de crecimiento se repitieron tres veces y se muestran los datos de un experimento representativo. La aprobación ética para el uso de sujetos voluntarios humanos fue otorgada por la Universidad de Griffith (aprobación del Comité de Ética de Investigación Humana MSC / 11/10 / HREC).

Microscopio de electrones.

Para la microscopía electrónica de barrido (SEM), se recogieron vejigas enteras de ratones sacrificados 2 h después de la exposición transuretral y se fijaron inmediatamente en tampón de glutaraldehído al 3% y cacodilato de 30,1 M (pH 7,4) y se almacenaron a 4ºC hasta el procesamiento. Después de lavarse en tampón nuevo, las vejigas se fijaron con alfileres sobre láminas de cera para evitar que se rizaran, se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% y luego se deshidrataron a través de una serie de etanol graduado y se secaron en el punto crítico. Las muestras se montaron en puntas de SEM y se recubrieron con platino para su visualización utilizando un SEM JEOL 6300F operado a 8 kV.

Aislamiento de ARN y microarrays.

Se aisló el ARN total de las vejigas infectadas con GBS, infectadas con UPEC y con PBS (control) a las 2 hy 24 h después de la exposición utilizando tamaños de grupo de cinco ratones por grupo de tratamiento por punto de tiempo. El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol (Gibco) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se trató con DNasa sin ARNasa y se analizó usando un instrumento Bioanalyzer 2100 (Agilent). Se cuantificó el ARN que pasó el análisis del Bioanalyzer y se amplificaron 100 ng en ADNc usando transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen) con hexámeros aleatorios marcados con una secuencia promotora de T7. Los análisis de micromatrices se llevaron a cabo por quintuplicado para cada grupo y punto de tiempo usando una matriz por ratón (cada matriz representa una sola vejiga). Este enfoque proporcionó un alto grado de poder estadístico basado en muestras no agrupadas para incorporar variaciones entre ratones dentro de cada grupo de tratamiento. Consideramos que el uso de cinco réplicas biológicas (ratones) en cada grupo de tratamiento y punto de tiempo era preferible a los experimentos de réplica técnica, que no se realizaron.

QRT-PCR.

Para interrogar conjuntos de datos de matriz, se llevó a cabo PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR) para genes seleccionados (enumerados en la Tabla 1) que se identificaron como regulados diferencialmente o sin cambios después del tratamiento de acuerdo con el análisis de matriz. La amplificación de cDNA (500 ng RNA amplificado) se realizó usando un sistema GeneAmp 7700 (Applied Biosystems). Los genes diana se amplificaron utilizando las condiciones de ciclo térmico descritas anteriormente (13, 83). Se utilizaron gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y & # x003b2-actina como genes de referencia. Las secuencias de cebadores para cada gen diana se muestran en la Tabla S1 en el material suplementario. Se llevaron a cabo reacciones separadas para asegurar que la eficacia de amplificación del gen de referencia fuera aproximadamente igual a la del gen diana. Los niveles de expresión relativa de los genes diana se determinaron normalizando el ciclo del umbral de reacción (CT) valores a los genes de ama de llaves, GAPDH y & # x003b2-actina. & # x00394CT Los valores se utilizaron en la fórmula 2.0 & # x02212 (& # x00394CT) para el cálculo de los niveles relativos de expresión de ARNm de los genes diana como se describió previamente utilizando las eficiencias de la PCR y las desviaciones medias de los puntos de cruce entre las muestras y los controles (56, 57).

Tabla 1

Datos de qRT-PCR para genes seleccionados identificados como significativamente cambiados o sin cambios en la expresión a las 2 y 24 h después de la infección en la vejiga durante la cistitis por GBS según microarrays

Gen diana aTiempo (h)Significar CT & # x000b1 SEM (norte = 5) & # x00394CTDoblar el cambioP b
ControlInfectado
CXCL10234.111 & # x000b1 1.2933.351 & # x000b1 0.530.751.4110.110
2435.208 & # x000b1 3.1428.019 y # x000b1 6.827.18930.750.001
iNOS236,73 y # x000b1 1,2536,75 y # x000b1 2,02& # x022120.02& # x022121.0820.817
2435,73 & # x000b1 0,4432,26 y # x000b1 2,813.4711.920.001
CCL5228,37 y # x000b1 1,4028.425 & # x000b1 1.02& # x022120.0551.40.153
2429.192 y # x000b1 1.1528.015 & # x000b1 1.211.1772.5250.003
CXCL5235,34 & # x000b1 0,8735,21 & # x000b1 2,450.131.130.717
2435,64 & # x000b1 0,5633,73 y # x000b1 1,801.914.960.001
CXCL9235.573 y # x000b1 0.8134.213 & # x000b1 3.571.361.7770.075
2436.753 y # x000b1 1.3231,950 y # x000b1 2,784.8036.4640.008
IL-1 y # x003b1231.717 y # x000b1 1.0530.737 & # x000b1 3.190.982.7880.001
2432,655 y # x000b1 0,9529.012 y # x000b1 2.053.64322.110.001
IL-1 y # x003b2227.766 y # x000b1 1.1125.343 y # x000b1 1.872.4237.580.001
2429.455 & # x000b1 2.3524.013 & # x000b1 3.155.44221.0960.001
IL-6233,47 y # x000b1 5,7030,77 y # x000b1 10,92.57.9130.001
2437.03 & # x000b1 1.3433.07 & # x000b1 6.223.1417.940.001
EMR1228.06 & # x000b1 0.1228,40 y # x000b1 0,380.41.0720.824
2434,48 y # x000b1 2,6833.14 & # x000b1 1.021.342.5210.124
CSF1R222,16 y # x000b1 0,0622.60 & # x000b1 0.020.441.510.396
2428.02 & # x000b1 1.327,22 y # x000b1 0,690.81.730.199
INFGr1233.097 & # x000b1 0.3333.110 & # x000b1 0.62& # x022120.0131.1030.539
2435.340 & # x000b1 3.6833.477 & # x000b1 0.621.8631.120.480
Caspasa-3230,91 & # x000b1 0,6331.25 & # x000b1 1.17& # x022120.34& # x022121.0890.724
2430,92 y # x000b1 1,2730,64 & # x000b1 1,110.281.2930.3
& # x003b2-Actina219.938 & # x000b1 0.2220.256 & # x000b1 0.13& # x022120.3180.8150.113
2420,26 & # x000b1 0,3120,36 & # x000b1 0,15& # x022120.10.9370.127
GAPDH220.162 & # x000b1 0.320.662 & # x000b1 0.43& # x022120.5& # x022121.180.5
2420.531 & # x000b1 0.2320.352 & # x000b1 0.250.1791.1320.658

Análisis estadístico y bioinformática.

