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¿Es posible producir una célula cancerosa que no codifique ningún neoantígeno?

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La célula todavía tiene mutaciones, pero esas mutaciones solo ocurren en las secuencias no codificantes, como los promotores, lo que impulsa la sobreexpresión de protooncogenes y la regulación a la baja de genes supresores de tumores. Entonces la célula proliferará incontrolablemente, pero no expresará ningún neoantígeno. ¿Será esa célula invisible para nuestro sistema inmunológico?


La inmunovigilancia de las células cancerosas se basa en múltiples "señales" derivadas de las células cancerosas y su microambiente.

Debo señalar la carga mutacional del tumor (Figura 1). Una especie de conclusión aquí es que ciertas indicaciones tienen menos mutaciones y, por lo tanto, menos neoantígenos que otras. Sin embargo, también debe tener en cuenta el estadio del tumor. Los tumores en estadio IV han acumulado más mutaciones que en estadio I / II.

Figura 1. Prevalencia mutacional por indicación. Una prevalencia más alta predice una mayor frecuencia de neoantígenos o carga mutacional para esa histología de cáncer. (1, 2)

Es interesante señalar la parte inferior de la figura 1 donde los autores de una nota de revisión separada para nosotros donde se cree que existe la desconexión entre la inmunoterapia tradicional con bloqueo de puntos de control y la inmunoterapia CAR-T. Solo para educar un poco sobre el tema, el bloqueo de puntos de control se dirige a las células T, los impulsores de la muerte celular dependiente de antígenos. Las células T se infiltran naturalmente en el tumor a medida que se desarrolla e intentan montar un ataque. Uno de los métodos que utilizan los tumores para evadir la muerte de las células T es a través del antígeno persistente, la expresión de receptores inhibidores y la secreción de moléculas inhibidoras. La inmunoterapia de bloqueo de puntos de control utiliza anticuerpos contra el inhibidor receptores como PD-1 (Opdivo, Keytruda), su ligando PD-L1, CTLA-4 (Yervoy), Tim3, Lag3, etc. Esto intenta eliminar el efecto amortiguador que estos receptores tienen sobre las células T para que puedan reanudar la destrucción. El paradigma dependiente del antígeno T también está respaldado por publicaciones que analizan el bloqueo de puntos de control en el contexto de la diversidad de células T clonales y confirman que (1) un repertorio diverso de clones de células T dan como resultado un bloqueo de puntos de control exitoso y (2) enriquecimiento de ciertos clonotipos dentro del repertorio, presumiblemente los clonotipos específicos de antígeno, indica además una respuesta (3).

Así que debajo están las indicaciones encerradas en un círculo rojo, en particular las histologías con una baja frecuencia de neoantígenos. La idea detrás de las células T con CAR es que puedo aprovechar la biología de las células T, en particular, que las células T reconocen el antígeno con un receptor y matan la célula diana. Entonces, simplemente retrocediendo a la inmunoterapia de bloqueo de puntos de control muy rápido, digamos que un paciente tiene melanoma, que puede consistir en miles de mutaciones y cientos de neoantígenos. Existe una mayor probabilidad de que una célula T infiltrada tenga especificidad por cualquier antígeno en particular. Entonces, ¿qué tal un paciente con glioblastoma? Pueden tener de 10 a 20 neoantígenos o, como usted dijo, pueden no tener neoantígenos, al menos ninguno contra el que sus células T sean específicas. Por lo tanto, el bloqueo de puntos de control puede no ser tan efectivo. CAR significa receptor de antígeno quimérico. Es esencialmente un anticuerpo monoclonal contra un objetivo conectado a un enlazador conectado al dominio intracelular de un receptor de células T. Las neoplasias malignas hematológicas, como el linfoma difuso de células B grandes, como el LNH, se dirigen comúnmente a un receptor de células B conocido como CD19. Entonces, todo lo que tiene que hacer es hacer que su CAR CD19 sea específico y transfectar las células T con él en lugar de su propio receptor de células T o TCR. Entonces, el proceso básico detrás de CAR es aislar sus células T como con la leucaféresis, transfectar lentiviralmente con mi CAR anti-CD19, expandir e infundir. Hay dos productos CD19 CAR T con excelentes tasas de respuesta en el mercado (Kymriah, YESCARTA). La razón por la que estos son buenos es porque podemos dirigirlos al antígeno que queramos (por supuesto, tenga cuidado con los autoantígenos, consulte autoinmunidad).

Figura 2. Esquema de la terapia con células T con CAR. (4)

De hecho, el enfoque CAR T se debe a que la carga de neoantígenos es baja o inexistente, lo que es problemático para las células T no modificadas.y, por lo tanto, problemático para tratamientos de atención estándar como el bloqueo de puntos de control.

Como tal, existen otras formas y otras células que pueden manejar algunas de las anomalías que presentan los tumores en su conjunto. Esto incluye la presencia de patrones moleculares asociados al peligro / daño (DAMP) y la regulación de receptores de superficie, por ejemplo, ligandos del receptor NK como MIC.

La forma en que funcionan los DAMP es que las células que están dañadas o transformadas secretan un medio de moléculas, lo que envía señales a las células del sistema inmunitario innato. Uno de los problemas es que los DAMP promueven un entorno inflamatorio. Esto significa que sí, obtienes células inmunes que revisan la situación, pero que algunas de estas son células inmunes buenas y otras son "malas" (células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), macrófagos M2 asociados a tumores (TAM) o T -células reguladoras (Treg)). Estos amortiguan la respuesta inmune tanto a través de la liberación de citocinas inhibidoras como IL-10 como de la expresión de receptores inhibidores como PD-L1.

Figura 5. Las moléculas secretadas por el microambiente del tumor inflamatorio ayudan y dañan la respuesta inmune. (5).

Y luego, la idea detrás de los ligandos NKR es bastante sencilla: las células asesinas naturales (NK) patrullan su cuerpo de forma rutinaria en busca de anomalías y tienen licencia para matar las células anormales. Por ejemplo, todas las células nucleadas expresan el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) en su superficie. Algunos receptores como MIC también están presentes en la superficie de la célula que activan receptores en las células NK como NKG2D en peligro. Entonces, ¿qué hacen los cánceres? A veces expresan MIC truncada y, por tanto, inactiva, no expresan MHC pero también expresan receptores inhibidores de las células NK, etc.

Todo se resume muy bien en la siguiente figura sobre la inmunoedición del cáncer (Figura 7). Tenga en cuenta que, si bien las cosas funcionan normalmente, el sistema inmunológico puede manejar la carga tumoral. A medida que la balanza se inclina, y esto podría ser, por ejemplo, la respuesta de las células T elimina un inmunoantígeno pero no se ocupa de todo el tumor, lo que da como resultado un crecimiento al que esas células T ya no responden. Mientras esto sucede, el cáncer se vuelve cada vez más invasivo.

Figura 7. Inmunoedición del cáncer. (7).

Entonces, solo para aclarar al final, probablemente no haya un caso en el que el sistema inmunológico no esté respondiendo en absoluto a menos que haya recibido quimioterapia que destruyó su sistema inmunológico. Los entornos inflamatorios por sí solos son suficientes para que sus células inmunitarias al menos controlen el tumor. De hecho, y no puedo encontrar el documento ahora, pero lo intentaré, los investigadores incluso encontraron células T ingenuas en el microambiente del tumor simplemente debido a la inflamación. También podríamos entrar en tumores "calientes" y "fríos", pero eso está fuera de alcance aquí (punto para recordar, los tumores fríos no se inflaman y se sabe que contienen menos infiltrado inmunológico). Usé la inmunoterapia como un vehículo para transmitir mi punto de vista, tenga en cuenta que esta respuesta no se trata de inmunoterapia, sino más bien de la teoría del escape inmunológico y la carga mutacional.