Para el preprocesamiento de datos, los datos de la matriz sin procesar se normalizaron utilizando la normalización de cuantiles y se resumieron utilizando RMA en el paquete affy en Bioconductor (http://www.bioconductor.org), como se describe en otra parte (13). Los genes expresados ​​diferencialmente se identificaron analizando los datos utilizando el paquete MAANOVA (http://www.bioconductor.org/packages/bioc/1.8/html/maanova.html). Para identificar cambios significativos en la expresión inducidos por GBS, utilizamos un método de contracción t prueba junto con permutación (9, 10). Se utilizó una tasa de descubrimiento falso (FDR) de 0,1 para generar la lista de genes significativos. Las pruebas de clase de genes se realizaron utilizando el paquete SAFE en Bioconductor aplicando umbrales para seleccionar vías significativas (4). Se utilizaron las bases de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) (29, 48) y de Ontología genética (GO) (2) para generar una red de señalización a partir del análisis de clases de genes. Se utilizó un FDR de 0,1 como límite para ambas herramientas. GoMiner se utilizó para analizar grupos funcionales de genes activados en vías biológicas y para generar diagramas de Venn de respuestas relacionadas funcionalmente. Se utilizó InnateDB (http://innatedb.ca) para proporcionar un análisis integrador a nivel de sistema de los grupos funcionales activados dentro de las vías biológicas. El análisis de sobrerrepresentación (ORA) de las vías en innateDB se realizó utilizando listas de genes significativos, el algoritmo hipergeométrico y el método de corrección de Benjamini Hochberg con la vía ORA. PAG significancia del valor establecido en 0.05.

Número de acceso de datos de microarrays.

Los conjuntos de datos brutos para las comparaciones de matrices se han depositado en la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso. <"type": "entrez-geo", "attrs": <"text": "GSE27575", "term_id": "27575", "extlink": "1" >> GSE27575 (http: //www.ncbi .nlm.nih.gov / geo /).


Las MAT son entidades potencialmente mortales y tienen una patología característica de trombos que involucran capilares glomerulares y / o arteriolas (Figura 2T). Clínicamente, la LRA grave es un síntoma de presentación frecuente, mientras que la trombocitopenia, los esquistocitos periféricos, la lactato deshidrogenasa elevada y la haptoglobina disminuida pueden no ser diagnósticos. causando síndrome hemolítico atípico (SHUa). El síndrome antifosfolípido pertenece a la categoría de SHUa y en la biopsia renal los hallazgos varían desde necrosis subcortical hasta MAT focal. La patología de la biopsia renal explica la presentación aguda, demostrando NTA hemorrágica en casos graves o ATI difusa adyacente a lesiones trombóticas "focales". Aquí se hace hincapié en la MAT focal que se manifiesta como trombosis capilar glomerular única o inflamación y estrechamiento endotelial de las arteriolas, a veces sin trombos auténticos. La principal lesión en la MAT es endotelial y la ATI es secundaria a isquemia y lisis de eritrocitos. Puede haber glóbulos rojos fragmentados murales en arteriolas pequeñas, pero son suficientes para el diagnóstico histopatológico de MAT.La preeclampsia, la MAT posparto y otras causas de SHUa durante o después del embarazo han surgido como causas importantes de LRA, diagnosticadas con frecuencia y de forma definitiva mejor con una biopsia renal. La reacción de los nefrólogos a los hallazgos de la biopsia renal en estos casos, típicamente mujeres jóvenes, puede ser sorprendente, seguida de ambigüedad con respecto al manejo apropiado e inmediato de los pacientes que potencialmente pueden salvar la vida [44]. Este complejo entorno clínico requiere consultas tanto de hematología como de nefrología.

La actual pandemia de COVID-19 sacó a la luz los efectos deletéreos de los virus en la endotelia, que se manifiestan en el riñón como MAT, pero también sistémicamente (p. Ej., Accidentes cerebrovasculares) [45].

Por último, pero no menos importante, los agentes de quimioterapia y los anticuerpos monoclonales, p. Ej. Los inhibidores de puntos de control inmunitarios, que se dirigen a los receptores inhibidores expresados ​​en las células T y que se utilizan actualmente para tumores sólidos o neoplasias malignas hematológicas, se informan cada vez más como causas de AKI inducida por TMA. Otros efectos secundarios que explican la LRA en estos pacientes son la nefritis intersticial y la ATI genérica [46].

Fisiopatología de la IRA

En las últimas décadas se reveló una mayor comprensión de la fisiopatología subyacente a la IRA a través de estudios moleculares y en animales que muestran estrés oxidativo [47], lesión endotelial [48], lesión mitocondrial (mejor descrita en la población del VIH) tratada con medicamentos antirretrovirales] [ 49] y la inmunidad innata como mecanismos centrales [50], que se describen brevemente a continuación.

La LRA, que antes se pensaba que era un proceso relativamente benigno sin secuelas significativas a largo plazo, ahora se considera un factor de riesgo a largo plazo de ERC, particularmente en pacientes mayores con comorbilidades coexistentes, particularmente sepsis, que afecta al 40-70% de los pacientes en la UCI. [51, 52].

Las drogas y toxinas terapéuticas o ilícitas representan agresiones externas. Numerosos medicamentos pueden causar ATI / ATN. Los más comunes son los antibióticos (por ejemplo, vancomicina), quimioterápicos, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, litio y suplementos de venta libre. Se han informado patrones similares de lesión tubular en asociación con drogas ilícitas como los opioides y los cannabinoides sintéticos (Spice, K2, etc.) [49, 53-55]. Los medicamentos son una causa tan común de ATI / ATN que, más allá de cualquier otra causa, la exposición al medicamento debe excluirse clínicamente ante todo.

Se siguen encontrando interesantes mecanismos de IRA isquémica inducida por infección. Por ejemplo, las trampas extracelulares de neutrófilos dañan el riñón a través de la arginina deiminasa 4 de los neutrófilos [56, 57].

Modelos animales de AKI

Una cantidad significativa de investigación se ha dirigido a investigar la fisiopatología de la LRA y al desarrollo de terapias para la LRA en modelos animales [58, 59]. Sin embargo, ninguna de estas terapias se ha traducido en atención clínica hasta la fecha. Uno de los modelos animales de IRA más utilizados es el modelo de isquemia-reperfusión. Un estudio de isquemia-reperfusión caliente se realiza típicamente mediante pinzamiento unilateral o bilateral de la vasculatura renal durante 30 a 45 min, seguido de reperfusión durante 1 a 2 días [59, 60]. Este modelo se estudió ampliamente en cerdos, perros, conejos, ratas y ratones. La exposición a toxinas es una causa conocida de AKI y se ha utilizado para estudiar la fisiopatología de AKI en vivo. El cisplatino, el ácido fólico, el ácido aristolóquico y la warfarina son nefrotoxinas habituales que se utilizan para inducir la LRA en modelos animales [51-65]. La rabdomiólisis es una condición clínica específica que puede reproducirse en animales usando un modelo de glicerol de LRA. El glicerol inyectado en los músculos de las patas traseras de las ratas produce una rápida LRA y rabdomiólisis [66, 67]. El modelo de obstrucción ureteral unilateral es un modelo animal reproducible en el que se liga un único uréter, lo que produce estrés mecánico e inflamación en un riñón. Este modelo se utiliza para estudiar la transición de AKI a ERC. La sepsis es otra causa bien documentada de LRA [51, 68]. El estudio de este proceso en animales puede realizarse mediante la inyección de lipopolisacáridos o utilizando el modelo de punción y ligadura cecal (CLP) más relevante desde el punto de vista clínico [69, 70]. Aunque el modelo CLP es más típico de la condición humana, es menos reproducible y técnicamente más desafiante. Los modelos animales son una herramienta útil para investigar la fisiopatología de la IRA. Sin embargo, la escasez de nuevas terapias clínicamente útiles desarrolladas utilizando estos modelos animales destaca la desconexión entre la IRA clínica humana y los estudios preclínicos. Esto subraya el hecho de que la LRA clínica en humanos es un proceso diverso con múltiples etiologías y una fisiopatología variable, de modo que es poco probable que las opciones de tratamiento único resulten efectivas.

Biomarcadores de AKI

La práctica clínica actual utiliza la creatinina sérica y la producción de orina para identificar a los pacientes con AKI, independientemente de la etiología subyacente. Un logro significativo ha sido la estandarización de los criterios de diagnóstico de LRA por el KDIGO [5, 71, 72]. La creatinina sérica puede no aumentar hasta días después de la lesión, puede cambiar en casos sin daño renal estructural y puede no cambiar a pesar de la lesión en pacientes con reserva renal significativa [73-75]. Debido a estas imperfecciones conocidas, se desea un biomarcador de tipo troponina para AKI. La esperanza es facilitar el diagnóstico temprano con el fin de implementar las estrategias de manejo actuales destinadas a prevenir más lesiones. El diagnóstico temprano puede facilitar el reexamen de terapias que anteriormente fracasaron en ensayos clínicos, posiblemente debido al retraso en el tratamiento con creatinina para el inicio terapéutico.

La última década ha sido testigo de un esfuerzo significativo para identificar biomarcadores de IRA en orina y plasma sensibles y específicos. Los biomarcadores de LRA pueden ser funcionales (cistatina C), relacionados con el daño (mioinositol oxigenasa, N-acetil-β-glucosaminidasa, glutatión S-transferasa, fosfatasa alcalina), inflamatorios (interleucinas-18, -6, -10 y -5 ), regulado al alza en el túbulo proximal después de una lesión (KIM-1), regulado al alza en el túbulo distal después de la lesión (lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos) o indicadores de detención del ciclo celular (metaloproteinasa 2 inhibidora de tejidos y proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina-7) ) [76, 77]. A pesar de una extensa investigación y desarrollo de ensayos estandarizados para algunos biomarcadores, los biomarcadores de AKI se han restringido predominantemente al uso en investigación y aún no han penetrado en la práctica clínica. Una razón de esta discrepancia es el uso de creatinina como estándar de oro defectuoso para la calificación de biomarcadores [76]. Otro inconveniente es su falta de especificidad para la enfermedad renal [7]. Según los informes, un biomarcador, la mioinositol oxigenasa, está restringido al tejido renal y parece prometedor como indicador de daño tubular proximal específico del riñón, pero aún no ha sido objeto de una investigación significativa [76]. La utilización de otros criterios, como la necesidad de diálisis y la mortalidad, ha ayudado a identificar biomarcadores que complementan la evaluación clínica [78-80]. A pesar de estas deficiencias, estudios recientes indican un posible papel de los biomarcadores en la discriminación de la IRA verdadera de la hiperazoemia prerrenal, el síndrome hepatorrenal y el síndrome cardiorrenal [78]. Los estudios futuros deberán evaluar la capacidad de los biomarcadores de IRA para mejorar los resultados de los pacientes con el fin de que se adopten ampliamente en la práctica clínica [77].


Inducción HO-1 por Selaginella tamariscina El extracto inhibe la respuesta inflamatoria en macrófagos RAW 264.7 estimulados por lipopolisacáridos

Selaginella Herba es la parte aérea seca de Selaginella tamariscina (P.Beauv.) Spring y se ha utilizado para tratar la amenorrea, el dolor abdominal, los dolores de cabeza y la hematuria en Corea. Sin embargo, la evidencia científica sobre la actividad antiinflamatoria y el mecanismo de acción de Selaginella tamariscina esta falto de. Por lo tanto, el presente estudio se realizó para investigar las actividades antiinflamatorias y antioxidantes de Selaginella tamariscina extracto de etanol (STE) contra las respuestas inflamatorias inducidas por lipopolisacáridos (LPS) e identificar el mecanismo molecular responsable. La STE se preparó calentando en etanol al 70% y su calidad se confirmó mediante HPLC. STE inhibió de forma dosis-dependiente la producción de mediadores inflamatorios (NO y PGE2) y citocinas proinflamatorias (IL-1β e IL-6) en células RAW 264.7 estimuladas con LPS. STE suprimió notablemente las fosforilaciones de MAPK, yoκB-αy NF-κB y la translocación nuclear de NF-κB inducida por estimulación con LPS. Además, STE exhibió una buena actividad de eliminación de radicales libres y evitó la generación de ROS por LPS. STE también incrementó la expresión de Nrf2 y HO-1 y promovió la translocación nuclear de Nrf2. En conjunto, se descubrió que STE tiene efectos antiinflamatorios y antioxidantes en macrófagos RAW 264.7 y el mecanismo parece involucrar a MAPK, NF-κVías de señalización B y Nrf2 / HO-1. Estos resultados sugieren que STE podría ser útil para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias y proporcionan evidencia científica que respalda el desarrollo de recetas a base de hierbas o productos naturales novedosos.