No, realmente, las vacunas de ARNm no afectarán su ADN

La versión corta: No hay forma plausible de que las vacunas de ARNm alteren su ADN. Violaría básicamente todo lo que sabemos sobre biología celular.

Lodish H, Berk A, Kaiser C, Krieger M, Bretscher A, Ploegh H, Amon A, Martin K. Biología celular molecular. 8ª ed. Nueva York: W.H. Freeman 2016. Figura 5-1

Esta figura es útil porque puede ver claramente los dos compartimentos que nos interesan: el núcleo, que alberga casi todo el ADN (se comenta la excepción), y el citosol, que es donde ocurre la traducción.

Recientemente, recibí una gran cantidad de preguntas sobre cómo podemos estar realmente seguros de que las vacunas de ARNm no afectarán nuestro ADN. En mi publicación anterior sobre el tema escribí:

Lodish H, Berk A, Kaiser C, Krieger M, Bretscher A, Ploegh H, Amon A, Martin K. Biología celular molecular. 8ª ed. Nueva York: W.H. Freeman 2016. Figura 13-37B que demuestra la exportación de ARNm desde el núcleo.

Otra preocupación planteada ha sido la idea de que el ARNm de alguna manera puede alterar el genoma del huésped. Eso en realidad sería genial y enorme para la terapia genética (y finalmente podría darme las alas de murciélago gigantes que siempre he querido), pero no es así. Por lo general, esto es imposible, excepto si también hay una enzima transcriptasa inversa presente que produce ADN a partir de la plantilla de ARN, que es la forma en que funcionan los retrovirus. No existe tal riesgo con ningún candidato a vacuna de ARNm. Las vacunas de ARNm actúan completamente dentro del citosol de la célula; no se acercan al núcleo donde está todo el ADN. En realidad, esa es una gran ventaja de las vacunas basadas en ARN sobre las de ADN.

Flint S, Racaniello V, Rall G, Skalka A, Enquist L.Principios de virología. Washington, DC: ASM Press 2015. La figura 5.23C muestra el ciclo de importación nuclear con ribonucleoproteínas de la influenza como ejemplo. Las señales de localización de nucleoear son reconocidas por importina-α que luego recluta importina-β que recluta una pequeña GTPasa llamada Ran. Al unir el GDP, Ran es capaz de transportar el RNP a través del complejo de poros nucleares. El complejo de importinas y Ran luego se disociará, y un factor de intercambio de nucleótidos de guanina intercambiará GDP por GTP, lo que permite que Ran-GTP sea exportado fuera del núcleo. Luego, RanGAP-1 o RanBPI, 2 pueden catalizar la hidrólisis de GTP a GDP, lo que permite que Ran se una a otra importina-β para iniciar el ciclo de importación una vez más.

Di esta respuesta en gran parte porque sentí que la discusión detallada de la transcripción inversa, el tráfico nuclear, la vía endocítica y los otros 11 o más temas avanzados de biología celular que tendría que invocar para dar una respuesta rigurosa era demasiado compleja. para beneficiar a la persona promedio que desea saber simplemente si esto es posible o no. Sin embargo, tuve una serie de preguntas sobre "qué pasaría si" en relación con los retrovirus o hepadnavirus (hepatitis B), y puedo admitir que esta respuesta no aborda eso, así que aquí intentaré responder eso de la manera más explícita y con una complejidad mínima. como soy capaz.

Para simplificar la discusión y evitar tener que explicar las fases de las bicapas de fosfolípidos y la composición molecular de la nanopartícula lipídica en lo que respecta a la estabilidad (discutido en 1, 2, 3, 4), pediré a los lectores que den por sentado que el ARNm las vacunas se endocitosan y liberan (y esto) en el citoplasma de la célula.

En primer lugar, para que el ARNm afecte su ADN, como mínimo debemos establecer que necesitaría obtener acceso al ADN en cuestión. Hay dos compartimentos subcelulares donde esto se puede lograr. El primero es el núcleo, así que comencemos con una discusión sobre el tráfico de carga en el núcleo. El núcleo de la célula es un compartimento aislado con complejos de poros (NPC) que imponen límites al tamaño de las partículas que pueden entrar libremente. El ARN se transporta fácilmente a medida que se produce la transcripción dentro del núcleo, pero los ribosomas necesarios para producir proteínas se encuentran en el citosol o en el retículo endoplásmico rugoso. Este proceso está mediado por varias proteínas accesorias que puede ver a su derecha. Sin embargo, tenga en cuenta que no existe ninguna circunstancia fisiológica en la que se pueda necesitar que el ARN del citosol sea transportado de regreso al núcleo. El ARN se sintetiza dentro del núcleo. Los virus que tienen una fase nuclear en su ciclo de replicación deben tener varios trucos para poder permitir que ingrese su carga útil de ARN. Aunque el ARN no se transporta fácilmente a las células, las proteínas pueden serlo. Esto ocurre a través de una red de proteínas llamadas importinas (ver figura 5-23C a la derecha). Las proteínas que contienen una secuencia de aminoácidos llamada secuencia de localización nuclear (NLS hay 2 comunes) son capaces de unirse a las importinas, que luego pueden transportarlas a través del complejo de poros nucleares como se muestra a la derecha. Los virus de ARN a menudo tienen ciclos de replicación que no requieren acceso al núcleo, pero existen algunas excepciones. Los virus de la influenza, por ejemplo, son virus de ARN que tienen sus genomas asociados con ribonucleoproteínas, y estas ribonucleoproteínas expresan señales de localización nuclear que facilitan la entrada de su ARN genómico en el núcleo. Las vacunas de ARNm, por otro lado, no están asociadas con ninguna proteína. Una vez dentro del citosol, el ARNm está desnudo y expuesto al duro entorno de los ribosomas y exonucleasas que destruyen el ARNm en cuestión de horas (como máximo). No existe un mecanismo concebible por el cual el ARNm pueda transportarse espontáneamente al núcleo. Al estar compuesto de nucleótidos, no puede contener una secuencia de localización nuclear.

El otro compartimento relevante sería la mitocondria. Las mitocondrias son en realidad bacterias vestigiales con sus propios genomas, y se cree que hace miles de millones de años una célula antigua (probablemente una arquea, la prima de las bacterias) intentó consumir al ancestro de las mitocondrias, pero carecía de la maquinaria para digerir y procesar. dos establecieron una relación simbiótica. Desde ese momento, las mitocondrias han sido una característica esencial de la biología de nuestras células. Esto permitió que las mitocondrias desarrollaran un genoma extremadamente reducido que contenía solo 37 genes (la mayoría de los genes relevantes para la función mitocondrial todavía se encuentran en el núcleo). Las mitocondrias tienen sus propios ribosomas e incluso su propio código genético (más o menos). También existe un proceso especializado para la eliminación de mitocondrias enfermas llamado mitofagia, que es objeto de muchas críticas excelentes, p. esto, esto y esto.

La conclusión colectiva de nuestra comprensión de estos procesos biológicos es que un ARNm desnudo en el citosol no tiene potencial para terminar en un compartimento celular que contenga nuestro propio ADN, lo que significa que, independientemente de la presencia o ausencia de otros factores, no hay ninguna posibilidad. de daño al ADN de la vacuna de ARNm. Pero la gente todavía quería preguntarme sobre las transcriptasas inversas, así que hablemos de ellas.

El proceso de pasar del ARN al ADN (exactamente lo contrario de lo que dicta el dogma central de la biología molecular) se conoce como transcripción inversa, y se lleva a cabo con una enzima llamada la transcriptasa inversa (que son un grupo de enzimas realmente interesante). En general, la transcripción inversa se realiza mediante algunas entidades genéticas diferentes: retrovirus, hepadnavirus, telómeros, y retrotransposones. Vale la pena definirlos.

Los retrovirus son virus que tienen un genoma de ARN, a partir del cual crean una copia de ADN a través de la transcripción inversa que luego se integra en la célula del huésped (con lo que quiero decir, literalmente se inserta en el genoma de la célula huésped y se convierte en una parte permanente de él). en forma de una secuencia llamada provirus). La secuencia proviral en sí misma puede luego transcribirse en la célula huésped para producir proteínas y partículas virales que pueden propagarse a la siguiente célula. El retrovirus más famoso es el VIH-1.

Los hepadnavirus son virus de ADN que tienen genomas separados (hay una cadena de ADN completa y otra cadena de ADN parcial que está unida a un ARN pregenómico) y, a diferencia de los retrovirus, no se integran en el genoma de la célula huésped que infectan. El ejemplo más famoso es el virus de la hepatitis B, para el que existen múltiples vacunas eficaces.

Los telómeros son estructuras presentes en los extremos de los cromosomas humanos que se mantienen mediante un complejo proteico llamado telomerasa que utiliza una transcriptasa inversa llamada TERT para mantenerlos. Las razones por las que esto es necesario se analizan a continuación. Suelen tener alrededor de 5-15 kilobases de largo, y el acortamiento da como resultado la detención del crecimiento y la replicación celular (senescencia), o incluso puede desencadenar la muerte celular por apoptosis.


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El árbol genealógico de Rebecca & rsquos, como se ilustra en la Figura ( PageIndex <1> ), muestra una alta incidencia de cáncer entre parientes cercanos. Pero, ¿son los genes la causa del cáncer en esta familia? Solo las pruebas genéticas, que son la secuenciación de genes específicos en un individuo, pueden revelar si un gen causante de cáncer se hereda en esta familia.

Figura ( PageIndex <1> ): árbol genealógico de la familia de Rebecca, como se describe al principio de este capítulo, que muestra a los individuos con cáncer (rojo) y los que no tienen cáncer (azul). Los círculos representan a las mujeres, los cuadrados a los hombres.

Afortunadamente para Rebecca, los resultados de sus pruebas genéticas muestran que no tiene las mutaciones en el BRCA1 y BRCA2 genes que con mayor frecuencia aumentan el riesgo de que una persona contraiga cáncer. Sin embargo, eso no significa que no tenga otras mutaciones en estos genes que podrían aumentar su riesgo de contraer cáncer. Hay muchas otras mutaciones en los genes BRCA cuyo efecto sobre el riesgo de cáncer se desconoce, y es posible que aún haya muchas más por descubrir. Es importante continuar estudiando las variaciones en genes como BRCA en diferentes personas para evaluar mejor su posible contribución al desarrollo de la enfermedad. Como ya sabrá gracias a este capítulo, muchas mutaciones son inofensivas, mientras que otras pueden causar efectos importantes en la salud, según la mutación específica y el gen involucrado.

Es particularmente probable que las mutaciones en los genes BRCA causen cáncer porque estos genes codifican proteínas supresoras de tumores que normalmente reparan el ADN dañado y controlan la división celular. Si estos genes mutan de una manera que hace que las proteínas no funcionen correctamente, se pueden acumular otras mutaciones y la división celular puede descontrolarse, lo que puede causar cáncer.

BRCA1 y BRCA2 están en los cromosomas 17 y 13, respectivamente, que son autosomas. Como mencionó el consejero genético Rebecca & rsquos, las mutaciones en estos genes tienen un patrón de herencia dominante. Ahora que conoce el patrón de herencia de genes autosómicos dominantes si Rebecca & rsquos abuela hizo tiene una copia de un gen BRCA mutado, ¿cuáles son las posibilidades de que la madre de Rebecca & rsquos también tenga esta mutación? Debido a que es dominante, solo se necesita una copia del gen para aumentar el riesgo de cáncer, y debido a que está en los autosomas en lugar de los cromosomas sexuales, el sexo del padre o la descendencia no importa en el patrón de herencia. En esta situación, los huevos de Rebecca & rsquos grandmother & rsquos habrían tenido un 50% de probabilidad de tener una mutación del gen BRCA, debido a la ley de segregación de Mendel & rsquos. Por lo tanto, la madre de Rebecca & rsquos habría tenido un 50% de posibilidades de heredar este gen. A pesar de que Rebecca no tiene las mutaciones BRCA más comunes que aumentan el riesgo de cáncer, eso no significa que su madre también no las tenga, porque también habría solo un 50% de posibilidades de que se lo transmita a Rebecca. Por lo tanto, la madre de Rebecca & rsquos también debería considerar hacerse la prueba de mutaciones en los genes BRCA.Idealmente, los individuos con cáncer en una familia deben ser evaluados primero cuando se sospecha una causa genética para que si se hereda una mutación específica, se pueda identificar y los otros miembros de la familia puedan ser evaluados para esa misma mutación.

Las mutaciones tanto en BRCA1 como en BRCA2 se encuentran a menudo en familias judías asquenazíes. Sin embargo, estos genes no están vinculados en el sentido cromosómico, porque están en diferentes cromosomas y, por lo tanto, se heredan de forma independiente, de acuerdo con la ley de distribución independiente de Mendel & rsquos. ¿Por qué prevalecerían determinadas mutaciones genéticas en determinados grupos étnicos? Si las personas dentro de un grupo étnico tienden a producir descendencia entre sí, sus genes seguirán prevaleciendo dentro del grupo. Estos pueden ser genes de variaciones inofensivas, como el color de la piel, el cabello o los ojos, o variaciones dañinas, como las mutaciones en los genes BRCA. Otras enfermedades y trastornos de base genética a veces se encuentran más comúnmente en grupos étnicos particulares, como la fibrosis quística en personas de ascendencia europea y la anemia de células falciformes en personas de ascendencia africana. Aprenderá más sobre la prevalencia de ciertos genes y rasgos en grupos étnicos y poblaciones particulares en el capítulo sobre Variación humana.

Como aprendió en este capítulo, la genética no es el único determinante del fenotipo. El medio ambiente también puede influir en muchos rasgos, como la altura adulta y el color de la piel. El medio ambiente también juega un papel importante en el desarrollo del cáncer. Entre el 90 y el 95% de todos los cánceres no tienen una causa genética identificada y, a menudo, son causados ​​por mutágenos en el medio ambiente, como la radiación ultravioleta del sol o sustancias químicas tóxicas en el humo del cigarrillo. Pero para familias como Rebecca & rsquos, conocer su historial de salud familiar y su composición genética puede ayudarles a prevenir o tratar mejor las enfermedades causadas por su herencia genética. Si una persona sabe que tiene un gen que puede aumentar su riesgo de cáncer, puede hacer cambios en su estilo de vida, hacerse exámenes de detección de cáncer temprano y con mayor frecuencia e incluso puede optar por someterse a cirugías preventivas que pueden ayudar a reducir el riesgo de contraer cáncer y aumentar su probabilidades de supervivencia a largo plazo si ocurre el cáncer. La próxima vez que vaya al médico y le pregunten si algún miembro de su familia ha tenido cáncer, comprenderá mejor por qué esta información es tan importante para su salud.


Mintiendo con la ciencia

Así que echemos un vistazo al comunicado de prensa y al artículo científico que promovía el comunicado de prensa. El comunicado de prensa se titula & # 8220En un giro, los científicos encuentran los impulsores del cáncer que se esconden en el ARN, no en el ADN & # 8220, y el artículo fue publicado en Nature por Christine Mayr, bióloga molecular y celular de MSKCC que estudia el ARNm. El estudio se titula & # 8220La poliadenilación intrónica generalizada inactiva los genes supresores de tumores en la leucemia & # 8220, que, por supuesto, no es el tipo de título que la mayoría de la gente entendería. No se preocupe. Yo & # 8217 lo explicaré.