1. Introducción

La inflamación es una manifestación de la respuesta del sistema inmunológico a estímulos dañinos, como daño físico o daño causado por patógenos, y se caracteriza por un aumento del flujo sanguíneo a la región dañada, calor, enrojecimiento, hinchazón y dolor [1]. Las respuestas inflamatorias implican comunicaciones coordinadas entre diferentes células inmunes (macrófagos, células dendríticas, células T, células B y otras) y vasos sanguíneos a través de una compleja cascada de señales moleculares [2]. Los receptores de reconocimiento de patrones, como los receptores tipo Toll (TLR) en los macrófagos, reconocen y se relacionan con patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) como los del lipopolisacárido (LPS, un componente principal de la membrana externa de las bacterias gramnegativas que se une con TLR4). ) y estas interacciones dan como resultado la activación de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y el factor nuclear-kappa B (NF-κB) vías de señalización intracelular, que conduce a las secreciones de mediadores inflamatorios y citocinas proinflamatorias [3]. Si la inflamación no se controla, puede progresar y volverse crónica, y la inflamación sistémica o crónica puede ser la causa principal de muchas enfermedades, incluidos cánceres, enfermedades degenerativas y obesidad, y puede hacer que las personas sean más susceptibles al envejecimiento y las enfermedades [4, 5]. En consecuencia, es importante que la inflamación se trate con prontitud.

Los medicamentos antiinflamatorios no esteroides (AINE), como el naproxeno, el ibuprofeno y la aspirina, se recetan comúnmente para la inflamación, pero su uso prolongado puede causar úlceras de estómago, daño renal, accidente cerebrovascular o ataques cardíacos [6]. Los corticosteroides son una clase de hormonas esteroides que previenen varios de los mecanismos que subyacen a la inflamación y se recetan para una variedad de afecciones inflamatorias. Sin embargo, los corticosteroides también tienen efectos secundarios, que incluyen síndrome de Cushing, hipertensión, hiperglucemia, osteoporosis y debilidad del tejido conectivo [7]. Debido a su eficacia y perfiles de seguridad, las medicinas a base de hierbas se utilizan cada vez más como agentes o suplementos para controlar la inflamación, y se están realizando muchas investigaciones para identificar nuevos fármacos naturales.

Selaginella Herba (conocido en Corea como Kwon Baek o Boo Cheo Son) es la parte aérea seca de Selaginella tamariscina (P.Beauv.) Primavera, una herbácea de hoja perenne y miembro de la familia Selaginellaceae [8]. Debido a que se cree que promueve la circulación sanguínea y restablece el flujo menstrual, se ha utilizado durante mucho tiempo para tratar la amenorrea, el dolor abdominal, los dolores de cabeza y el asma en Corea [9]. Creencia en la eficacia terapéutica de Selaginella tamariscina está respaldado por observaciones clínicas o Dongui Bogam, un texto representativo de la medicina coreana, pero faltan datos basados ​​en la evidencia. Estudios recientes han demostrado que Selaginella tamariscina tiene efectos antialérgicos, antihiperglucémicos y anticancerígenos [9-12]. Estudios previos han demostrado que los principales componentes bioactivos presentes en Selaginella tamariscina son bioflavonoides como amentoflavona, hinokiflavona, isocriptomerina, sotetsuflavona y sumaflavona [13, 14]. Además, derivados de amentoflavona, sumaflavona y lignano aislados de Selaginella tamariscina Se ha informado que inhiben la inducción de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la producción de óxido nítrico (NO) [13, 15, 16]. Sin embargo, no hay información disponible en la literatura sobre la actividad antiinflamatoria o antioxidante del extracto completo de Selaginella tamariscina. Por lo tanto, en el presente estudio, examinamos los efectos de Selaginella tamariscina extracto (STE) en macrófagos RAW 264.7 estimulados con LPS y trató de dilucidar el mecanismo responsable.

2. Materiales y métodos

2.1. Sustancias químicas y reactivos

Kits de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para IL-1β e IL-6 se compraron a Ab Frontier (Seúl, Corea) y PGE2 se adquirió de R & ampD Systems Inc. (Minneapolis, MN, EE. UU.). Anticuerpos primarios, anti-COX-2, anti-HO-1, anti-iNOS, anti-IκB-α, anti-p-IκB-α, anti-NF-κB (p65), anti-Nrf2 y anticuerpos secundarios se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). Otros anticuerpos primarios fueron suministrados por Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). Se adquirió dimetilsulfóxido (DMSO) de Junsei Chemical Co. (Tokio, Japón). LPS, amentoflavona, bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT), reactivo de Griess, 2,2-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), 4,6- El diamidino-2-fenilindol (DAPI) y otros reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

2.2. Preparación de STE

Seco Selaginella tamariscina (P.Beauv.) Primavera (Selaginella Herba, conocido en Corea como Kwon Baek o Boo Cheo Son) fue comprado a Omniherb (Daegu, Corea) y autenticado por el profesor Sun-Dong Park (Universidad de Dongguk, Gyeongju, Corea). Las muestras de cupones (DUMCKM2015-103) se depositaron en la Facultad de Medicina Coreana de la Universidad de Dongguk. Las partes aéreas (100 g) se extrajeron en volúmenes de 8 veces de etanol al 70% (800 ml) a 80 ° C durante 4 h. A continuación, el extracto se filtró, se concentró utilizando un evaporador de vacío rotatorio (EYELA, Japón), se liofilizó utilizando un liofilizador (EYELA) y se almacenó a 4ºC. El rendimiento del extracto liofilizado obtenido fue del 16,5% (p / p) de secado Selaginella tamariscina.

2.3. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

El STE se analizó utilizando un sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Equipado con una bomba de suministro de disolvente binario, un desgasificador de vacío y un detector espectrofotométrico de matriz de diodos para su contenido de amentoflavonas (Sigma-Aldrich). La separación se realizó utilizando una columna VDSpher EC-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm, VDS optilab, Alemania) a una temperatura de columna de 30 ° C. La fase móvil consistió en mezclas de 0.3% de ácido trifluoroacético (A) y acetonitrilo (B), y la elución en gradiente se realizó usando el siguiente programa: 0-1 min, 10% B 1-25 min, 10-50% B 25- 35 min, 90% B 35-40 min y 90-10% B. El caudal se mantuvo a 0,8 ml / min durante todo el proceso y el volumen de inyección fue de 10 μL. Los ensayos se controlaron a 340 nm y los datos cromatográficos se procesaron utilizando el software Chromeleon 6.8.

2.4. Ensayo de viabilidad celular y cultivo celular

Se obtuvieron células RAW 264.7 (una línea celular de macrófagos murinos) de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) Y se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (WELGENE, Gyeongsan, Corea), complementado con suero bovino fetal al 10% ( WELGENE), 100 U / mL de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.). Las células se mantuvieron a 37 ° C en un 95% de aire humidificado y 5% de CO2 incubadora.