Pero primero, necesito explicar algunos antecedentes. Al discutir las vacunas COVID-19 basadas en ARNm y cómo no reprograman su ADN y no son una terapia genética, discutí cómo el ADN codifica el ARN que, en última instancia, codifica proteínas. Antes de discutir lo que realmente muestra el artículo y por qué Wells está aplicando mal sus hallazgos, creo que es útil revisar los conceptos básicos de este aspecto de la biología molecular nuevamente. Aquí hay un diagrama muy básico del proceso:

El & # 8220 Dogma Central de Biología Molecular & # 8221. La información fluye del ADN al ARN y luego se utiliza para producir proteínas.

Básicamente, el ADN se replica a partir de una plantilla de ADN y da como resultado una molécula de doble hebra que es muy estable, ya que tiene secuencias complementarias que se unen estrechamente entre sí de una manera específica de secuencia. Esta plantilla de ADN se desenrolla mediante enzimas que utilizan la plantilla para producir hebras de ARN, que son de una sola hebra, que luego es utilizada por un ribosoma para producir proteínas a partir de aminoácidos. De nuevo, en pocas palabras, cada nucleótido es igual a una letra del código, cada secuencia de tres nucleótidos (codón) es igual a una & # 8220palabra & # 8221 que se traduce en un aminoácido. Dado que hay cuatro nucleótidos, hay 64 codones posibles. Dado que solo hay 20 aminoácidos, eso significa que la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de una combinación de nucleótidos o más de un codón, es decir, el código genético es redundante. Por supuesto, es más complicado que eso, como muestra este diagrama:

Después de que el código genético fuera descifrado hace 60 años, pronto se hizo evidente que los ARN que codifican proteínas a menudo no se forman por completo justo después de que se transcriben. A menudo, el ARN comienza como un ARN precursor más largo (un pre-ARNm) que se empalma con la secuencia de ARNm final antes de ser transportado fuera del núcleo al citoplasma para ser utilizado para impulsar la producción de proteína en el citoplasma. En resumen, el ARN precursor que se transcribe inicialmente contiene secuencias conocidas como & # 8220exons & # 8221 y & # 8220introns & # 8221. En los genes, los exones contienen las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína real, mientras que los intrones contienen secuencias de nucleótidos que no codifican nada pero que pueden tener secuencias importantes que regulan la producción y la actividad de los genes. Aquí & # 8217s una ilustración del proceso de empalme de Wikipedia:

Este diagrama es bastante simple, con dos exones y un intrón. Algunos genes tienen muchos exones e intrones, que requieren múltiples empalmes, como en este diagrama:

¿Olvidé mencionar que los ARNm también se procesan para tener un & # 8220cap & # 8221 en un extremo y un tramo de As (una cola poli-A) en el otro extremo? La cola de poli-A es muy importante para regular la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, su vida media en el citoplasma. En cualquier caso, como con cualquier proceso biológico, las cosas pueden salir mal con estos eventos de empalme. Las mutaciones del sitio de empalme, por ejemplo, pueden resultar en ARNm mal empalmados y proteínas que carecen de exones:

Podría seguir y seguir y seguir. Hay genes normales que pueden producir más de una proteína mediante un empalme alternativo:

A veces, cuando el empalme sale mal, puede resultar en una proteína truncada que carece de un extremo. Por ejemplo, si se deja un intrón unido a dos exones, es probable que el ribosoma (el complejo enzimático que traduce el ARNm en proteína) golpee un codón & # 8220stop & # 8221 (código de tres nucleótidos que le dice a la transcripción que se detenga) mucho antes de que se detenga. llega al otro extremo del intrón, momento en el que se detiene la transcripción. Todo esto sin contar las otras modificaciones moleculares que el ARN puede sufrir en su viaje desde la transcripción hasta el pre-ARNm, pasando por el empalme hasta el ARNm & # 8220maduro & # 8221 final.

Como era de esperar, si este tipo de errores ocurren en genes importantes para los procesos que regulan el crecimiento y la invasión celular, el cáncer puede resultar, ya sea por un empalme incorrecto que elimina una región reguladora en la proteína que la mantiene bajo control o por la producción de una proteína que no lo hace. funcionar como debería. Se están acumulando ejemplos de cánceres que son causados ​​o acelerados por una mutación del sitio de empalme. Es esta última posibilidad, una proteína truncada que no funciona, la que examina el papel que Wells está aplicando incorrectamente. Las proteínas comprometidas por el truncamiento son proteínas supresoras de tumores, cuya función es detener el crecimiento u otros procesos que pueden resultar en cáncer cuando son demasiado activas.

Entonces, ¿qué mostró el periódico? Lo interesante del artículo es que mostró la existencia de errores de empalme en genes supresores de tumores en un cáncer específico, leucemia linfocítica crónica, sin mutaciones en los sitios de empalme para explicar cómo estas proteínas se truncaron debido a errores de empalme o, como los autores ponerlo en el manuscrito:

Descubrimos una regulación al alza generalizada de ARNm truncados y proteínas en células de CLL primarias que no fueron generadas por alteraciones genéticas, sino que ocurrieron por poliadenilación intrónica.

Las proteínas truncadas generadas por poliadenilación intrónica a menudo carecen de las funciones supresoras de tumores de las proteínas de longitud completa correspondientes (como DICER y FOXN3), y varias incluso actuaron de manera oncogénica (como CARD11, MGA y CHST11). En la CLL, la inactivación de genes supresores de tumores por procesamiento de ARNm aberrante es sustancialmente más frecuente que la pérdida funcional de tales genes a través de eventos genéticos.

Entonces, ¿qué significa todo esto? Primero, para reiterar y simplificar, los autores detectaron ARNm y proteínas truncados para varios genes supresores de tumores en la CLL que no podían explicarse por mutaciones del ADN en los genes mismos, como mutaciones en el sitio de empalme. Hicieron muchos otros controles, como asegurarse de que la explicación de las proteínas truncadas no fuera la escisión por proteasas, enzimas que cortan proteínas en secuencias de aminoácidos específicas. Después de descartar otras posibilidades, los autores demostraron que estos ARNm y proteínas estaban truncados debido a un proceso llamado poliadenilación intrónica. ¿Pero que es eso?

La poliadenilación es el proceso de agregar un montón de adenosinas (As) al extremo 3 & # 8242 de una molécula de ARN. Es cómo se agrega la cola de poli-A al final de un ARNm, pero resulta que es un proceso común para que ocurra la poliadenilación en los intrones. Este proceso está muy extendido y fue apreciado hace más de una década. Está involucrado en la diversificación de los productos de los ARNm de células inmunes, el proceso se explica así:

En la bibliografía sobre empalmes, las isoformas generadas mediante el reconocimiento de una señal IpA se describen a menudo como eventos del & # 8216 último exón alternativo & # 8217. Se cree que los genes que generan isoformas de IpA albergan señales de empalme y poliadenilación en competencia, produciendo un ARN mensajero (ARNm) de longitud completa cuando el empalme supera la poliadenilación y produce un ARNm truncado. Como el evento definitorio es el reconocimiento de una señal IpA, llamamos a estas transcripciones isoformas IpA. Ahora es posible reconocer la expresión generalizada de las isoformas de IpA mediante el análisis de los datos de secuenciación del extremo 3ʹ.

O, para decirlo de manera más simple, si hay una proteína truncada o una proteína de longitud completa depende del equilibrio entre el empalme y la poliadenilación en el sitio del intrón. Si hay más actividad de empalme, obtendrá mucha más proteína completa. Si hay más poliadenilación, obtendrá mucha más proteína truncada. Lo que encontró el laboratorio de Mayr & # 8217 fue que demasiada poliadenilación puede resultar en proteínas supresoras de tumores truncadas en la CLL, contribuyendo al desarrollo del cáncer, razón por la cual, según el comunicado de prensa de MSKCC, que explica bastante bien los hallazgos:

Estos hallazgos ayudan a explicar un enigma de larga data, que es que las células de CLL tienen relativamente pocas mutaciones de ADN conocidas. Algunas células de CLL carecen incluso de mutaciones conocidas. En efecto, los cambios en el ARNm que el equipo del Dr. Mayr & # 8217 descubrió podrían explicar las mutaciones del ADN que faltan.