Las viabilidades celulares se evaluaron usando un ensayo MTT. Brevemente, se sembraron células RAW 264.7 a una densidad de 1 x 104 células / pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos, se incubaron durante 24 h y se trataron con DMSO (control) o diferentes concentraciones de STE (10-300 μg / mL) durante 24 h. Las células viables se tiñeron con solución MTT (concentración final 0.2 mg / mL) durante 3 h, y los cristales de formazán producidos se disolvieron agregando 100 μL DMSO. Las absorbancias se midieron a 540 nm usando un lector de microplacas (Genios, Tecan, Austria).

2.5. Ensayo de nitrito

Las concentraciones de nitrito en sobrenadantes de macrófagos cultivados se cuantificaron usando una prueba de reactivo de Griess. Brevemente, se sembraron células RAW 264.7 a 4 x 105 células / pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos, pretratadas con diferentes concentraciones de STE (10-300 μg / mL) durante 1 h, y luego se estimula con LPS (1 μg / mL) durante 24 h. Reactivo de Griess [solución A: sulfanilamida al 1% en ácido fosfórico al 5%, solución B: diclorhidrato de N- (1-naftil) -etilendiamina al 0,1% en agua

(p / p)] se mezcló luego con volúmenes iguales de sobrenadantes celulares y las mezclas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 min. Las absorbancias se midieron a 540 nm usando un lector de microplacas.

2.6. ELISA

Se sembraron células RAW 264.7 en placas de cultivo de 24 pocillos a 4 x 105 células / pocillo, se pretrataron con STE durante 1 h y luego se estimularon con LPS (1 μg / mL) durante 24 h. Citocina inflamatoria (IL-1β, IL-6 y PGE2) se determinaron las concentraciones en los sobrenadantes de cultivo usando kits de ELISA siguiendo el protocolo del fabricante y se calcularon a partir de la curva estándar para cada citocina.

2.7. Ensayo de eliminación de radicales libres DPPH

La actividad de captación de radicales libres DPPH de STE se evaluó según lo descrito por Moreno, Isla, Sampietro y Vattuone [17], con algunas modificaciones. Brevemente, diferentes concentraciones de STE (0, 10, 100, 200 o 300 μg / ml) a 0,45 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) y luego estas mezclas se añadieron a 1 ml de DPPH 0,1 mM en etanol. A continuación, las mezclas se agitaron con vórtex y se incubaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente, y se midieron las absorbancias (abs.) A 517 nm usando un lector de microplacas. La actividad captadora de radicales DPPH se calculó como sigue.

2.8. Medición de especies reactivas de oxígeno intracelular

Los niveles intracelulares de especies reactivas de oxígeno (ROS) se analizaron mediante tinción con DCFH-DA [18].Brevemente, se sembraron células RAW 264.7 en una placa negra de 96 pocillos a 1 x 105 células / ml y se incubaron con LPS en presencia o ausencia de STE (10-300 μg / mL). Después de quitar el medio, 10 μSe añadió DCFH-DA M en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 min a 37ºC. Las intensidades de fluorescencia se midieron a 480 nm de excitación / 530 nm de emisión usando un lector de microplacas de fluorescencia (Spectra Gemini, Molecular Devices).

2.9. Western Blot

Las proteínas celulares totales se extrajeron con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) Que contenía cócteles de inhibidores de proteasa y fosfatasa (GenDEPOT, Barker, TX, EE. UU.). Los lisados ​​citoplasmáticos y nucleares se separaron utilizando el kit de reactivos de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER® (Thermos Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, cantidades iguales de proteína (30-50 μg) se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio al 10% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (EMD Millipore, Bedford, MA, EE. UU.), que luego se bloquearon en PBST que contenía leche desnatada al 5% durante 1 hy se incubaron con anticuerpos primarios (1: 1000) durante la noche a 4 ° C. Después de tres lavados con PBST, se añadieron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1: 5000) y las membranas se incubaron durante 1 ha temperatura ambiente y se aclararon. La detección se realizó usando una solución de cebado de quimioluminiscencia mejorada (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido). Las bandas se visualizaron utilizando un sistema de formación de imágenes por quimioluminiscencia Fusion Solo 2 M (Vilber Lourmat, Francia).

2.10. Tinción por inmunofluorescencia

Se trataron células RAW 264.7 con STE (300 μg / mL) en ausencia o presencia de LPS (1 μg / mL) en cubreobjetos de 18 mm en placas de cultivo de 12 pocillos, se enjuagan 3 veces con PBS, se fijan con metanol al 100% durante 10 min y se vuelven a enjuagar. A continuación, las células se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1%, se trataron con NF-κB p65 o anticuerpo Nrf2 (1: 200), y se incubó durante la noche a 4 ° C. Después de un lavado extenso con PBS, las células se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1: 2000 Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) Durante 1 h a temperatura ambiente y se contratiñeron con DAPI (1: 1000). Después de montar los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con el medio de montaje antidesvanecimiento VECTASHIELD® HardSet ™ (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.), Se capturaron imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (ECLIPSE Ts2-FL Nikon, Tokio, Japón) equipado con una pantalla monocromática cámara (DS-Qi2, Nikon).

2.11. Análisis estadístico

Los resultados se expresan como medias ± desviaciones estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Se aceptó la significación estadística para

3. Resultados

3.1. Efectos de STE sobre mediadores inflamatorios en macrófagos RAW 264.7 estimulados por LPS

Se utilizó un ensayo MTT para confirmar que STE no tenía ningún efecto tóxico sobre los macrófagos RAW 264.7. Encontramos que STE a concentraciones que van de 10 a 300 μg / mL no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular (Figura 1 (a)). Para investigar los efectos antiinflamatorios de STE en macrófagos RAW 264.7 estimulados con LPS, medimos las cantidades de NO y PGE2 secretado a medio. Como se muestra en las Figuras 1 (b) y 1 (c), el pretratamiento de STE a 100, 200 o 300 μg / mL redujo significativamente el aumento inducido por LPS en NO y PGE2 secreciones. En particular, el pretratamiento con 300 μSTE g / ml inhibió estos aumentos inducidos por LPS a niveles similares a los del control no tratado. Además, la transferencia de Western para iNOS y COX-2 mostró que los aumentos de iNOS inducidos por LPS eran inhibidos de forma dosis-dependiente por STE. Los aumentos de COX-2 inducidos por LPS solo fueron inhibidos por 300 μg / mL STE (Figura 1 (d)). Estos resultados indicaron que STE suprimió eficazmente los mediadores inflamatorios en condiciones inflamatorias inducidas por LPS en nuestro in vitro modelo.