Debido a que la CLL es un cáncer de crecimiento tan lento y las personas con CLL a menudo viven muchos años, es demasiado pronto para decir si estos cambios en el ARNm están asociados con un pronóstico más precario.

Existen algunas diferencias importantes entre los cambios en el ARNm y una mutación genuina del ADN. Lo más importante es que la inactivación de los supresores de tumores a través del ARNm suele ser solo parcial, solo aproximadamente la mitad de las moléculas de proteína relevantes en las células tumorales están truncadas. Pero en muchos casos esto es suficiente para anular completamente la función de las versiones normales que están presentes. Y debido a que este truncamiento podría aplicarse a 100 genes diferentes a la vez, los cambios pueden acumularse.

Entonces, ¿por qué nada de esto tiene nada que ver con las vacunas basadas en ARNm que causan cáncer? Me alegra que me lo hayas preguntado y espero que no te importe que aproveché esta oportunidad para aprender un poco, en el sentido de la biología molecular. La biología de la que Wells está abusando es en realidad bastante compleja y fascinante, y ya no puedo hablar de biología molecular pura muy a menudo. Espero no haber perdido demasiados lectores con la explicación, pero también apuesto a que algunos de ustedes ya han descubierto por qué lo que Wells está vendiendo es una tontería total. Si no, aquí vamos.


El complejo papel de la ENM en el cáncer

Los tumores han encontrado formas de aprovechar su crecimiento ilimitado y la progresión del cáncer aprovechando ambas funciones de la NMD. Por un lado, las células cancerosas utilizan la actividad NMD para regular negativamente de forma selectiva genes supresores de tumores a través de la adquisición de PTC, pero, por otro lado, estas células ajustan la magnitud del NMD para permitir la regulación positiva de los genes correctores del estrés responsables de su adaptación al microambiente tumoral. [21, 26]. Aunque aparentemente sencillo, el papel de la ENM en el desarrollo y la progresión del cáncer puede, de hecho, ser bastante complejo [2, 26, 148, 149]. Mientras que en algunos contextos la ENM puede funcionar como una vía supresora de tumores, en otros escenarios su actividad podría agravar la enfermedad, dependiendo de la historia evolutiva genética del tumor [2, 151].

Actividad NMD contra la tumorigénesis

Se han encontrado mutaciones incapacitantes en genes que codifican factores NMD en varios tipos de cánceres, lo que planteó la posibilidad de que NMD tenga algún tipo de función protectora contra la tumorigénesis. Por ejemplo, en los tumores de carcinoma adenoescamoso pancreático (ASC) y en los tumores miofibroblásticos inflamatorios de pulmón (IMT), el gen UPF1 exhibe mutaciones que alteran el corte y empalme que comprometen la actividad de la NMD [27, 28]. Esto puede conducir a la regulación positiva de genes controlados típicamente por NMD que, por lo tanto, contribuyen al fenotipo de la enfermedad. Por ejemplo, la diana NMD que codifica la proteína quinasa quinasa quinasa 14 activada por mitógenos (MAP 3 K14 o NIK), un potente activador de la vía de señalización del factor nuclear proinflamatorio kappa B (NF-κB), se regula al alza en los IMT mutados con UPF1 , promoviendo la producción de quimiocinas y las infiltraciones inmunes que caracterizan a este tipo de tumores [28]. De manera similar, los adenocarcinomas de pulmón (ADC) y los carcinomas hepatocelulares (HCC) muestran una menor expresión de UPF1 en comparación con los tejidos normales debido a la hipermetilación del promotor, un hallazgo que se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con HCC [147, 152]. El deterioro resultante de la vía NMD conduce a la regulación positiva de factores de la vía de señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), que impulsa la transición epitelio-mesenquimatosa (EMT) y, en consecuencia, la tumorigénesis y la metástasis de neoplasias [147]. De acuerdo con estos hallazgos clínicos, existen datos experimentales que muestran que la sobreexpresión de UPF1 reduce el número y el tamaño de las colonias de células tumorales cultivadas en comparación con las células de control de varias líneas de células cancerosas [26]. Además, las células de cáncer de próstata (PC3) que sobreexpresan UPF1 inyectadas como explantes tumorales en ratones desnudos no presentan un crecimiento tumoral significativo [26]. Curiosamente, un análisis de matriz de expresión realizado en células de osteosarcoma óseo humano (U2OS) sometidas a inhibición de NMD reveló que NMD controla la expresión de una amplia variedad de transcripciones que codifican factores importantes involucrados en procesos relacionados con la tumorigénesis, incluido el crecimiento celular, el ciclo celular y el crecimiento. factor de señalización, apoptosis y migración celular [26]. En conjunto, parece que típicamente la NMD funciona como una vía supresora de tumores regulando la expresión de genes involucrados en la proliferación, diferenciación y supervivencia celular, y que los tumores con NMD alterada, como los que tienen UPF1 mutado, tienen condiciones favorables para la proliferación tumoral (Fig. . 3a). Otro apoyo a esta idea es un estudio que informa que UPF3A, un parámetro de UPF3B que inhibe la NMD secuestrando UPF2 [47], se expresa en gran medida en los tejidos metastásicos del cáncer colorrectal (CCR) en comparación con los tejidos primarios [153]. Esta mayor expresión se asocia con metástasis hepática, recurrencia y mal pronóstico en pacientes con CCR [153]. Este hallazgo también se informó en un estudio anterior en el que se observó que la interacción de los factores de transcripción oncogénicos, el transductor de señal y el activador de la transcripción 3 (STAT3), el homólogo 1 del oncogén de glioma (GLI1) y el GLI1 truncado (tGLI1) promueven la UPF3A. regulación al alza [154]. Esa mayor expresión de UPF3A aumenta la agresividad de los cánceres de mama triple negativos y enriquecidos con el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) y empeora la supervivencia libre de metástasis, según el perfil de expresión génica de los tumores de mama recuperado de la base de datos GEO [154]. Por tanto, es posible que algunos tumores con factores NMD completamente funcionales hayan encontrado otra forma de controlar la actividad NMD aumentando la expresión de moduladores, como UPF3A, para aprovechar la tumorigénesis y / o impulsar la enfermedad (Fig. 3a).

Roles de la desintegración del ARNm mediada sin sentido (NMD) en el cáncer. a Las mutaciones incapacitantes o los cambios en el nivel de expresión génica de los factores clave de la ENM (por ejemplo, UPF1) ocurren en diferentes tipos de cáncer [por ejemplo, tumor miofibroblástico inflamatorio de pulmón (IMT), carcinoma adenoescamoso pancreático (ASC), adenocarcinoma de pulmón (ADC), y carcinoma hepatocelular (HCC)]. El caso de la izquierda representa UPF1 mutado (Mut), que conduce a una actividad de NMD disminuida que da como resultado la regulación positiva de una diana de NMD que codifica la proteína quinasa quinasa quinasa 14 activada por mitógenos (MAP 3 K14) y estimula el NF-κB (factor nuclear kappa (potenciador de cadena ligera de células B activadas), induciendo así la producción de quimiocinas e infiltraciones inmunes. El ejemplo del medio ilustra una menor actividad de NMD debido a la regulación a la baja de UPF1, que provoca la regulación al alza de varios factores de la vía del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). Esto favorece la transición epitelio-mesenquimatosa (EMT) y, en consecuencia, el número de eventos metastásicos. El ejemplo de la derecha muestra la interacción entre tres oncoproteínas, STAT3, GLI1 y tGL1, para inducir niveles más altos de proteína de UPF3A, que inhibe la actividad de NMD, aumentando la progresión maligna del tumor. B Los genes supresores de tumores pueden perder completamente su función mediante la adquisición de PTC y la posterior degradación de NMD, combinada con la deleción del alelo de tipo salvaje o la haploinsuficiencia del alelo restante. Por otro lado, un gen supresor de tumores puede experimentar una mutación resistente a NMD, lo que lleva a una proteína dominante negativa que obstaculiza la función de tipo salvaje. C El microambiente tumoral modula la NMD para superar diferentes tipos de tensiones celulares asociadas con el crecimiento ilimitado del tumor. Estreses como la hipoxia, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o la privación de nutrientes promueven la fosforilación de eIF2α, que inhibe la NMD y, por lo tanto, se estabilizan varios ARNm que codifican factores sensibles al estrés, lo que permite la progresión y adaptación del tumor. WT: PTC de tipo salvaje: codón de terminación prematura aa: aminoácido