3.2. Efectos de STE sobre la secreción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS

Para investigar el efecto de STE sobre la secreción de citocinas proinflamatorias inducida por LPS, verificamos IL-1β y niveles de IL-6 usando kits de ELISA. Como se muestra en la Figura 2, la estimulación con LPS aumentó significativamente los niveles de IL-1β e IL-6 a 255,8 ± 30,6 pg / mL (PAG & lt 0.01 versus control 9.9 ± 0.8 pg / mL) y 764.5 ± 37.2 pg / mL (PAG & lt 0.01 versus control 24.9 ± 2.6 pg / mL), respectivamente. Sin embargo, el pretratamiento de STE inhibió eficazmente las secreciones de citocinas inducidas por LPS (Figuras 2 (a) y 2 (b)). En particular, a concentraciones de 300 μg / mL STE mostró un fuerte efecto supresor sobre IL-1β y secreción de IL-6 (26,9 ± 1,9 pg / mL y 57,3 ± 10,1 pg / mL, respectivamente) (Figura 2 (b)).

3.3. Efectos de STE sobre la activación de MAPK y NF-κB Vías de señalización

MAPK (ERK1 / 2, JNK y p38) y NF-κB son importantes transductores de inflamación [19]. Para comprender los mecanismos responsables de los efectos antiinflamatorios de STE, investigamos los efectos de STE en la vía de señalización de MAPK mediante Western Blot. La estimulación con LPS de las células RAW 264.7 indujo significativamente las fosforilaciones de ERK, JNK y p38 MAPK, pero el pretratamiento de STE inhibió de forma dependiente de la dosis estas fosforilaciones (Figura 3 (a)). En particular, a una concentración tan baja como 10 μg / mL STE inhibió significativamente la activación de p38 MAPK.

& lt 0,01). (c) La localización de NF-κB p65 se visualizó mediante microscopía de fluorescencia después de la tinción de inmunofluorescencia con NF-κB anticuerpo p65 (verde) y DAPI para visualizar núcleos (azul).

A continuación, analizamos las expresiones de IκB-α y NF-κB mediante Western Blot para determinar si STE afecta a NF-κActivación B. LPS indujo fuertemente las formas fosforiladas de IκB-α y NF-κB en células RAW 264.7, pero pretratamiento con STE a 300 μg / mL inhibió eficazmente estas fosforilaciones (Figura 3 (b)). Dado que la fosforilación de NF-κB p65 conduce a su translocación nuclear y las subsiguientes transcripciones de genes diana [20], confirmamos que STE inhibió la translocación nuclear inducida por LPS de NF-κB p65 mediante tinción inmunofluorescente (Figura 3 (c)).

3.4. Efectos de STE sobre la actividad antioxidante

El estrés oxidativo puede causar varios tipos de oxidación de proteínas, lo que resulta en inflamación [21]. El ensayo de eliminación de radicales libres de DPPH mostró que STE tenía una fuerte actividad de eliminación de una manera dependiente de la dosis (Figura 4 (a)). Además, la estimulación con LPS aumentó los niveles de ROS aproximadamente 3 veces en las células RAW 264.7 y este aumento fue inhibido de manera dependiente de la dosis por el pretratamiento de STE, y a 300 μg / mL este aumento inducido por LPS se bloqueó completamente (Figura 4 (b)).

& lt 0,001). (b) Efectos de STE en la generación de ROS. Las células se estimularon con LPS (1 μg / mL) en ausencia o presencia de varias concentraciones de STE (10, 100, 200 o 300 μg / mL) durante 24 h. Los niveles de ROS intracelulares se determinaron midiendo las intensidades de fluorescencia de DCF. Se determinaron los significados estadísticos frente al grupo de control tratado con vehículo (

3.5. Efectos de STE en la activación de la vía Nrf2 / HO-1

La inducción de genes citoprotectores y antioxidantes a través de la activación de Nrf2 es un mecanismo importante en la defensa celular contra el estrés oxidativo [22]. Por lo tanto, investigamos si la actividad de eliminación de radicales libres y el efecto inhibidor de la generación de ROS por el tratamiento con STE se correlacionaron con la inducción de Nrf2 y su gen diana. La tinción de inmunofluorescencia para Nrf2 mostró que a 300 μg / mL STE indujo la translocación nuclear de Nrf2 (Figura 5 (a)). A continuación, examinamos si STE afecta la expresión de HO-1, un gen diana aguas abajo de Nrf2. STE aumentó de forma dependiente de la dosis la expresión proteica de HO-1 y se observó un pico de expresión durante 300 μg / mL STE (Figura 5 (b)). Se realizó un ensayo de NO mediante el pretratamiento de células RAW 264.7 con SnPP (50 μM un inhibidor de HO) durante 30 min antes de tratarlos con STE (300 μg / mL) y luego LPS, y los resultados mostraron la inhibición de la producción de NO inducida por LPS por STE bloqueado por SnPP (Figura 5 (c)). Estas observaciones sugieren que el efecto antiinflamatorio observado de STE se asoció con la activación del eje Nrf2 / HO-1.

& lt 0,01). (c) Bloqueo del efecto inhibidor de NO de STE sobre la producción de NO inducida por LPS por SnPP. Se pretrataron células RAW 264.7 con STE (300 μg / mL) durante 1 h en presencia o ausencia de SnPP (50 μM, 30 min) y luego estimulado con LPS (1 μg / mL) durante 18 h. (

3.6. Análisis HPLC de STE

El contenido de amentoflavona en STE se utilizó como marcador de control de calidad de HPLC. Los datos del análisis por HPLC de STE se registraron en forma de cromatogramas. La Figura 6 muestra cromatogramas de HPLC de STE y amentoflavona según se determinó usando un detector de 340 nm e identificó el pico de STE con un tiempo de retención de 24,79 min como amentoflavona. El contenido de amentoflavona en STE se calculó a partir de la curva de calibración del estándar y fue de 37,3 mg / g.

4. Discusión

La inflamación aguda es un síntoma de una infección bacteriana o viral, mientras que la inflamación crónica progresa lentamente sin síntomas obvios y puede resultar en enfermedades como hipertensión, diabetes y cáncer [23]. La inflamación crónica tiene muchas causas relacionadas con los estilos de vida, que incluyen hábitos alimentarios, estrés y contaminación ambiental [24]. Según la medicina coreana, Selaginella Herba (la parte aérea seca de Selaginella tamariscina Spring) limpia la sangre, detiene el sangrado, resuelve la flema, alivia los síntomas del asma, promueve la micción y puede usarse para tratar forúnculos [8]. Además, los efectos de Selaginella Herba se cree que depende de la forma utilizada, es decir, la hierba cruda se utiliza para limpiar la sangre, aliviar los síntomas del asma y tratar la amenorrea, mientras que la forma tostada se utiliza para detener el sangrado y tratar el recto prolapsado [8]. Se ha recetado con frecuencia como remedio en la medicina tradicional coreana para diversas enfermedades en una dosis de 3 a 9 g [8]. Como la medicina tradicional coreana incorpora varias hierbas simultáneamente en las recetas, se requiere estudiar la eficacia y el mecanismo de cada fuente de hierbas y desempeña un papel importante en el desarrollo de nuevas recetas. Aunque los efectos antiinflamatorios de varios componentes bioactivos importantes presentes en Selaginella tamariscina Se han reportado evidencias científicas sobre la eficacia y el mecanismo de acción del extracto completo de Selaginella tamariscina falta y, por lo tanto, realizamos este estudio para investigar los efectos antiinflamatorios de STE utilizando un modelo de células RAW 264.7 estimuladas con LPS y para determinar la naturaleza del mecanismo involucrado, como parte de un estudio básico para desarrollar nuevas recetas a base de hierbas o nuevos productos naturales.

El LPS se usa comúnmente para modelar la inflamación e induce la activación de los macrófagos a través de la transducción de señales mediada por TLR4, lo que da como resultado la producción y secreción de mediadores inflamatorios (p. Ej., NO y PGE2) y citocinas proinflamatorias (p. ej., IL-1β, IL-6 y TNF-α) activando MAPK y NF-κB vías de señalización intracelular [25]. El NO se sintetiza de forma endógena durante la conversión de L-arginina en L-citrulina por una de las tres isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS) [26]. Cantidades excesivas de NO por iNOS en macrófagos son citotóxicas y causan lesión e inflamación de órganos, y se ha demostrado que los inhibidores de iNOS tienen propiedades antiinflamatorias [27]. PGE2 se genera a partir del ácido araquidónico debido a la acción de la COX-2 inducida por estímulos inflamatorios, hormonas o factores de crecimiento y desempeña un papel clave en la respuesta inflamatoria [28]. Por tanto, la COX-2 es un objetivo de los AINE. En el presente estudio, se encontró que STE inhibe de forma dosis-dependiente las producciones de NO y PGE2 en células RAW 264.7 estimuladas con LPS y para suprimir las expresiones de iNOS y COX-2 (Figura 1). Además, STE previno significativamente las secreciones de IL-1 inducidas por LPSβ e IL-6 (Figura 2). De acuerdo con nuestros resultados, Kuo et al. informó que el extracto crudo de Selaginella tamariscina reduce la producción de citocinas proinflamatorias, IL-1β y factor de necrosis tumoralα, en las células mesangiales humanas, que desempeñan un papel importante en las reacciones inflamatorias de los riñones [29].

El MAPK y NF-κLas vías de señalización intracelular B juegan un papel clave en la producción de mediadores inflamatorios en los macrófagos [30]. En el presente estudio, el pretratamiento con STE redujo de manera significativa y dependiente de la dosis las fosforilaciones de ERK1 / 2, p38 y JNK, lo que sugirió que STE inhibía la activación de la señalización de MAPK (Figura 3 (a)). Activación del NF-κLa vía B conduce a la fosforilación y degradación dependiente de ubiquitina de IκBα (un NF-κInhibidor B) y promueve la translocación nuclear de NF-κB p65, que da lugar a la producción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas y otros mediadores de la inflamación [31]. En el presente estudio, el pretratamiento con STE redujo la translocación nuclear de NF-κB p65 inhibiendo las fosforilaciones de IκBα y NF-κB p65 (Figuras 3 (b) y 3 (c)). STE bloquea la vía NF-kB solo en 300 μg / mL, mientras que las citocinas proinflamatorias como IL-1β e IL-6 se inhiben significativamente a concentraciones tan bajas como 10 μg / mL. Este efecto puede atribuirse al hecho de que STE es más sensible a la inhibición de la fosforilación de p38 MAPK entre MAPK activadas por estimulación con LPS. Woo y col. informó que la amentoflavona inhibe la producción de NO inducida por LPS al inhibir NF-κActivación de B en células RAW 264.7 [15]. Curiosamente, este artículo informó que el pretratamiento con amentoflavona no afectó las fosforilaciones de ERK o JNK inducidas por LPS. Sumaflavona, que también está presente en Selaginella tamariscina, se ha informado que suprime la producción de NO mediada por iNOS en macrófagos tratados con LPS, pero se encontró que esta supresión estaba asociada con el bloqueo de la activación de AP-1, y no con NF-κActivación B [13]. Por lo tanto, parece que STE puede haber actuado sobre múltiples dianas para inhibir las respuestas inflamatorias en células RAW 264.7 estimuladas con LPS, porque contiene una variedad de componentes.

Los radicales libres endógenos se generan por la activación de las células inmunitarias, la inflamación, la isquemia, la infección, el cáncer y el envejecimiento [32]. Dado que los radicales libres son moléculas altamente inestables que pueden reaccionar rápidamente con varios sustratos orgánicos, su acumulación excesiva en vivo causa estrés oxidativo [33]. El cuerpo humano puede contrarrestar el estrés oxidativo utilizando antioxidantes endógenos o exógenos [34]. Los antioxidantes actúan como "captadores de radicales libres", previenen y facilitan la reparación del daño causado por las ROS y, por lo tanto, mejoran las defensas inmunitarias y reducen el riesgo de enfermedades crónicas [32]. El presente estudio muestra que STE tiene una excelente actividad captadora de radicales libres de DPPH y que inhibe de manera dependiente de la dosis los aumentos de ROS inducidos por LPS en células RAW 264.7 (Figuras 4 (a) y 4 (b)).