Además de su papel en la regulación de la expresión génica, la capacidad de la NMD para degradar las transcripciones que albergan PTC también puede estar involucrada en la protección del desarrollo del cáncer. Se demostró que los genes supresores de tumores tienen una mayor propensión a adquirir mutaciones sin sentido que los oncogenes, que presentan en su mayoría mutaciones sin sentido [19]. Además, se prevé que muchas de estas mutaciones sin sentido induzcan NMD [19].De hecho, se encontró que varios genes supresores de tumores presentaban mutaciones que introducen PTC en una plétora de cánceres, como p53 en el linfoma de células del manto [23] y cánceres de mama [20], el gen E-cadherina (CDH1) en cánceres gástricos difusos hereditarios ( HDGC) [155], gen del retinoblastoma 1 (RB1) en el linfoma de células del manto [23], gen de la proteína de susceptibilidad del cáncer de mama tipo 1 (BRCA1) en los cánceres de mama y de ovario [22] y proteína de susceptibilidad del cáncer de mama tipo 2 (BRCA2) gen en cánceres de mama [25]. Curiosamente, las transcripciones anormales que resultan de estos genes supresores de tumores mutados se estabilizan en condiciones de NMD inhibida, lo que sugiere que esta vía suele ser responsable de degradarlos [20, 22, 23, 25, 155]. Por lo tanto, en estos contextos, la función de control de calidad de la NMD puede proteger a la célula de la producción de posibles proteínas dominantes negativas que, de lo contrario, conducirían a la tumorigénesis, como se ha descrito en diferentes modelos, como BRCA1 en ratones desnudos [156]. , p53 en muestras humanas [27], o el gen de la proteína tumoral 1 de Wilms (WT1) en estudios in vitro [24].

Actividad de NMD en el desarrollo y la progresión del cáncer

A pesar de la idea clara de que la NMD puede funcionar contra el cáncer, en algunos contextos su actividad puede tener el efecto contrario. Por ejemplo, se informó recientemente que la inhibición de la NMD en los CCR con inestabilidad de microsatélites (MSI) conduce a una disminución del crecimiento tumoral en los modelos de xenoinjerto, lo que sugiere que la NMD normalmente juega un papel pro-tumorigénico en estos tumores [157]. De hecho, los CRC con MSI presentan una mayor expresión de UPF1, UPF2, SMG1, SMG6 y SMG7, en comparación con los CRC homólogos con estabilidad de microsatélites. Se cree que la sobreexpresión de los factores NMD potencia la degradación del mayor número de transcritos potencialmente tóxicos portadores de PTC que producen característicamente los CRC de MSI, promoviendo su supervivencia [157]. En un contexto diferente, si un gen supresor de tumores que alberga PTC codifica una proteína truncada que conserva total o parcialmente su función original, en lugar de una dominante negativa como la descrita anteriormente, la degradación dirigida de su ARNm por NMD podría promover el cáncer. desarrollo. En consecuencia, los pacientes con mutaciones sensibles a NMD en CDH1 presentan un mayor riesgo de desarrollar HDGC que los pacientes con mutaciones resistentes a NMD, posiblemente porque estos últimos producen formas truncadas pero aún funcionales de E-cadherina [155]. Curiosamente, en un estudio que compara datos de exoma y transcriptoma de tumores humanos, se informó que las mutaciones sin sentido se enriquecen en regiones de genes supresores de tumores que se espera que induzcan NMD [21]. Dado que estas mutaciones suelen producirse en heterocigosidad [19], esto plantea la cuestión de cómo la NMD potencia el desarrollo del cáncer cuando al menos un alelo de un supresor de tumores es funcional [158]. Al respecto, Lindeboom et al. han revelado que las células cancerosas aprovechan la actividad de NMD para lograr la inactivación completa del supresor de tumores, que puede ocurrir por tres mecanismos: i) selección del tumor para mutaciones inductoras de NMD en un alelo combinado con una deleción en el segundo alelo, logrando así la inactivación bialélica por un proceso de "dos golpes" ii) selección de mutaciones inductoras de NMD en versiones haploinsuficientes del alelo de tipo salvaje, para eliminar la función residual y con menos frecuencia, iii) selección de mutaciones resistentes a NMD en alelos que producen proteínas dominantes negativas [ 21] (figura 3b).

Además de participar en el proceso de desarrollo del cáncer, la actividad de NMD también parece tener un impacto en la evolución del tumor. Durante la progresión del cáncer, las células tumorales adquieren varias mutaciones somáticas que pueden favorecer o no el proceso tumorigénico. Esto se acompaña de una selección positiva y negativa que permite la proliferación de subclones con mutaciones favorables, como PTC en genes supresores de tumores o mutaciones resistentes a NMD / sin sentido en oncogenes, al tiempo que elimina los que portan mutaciones perjudiciales. De esta manera, las células cancerosas aprovechan la actividad de la NMD y las reglas que gobiernan su inducción para favorecer la proliferación de células transformadas que sobreproducen oncoproteínas y otras proteínas pro-tumorigénicas, lo que impulsa y agrava la enfermedad [19, 21].

Un papel de AS-NMD en el cáncer

Como se explicó anteriormente, la actividad de NMD está íntimamente ligada a AS, y juntos forman un mecanismo postranscripcional clave de regulación de la expresión génica. Durante la última década, se han observado muchos eventos de EA desregulados en varios tipos de cáncer, que generalmente involucran factores de corte y empalme mutados que conducen a patrones alterados de expresión génica en todo el genoma. Esto puede resultar en la producción de isoformas de oncogenes y genes supresores de tumores sensibles a NMD que, por lo tanto, contribuirán al desarrollo del cáncer. Un ejemplo bien documentado es la proteína SR, SRSF2, con frecuencia mutada en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA) [159, 160]. Un estudio reciente informó que la mutación de puntos calientes de Pro95 en SRSF2 mejora la estabilización de EJCs aguas abajo de la PTC, favoreciendo así la asociación de factores clave de NMD para provocar NMD [159]. Un objetivo sólido de SRSF2Mut es EZH2, que codifica una proteína que cataliza la metilación de histonas y actúa como supresor de tumores en las neoplasias mieloides [161]. SRSF2Mut impulsa la inclusión de un exón venenoso en el pre-ARNm de EZH2 que desencadena la NMD y, en consecuencia, cierra la expresión de su proteína [159]. De acuerdo con este hallazgo, hay estudios que informan sobre mutaciones con pérdida de función de EZH2 en el mismo espectro de trastornos mieloides que presentan SRSF2 mutado [162, 163]. Estos datos sugieren que la mutación Pro95 convierte SRSF2 en una oncoproteína que usa AS-NMD para detener la expresión de un gen supresor de tumores.

La cadherina epitelial (E-cadherina) es un factor crucial para mantener la integridad del tejido y la polarización de las capas de células epiteliales y es bien sabido que la pérdida de E-cadherina es un evento clave durante la progresión del cáncer que contribuye a la transición epitelial-mesenquimal [164] . Curiosamente, Matos et al. descubrió que una de las causas que conducen a la disminución de E-cadherina es una variante de ARNm producida por AS que está comprometida con NMD [165]. Esa nueva isoforma surge del uso de un sitio de empalme 3 'alternativo que termina en el agotamiento de 34 nucleótidos en el exón 14, introduciendo un PTC. Además, las células MCF7 de cáncer de mama estable que expresan esta nueva variante dieron como resultado una disminución concomitante de los niveles de ARNm de cadherina E de tipo salvaje y una mayor migración celular e invasividad [165]. Sin embargo, debe aclararse el mecanismo por el cual AS promueve esta isoforma alternativa. Otro ejemplo de un evento AS-NMD que afecta a EMT es el orquestado por SRSF1. Este factor de corte y empalme promueve una isoforma constitutivamente activa del protooncogén MST1R ((receptor estimulador de macrófagos 1), al inducir la omisión del exón 11 [166]. En consecuencia, la isoforma activa de MST1R induce EMT, así como aumenta la resistencia a la apoptosis [ 167,168,169]. AS-NMD opera corriente arriba en esta vía, induciendo la retención del intrón 3'UTR en SRSF1 en condiciones fisiológicas, lo que crea un contexto de codón de parada prematuro que induce NMD. Sin embargo, en un contexto tumorigénico, otro factor de empalme, KHDRBS1 (KH RNA Binding El dominio que contiene, asociado a la transducción de señales 1), estabiliza el ARNm de SRSF1, que se convierte en una regulación positiva del MST1R activo constitutivo.

La hipoxia es una característica importante de los tumores sólidos, dada la gran masa de proliferación de células cancerosas que encuentran un entorno avascular que limita el suministro de oxígeno [170]. Curiosamente, la hipoxia parece afectar a la AS-NMD, como se observa en el inductor angiogénico rico en cisteína 61 (CYR61), una proteína matricelular que promueve la proliferación celular, la migración y la angiogénesis en numerosos tumores sólidos [171,172,173]. En condiciones normales, CYR61 experimenta retención del intrón 3, que se traduce en una PTC corriente abajo, lo que da lugar a una isoforma sensible a NMD [174]. Sin embargo, las condiciones hipóxicas alteran esta regulación del gen AS-NMD, induciendo la omisión del intrón 3, lo que hace que la transcripción sea resistente a la degradación por NMD.

La metilación del ARN de N 6-metiladenosina (m 6 A) es una modificación común del ARNm regulada dinámicamente en células de mamíferos [175] que controla varios pasos del metabolismo del ARNm, desde el procesamiento y transporte del ARNm hasta la traducción o desintegración [176,177,178,179]. METTL3, la subunidad catalítica del complejo de metiltransferasa m 6 A, desempeña un papel fundamental en la tumorigénesis, promoviendo la proliferación celular, la supervivencia y la invasión de las células cancerosas [180,181,182]. Curiosamente, Li et al. descubrió recientemente que METTL3 modula el empalme alternativo de factores de empalme que afectan al conjunto de isoformas portadoras de PTC en células de glioblastoma [183]. Los estudios de transcriptomas mostraron que la metilación alterada de METTL3 da como resultado la generación de PTC en los ARNm de varios SRSF, contrariamente al escenario existente en los gliomas malignos, que se asocian con una expresión elevada de METTL3 y niveles más bajos de expresión de las formas empalmadas de NMD de los SRSF [183]. Además, los autores demostraron que la oncogenicidad derivada de la actividad de METTL3 se debe a cambios en eventos de empalme alternativo de genes con implicaciones relevantes en la muerte y migración de células cancerosas, como BCL-X y NCOR2. En conjunto, esto indica claramente que los eventos de EA desregulados en las células cancerosas contribuyen a la participación de la ENM en el desarrollo y / o progresión del cáncer.

Modulación de NMD en el microambiente tumoral

En notable contraste con los ejemplos anteriores en los que la NMD promueve el cáncer, se encuentra el hallazgo de que el microambiente tumoral induce la atenuación de la NMD para potenciar la progresión y adaptación del cáncer, lo que enfatiza la idea de que la actividad de la NMD tiene resultados paradójicos. Como se mencionó anteriormente, durante el crecimiento sin restricciones del tumor, el suministro de sangre a las células cancerosas se vuelve insuficiente, creando un ambiente celular de hipoxia, privación de nutrientes, producción de ROS y estrés ER, todos estímulos que promueven la fosforilación de eIF2α e inhiben la NMD [26 , 105, 107, 109, 148] (figura 3c). En consecuencia, se ha informado de que las células cancerosas cultivadas como explantes tumorales tridimensionales presentan una actividad de NMD disminuida en comparación con las células cancerosas cultivadas en monocapas, mostrando niveles significativos de eIF2α-P [26]. De hecho, varios estudios mostraron niveles aumentados de eIF2α-P en una plétora de cánceres, incluidos carcinomas bronquioloalveolares, gastrointestinales y tiroideos, linfoma de Hodgkin, neoplasias epiteliales melanocíticas y colónicas y cáncer de mama [184,185,186,187,188,189]. El efecto negativo de esta inhibición de la NMD mediada por estrés en los tumores es la estabilización y regulación positiva de varias transcripciones que codifican factores de respuesta al estrés, que ayudarán a las células cancerosas a proliferar en el entorno adverso del tumor [26] (Fig. 3c). Por ejemplo, se ha informado que la inhibición de NMD por estrés estabiliza el ARNm del antiportador de cistina / glutamato xCT [Solute Carrier Family 7 Member 11 (SLC7A11)], una subunidad del sistema transportador de aminoácidos xCT. Este canal limitante de la velocidad es responsable de la captación de cistina para la producción del antioxidante celular, glutatión (GSH), un tripéptido que neutraliza los radicales libres y los compuestos reactivos del oxígeno. Curiosamente, se demostró que las células empobrecidas en UPF1 pueden sobrevivir a dosis más altas de H2O2 de una manera dependiente de SLC7A11, lo que sugiere que el deterioro de la NMD durante el estrés y la consiguiente regulación positiva de SLC7A11 brinda protección a las células cancerosas contra el daño oxidativo que puede resultar. de la sobreproducción de ROS [106]. El ARNm de ATF4 es otra diana de NMD que se encuentra frecuentemente regulada al alza en varios tipos de tumores sólidos, de acuerdo con la inhibición de NMD en estas condiciones [190, 191]. La privación de nutrientes y el estrés oxidativo promueven la expresión de ATF4 para inducir transcripcionalmente genes involucrados en la síntesis y transporte de aminoácidos, plegamiento de proteínas, diferenciación celular y autofagia, como una forma de contrarrestar el estrés. Curiosamente, se ha informado de que la inhibición molecular / farmacológica simultánea de la autofagia y la ENM conduce a la muerte celular sinérgica en las líneas celulares de CRC, lo que sugiere que la autofagia es una respuesta adaptativa a la inhibición de la ENM que permite que las células cancerosas superen el estrés metabólico [192]. Además, la actividad de ATF4 se ha implicado en la quimio-resistencia de las células de CRC [190], destacando además que el NMD desactivado por el microambiente tumoral puede favorecer las cascadas de señalización que potencian la proliferación tumoral y la malignidad. En conjunto, estos hallazgos indican que el deterioro de la NMD es una consecuencia y parte de los mecanismos adaptativos que utilizan las células cancerosas para prosperar en el microambiente dañino del tumor.


El descubrimiento de la superficie celular puede conducir a un gran avance en el tratamiento del cáncer

Universidad de Virginia escuela de Medicina Los investigadores han descubierto una nueva estrategia para atacar las células cancerosas que podría alterar fundamentalmente la forma en que los médicos tratan y previenen la enfermedad mortal. Al dirigirse de manera más selectiva a las células cancerosas, este método ofrece una estrategia para reducir la duración y el costo físico asociados con los tratamientos actuales.

"Creemos que tenemos una manera no solo de atacar más específicamente las células cancerosas, sino una manera que podría convertirse en un tratamiento de primera línea para las mujeres que tienen cánceres de muchos tipos y desean preservar la fertilidad", dijo el investigador de reproducción John Herr de U.Va. 's Departamento de Biología Celular.