Nrf2 es un factor de transcripción y es responsable de la regulación del equilibrio redox celular y del antioxidante protector y de las respuestas de desintoxicación de fase II en los mamíferos [35]. En condiciones normales, Nrf2 se secuestra como una forma silenciosa en el citoplasma al unirse con Keap1, su proteína represora [36]. Sin embargo, en condiciones estresantes, Nrf2 se disocia de Keap1 y se transloca al núcleo donde se une a las secuencias conservadas del elemento de respuesta antioxidante (ARE) en las regiones promotoras de genes desintoxicantes (genes citoprotectores regulados por Nrf2, que incluyen HO-1, GST, y NQO-1) [37]. Recientemente, se ha sugerido que la manipulación farmacológica del eje Nrf2 / HO-1 podría tener implicaciones importantes en el contexto del alivio de la inflamación [38], por lo que consideramos que los efectos antiinflamatorios de STE podrían asociarse con el Nrf2 / HO -1 vía. Encontramos que el tratamiento con STE inducía de manera significativa y dependiente de la dosis la expresión de HO-1 (Figura 5 (b)) y que el bloqueo de la inducción de HO-1 usando SnPP suprimió el efecto inhibidor de STE sobre la producción de NO inducida por LPS en células RAW 264.7 (Figura 5 (C)). Estas observaciones sugieren que el efecto antiinflamatorio de STE se asocia al menos en parte con la activación del eje Nrf2 / HO-1 y es significativo porque aún no se ha realizado un estudio sobre la inducción de HO-1 en Selaginella tamariscina o sus componentes. Varios estudios han demostrado que los compuestos de plantas como la curcumina, los isotiocianatos y las antocianinas no solo son buenos antioxidantes sino también potentes agentes antiinflamatorios que actúan mediante la inducción de Nrf2 [39-42]. Estos compuestos activan la vía de señalización de Nrf2 principalmente en forma de electrófilos que modifican los residuos de cisteína de Keap1 [42]. Además, otras vías independientes de ROS pueden regular Nrf2, es decir, una amplia variedad de vías de señalización de cinasas como la proteína cinasa C (PKC), MAPK, fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y cinasa del retículo endoplásmico similar a PKR (PERK). [43]. Ho et al. sugirió que la activación de Nrf2 en ausencia de estrés oxidativo podría estar involucrada con la vía de estrés del ER independiente de ROS regulando positivamente los genes de respuesta al ER gadd34, gadd45, gadd153 y ndr1 en la citotoxicidad inducida por tetrafluoroetilcisteína [43]. Por lo tanto, STE puede provocar efectos antiinflamatorios activando Nrf2 o mediando la vía de estrés del ER independiente de ROS y eliminando ROS en las condiciones inflamatorias inducidas por LPS.

5. Conclusión

Este estudio muestra que STE tiene actividad antioxidante y reduce las respuestas inflamatorias inducidas por LPS en células RAW 264.7 y sugiere que este efecto de STE se debe a inhibiciones de la activación de NF-κB y MAPK y la promoción de la activación de Nrf2 / HO-1.Estos resultados destacan la utilidad potencial de la STE como fitomedicina para prevenir o curar la inflamación, y puede usarse como base para desarrollar nuevas recetas en el futuro, desempeñando un papel en la evolución de la “medicina basada en evidencia” en la medicina coreana. Para confirmar estos hallazgos, se necesitan estudios en animales para investigar la toxicología y la eficacia de la STE en diferentes enfermedades inflamatorias. La dosis humana relevante puede obtenerse mediante un estudio detallado a escala animal en el futuro.

Disponibilidad de datos

Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

Conflictos de interés

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Contribuciones de los autores

Dong-Il Kim, como director principal y supervisor del estudio, fue responsable del diseño y la financiación del estudio. Ju-Hee Lee y An-Na Won participaron en el diseño del estudio y los experimentos y escribieron el manuscrito. Sun Ah Kim y Jae-Hyun Han llevaron a cabo experimentos y realizaron el análisis estadístico. Jung Yun Ahn y Chang-Hyun Kim realizaron los experimentos necesarios para la revisión del manuscrito. Todos los autores participaron en la preparación del manuscrito y han aprobado la versión final.

Expresiones de gratitud

Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de Investigación y Desarrollo de Tecnología de la Salud de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de subvención: HI15C0198).

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9. Observaciones finales

El desafiante viaje de explorar el mecanismo potencial de COVID-19 en pacientes renales ha comenzado recientemente. Se ha demostrado que el SARS-CoV-2 se dirige a múltiples órganos, p. riñón, corazón y pulmones que posteriormente resultan en insuficiencia orgánica múltiple. Entra en las células e induce múltiples vías inmunes e inflamatorias al mediar los receptores ACE2, lo que lleva a un aumento de la proteinuria grave en los podocitos y en las células de los túbulos rectos proximales. Además, los tratamientos de apoyo, como los suplementos nutricionales y las vitaminas, podrían mostrar efectos protectores al regular a la baja las citocinas inflamatorias como el TNF, IL-6, NF - & # x003baB, IL-2, IL-7, IL-10, GSCF, IP10, MCP1 y MIP1A. En conjunto, la evidencia actual sugiere el potencial terapéutico de los tratamientos de apoyo como los suplementos nutricionales y las vitaminas contra el COVID-19 en pacientes renales. La suplementación de vitamina A, D, E y varios oligoelementos, incluidos zinc, selenio, cobre, magnesio, flavonoide quercetina y probióticos puede ser beneficiosa tanto para la prevención como para el tratamiento de infecciones virales, incluido COVID-19, y puede mejorar la inmunidad contra la infección viral. . Por lo tanto, los pacientes con desnutrición, diabetes y obesidad pueden requerir asesoramiento nutricional personalizado para mejorar su salud durante esta pandemia de COVID-19. Dado que aún no existen estrategias farmacológicas para la prevención o el tratamiento de una enfermedad viral como COVID-19, mejorar la inmunidad mediante estrategias nutricionales podría ser un enfoque beneficioso y de bajo costo que debe explorarse. Lograr una dieta equilibrada y diversa en el contexto mundial actual con movimientos limitados y, por tanto, cumplir con las cantidades recomendadas de calorías y micronutrientes será un desafío. Sin embargo, la suplementación con micronutrientes selectivos puede ser beneficiosa especialmente para poblaciones vulnerables como los ancianos. Además de la supervivencia y el resultado del paciente, la lesión de los riñones puede afectar el metabolismo, la excreción, la dosificación y las concentraciones esperadas de los medicamentos. Como resultado, la monitorización frecuente y cuidadosa de la función renal en pacientes con COVID-19 puede conducir a un diagnóstico temprano de trastornos renales, lograr las concentraciones terapéuticas óptimas y un mejor manejo de la enfermedad. Sin embargo, dada la falta de datos experimentales y clínicos, la relevancia terapéutica precisa de los tratamientos de apoyo y los suplementos nutricionales sigue siendo oscura. Se requieren estudios futuros que empleen casos clínicos para confirmar los efectos protectores observados de más suplementos nutricionales.



Comentarios:

  1. Trang

    Bravo, tu útil opinión

  2. Clayson

    Realmente y como no he pensado en esto antes



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