Una conexión inesperada con el cáncer

Herr y su socio de investigación, Departamento de Obstetricia y Ginecología el biólogo Eusebio Pires, ambos se especializan en células germinales, las células reproductoras que forman los espermatozoides y los óvulos. Mientras investigaban nuevos métodos anticonceptivos, Pires y Herr descubrieron un vínculo sorprendente entre el desarrollo de óvulos y tumores. Ese vínculo puede permitir a los médicos usar anticuerpos para administrar medicamentos directamente a los tumores sin afectar el tejido sano.

En ese momento, Herr y Pires estaban estudiando una proteína llamada SAS1B que generalmente se encuentra solo en la superficie de los óvulos maduros y en desarrollo.

"A excepción del pequeño grupo de óvulos en crecimiento en el ovario, la proteína SAS1B está prácticamente ausente en otros tejidos del cuerpo", dijo Pires. "Entonces SAS1B tiene las características prometedoras de un objetivo anticonceptivo candidato".

La restricción de SAS1B al cultivo de huevos sugiere estrategias para desarrollar anticonceptivos femeninos mejorados que se dirigen selectivamente solo al grupo de huevos en crecimiento, reduciendo potencialmente los efectos secundarios no deseados de los anticonceptivos esteroides actuales.

Aunque el equipo se centró originalmente en SAS1B debido a su posible uso en anticoncepción, un solo dato en la base de datos GenBank de los Institutos Nacionales del Cáncer, que muestra la expresión de SAS1B en un cáncer de útero, llevó a su equipo a comenzar una búsqueda en la superficie. de varios tipos de cáncer. Hasta ahora, han encontrado que SAS1B se expresa en cánceres de mama, melanoma, útero, riñón, ovario, cabeza y cuello y páncreas. También hay evidencia que sugiere que aparece en cánceres de vejiga.

“La investigación abre un nuevo campo de investigación, denominado neoantígenos de ovocitos de cáncer, y revela un aspecto fundamental del cáncer que antes no se conocía: que muchos tipos de cáncer, cuando se desregulan o salen mal, revierten y adquieren características del óvulo, la célula original de la que se derivan todos los tejidos del cuerpo ”, dijo Herr.

Él y Pires han encontrado una manera de explotar esta información fundamental mediante el desarrollo de un método para administrar medicamentos utilizando la proteína SAS1B como objetivo.

Pequeños rastreadores de cáncer: anticuerpos armados con cargas útiles de fármacos

Dado que la proteína SAS1B aparece solo en óvulos y células cancerosas, la molécula puede servir como objetivo para pequeñas sondas de rastreo creadas con anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos muy puros diseñados para unirse a una única proteína diana con una afinidad uniforme. Los anticuerpos monoclonales se unen a cualquier célula marcada con proteínas SAS1B. Entonces, los complejos anticuerpo monoclonal-SAS1B pueden funcionar como pequeños inyectores para medicamentos dirigidos.

“Se agrega un anticuerpo dirigido a SAS1B con un fármaco y, a los 15 minutos de entrar en contacto con las células cancerosas, el anticuerpo se une a la superficie celular y los complejos anticuerpo-SAS1B comienzan el proceso de internalización”, dijo Herr.

Después de aproximadamente una hora, los complejos anticuerpo-SAS1B llegan a los compartimentos dentro de la célula y liberan su carga útil de fármaco tóxico, lo que desencadena cambios que conducen a la muerte celular en unos pocos días.

Este tipo de administración de fármacos dirigida podría significar una reducción drástica de los difíciles efectos secundarios del tratamiento tradicional contra el cáncer, como la caída del cabello, las náuseas, la anemia y la neuropatía. Tanto mujeres como hombres pueden utilizar el tratamiento, que se prevé que limitará drásticamente los efectos secundarios no deseados en las células normales sanas. Especialmente para las pacientes con cáncer, un medicamento que no toque la reserva de óvulos inactivos de su cuerpo podría ser un gran avance.

Preservando la fertilidad

Si bien los anticuerpos monoclonales tendrían que atacar el conjunto de óvulos en crecimiento además de las células cancerosas positivas para SAS1B, el suministro de óvulos inactivos de los ovarios permanecería sano y sin ser afectado por el tratamiento. Esto significa que la ovulación normal podría comenzar nuevamente una vez que se complete el tratamiento y los ovocitos se recluten nuevamente para desarrollar y ovular un proceso que se espera que tome aproximadamente 200 días.

Además de tratar el cáncer, estos anticuerpos selectivos también podrían conducir a un nuevo método para la detección y prevención precoces del cáncer. Pires explicó que el equipo de investigación está desarrollando una forma de encontrar pequeñas cantidades de proteínas SAS1B de libre circulación en el cuerpo.

“Podría ser un descubrimiento valioso en términos de pruebas de requisitos previos para identificar a los pacientes que tienen tumores que producen SAS1B”, dijo.

Pires y Herr esperan que algún día los médicos puedan usar los anticuerpos monoclonales para medir los niveles de proteína SAS1B en sangre de los pacientes. Aquellos con niveles elevados de la proteína serían evaluados para las primeras etapas del cáncer y recibirían tratamiento antes.

Mientras afinan este método de detección temprana, Herr y Pires planean comenzar a probar su tratamiento de anticuerpos calificado en organismos modelo que portan tumores humanos en los laboratorios de la U.Va. este otoño.

"Si todo va bien, en menos de un año sabremos si estamos listos para proponer un estudio para realizar pruebas en poblaciones humanas seleccionadas", dijo Pires.

Hallazgos publicados

Los hallazgos de los investigadores se han publicado en la revista científica Oncotarget en un artículo escrito por Eusebio S. Pires, Ryan S. D'Souza, Marisa A. Needham, Austin K. Herr, Amir A. Jazaeri, Hui Li, Mark H. Stoler, Kiley L. Anderson-Knapp, Theodore Thomas, Arabinda Mandal, Alain Gougeon, Charles J. Flickinger, David E. Bruns, Brian A. Pollok y John C. Herr. El artículo completo se titula "El neoantígeno SAS1B / ovastacina de ovocitos y cáncer asociado a la membrana es una diana inmunoterapéutica candidata para los tumores uterinos".

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH Fogarty International Center, el Programa de Exploración de Grandes Desafíos de la Fundación Bill y Melinda Gates, The Wallace H.Coulter Translational Research Partnership Endowment, The Paul Mellon Urologic Oncology Institute en el Cancer Center de la University of Virginia, The Virginia Center for Innovative Technology con el apoyo de Neoantigenics, Inc., y The Virginia Biosciences Health Research Corporation.


¿Es posible producir una célula cancerosa que no codifique ningún neoantígeno? - biología

La biología sintética jugará un papel importante en el avance de la terapia de células T adoptivas.

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Tecnologías centrales

Las mutaciones se acumulan en las células debido a agresiones ambientales como la luz ultravioleta y el humo del cigarrillo y por errores esporádicos de replicación del ADN que ocurren durante la proliferación celular normal. Las mutaciones que confieren la capacidad de proliferar sin el control de los sistemas reguladores normales del cuerpo a menudo se denominan mutaciones impulsoras. Las células con tales mutaciones impulsoras pueden llegar a ser abundantes en la población tumoral. Cada vez que estas células se dividen, existe la posibilidad de que se produzcan mutaciones adicionales debido a errores al copiar el ADN. Por lo tanto, además de las mutaciones impulsoras, las células tumorales a menudo acumulan daños aleatorios en muchas otras partes del genoma, incluidas aquellas que no aceleran el crecimiento del cáncer, estas se denominan mutaciones pasajeras.

El paisaje mutacional de un tumor se compone de mutaciones tanto del conductor como del pasajero, que se pueden identificar mediante la secuenciación de próxima generación de alto rendimiento. Estudiar el número de cada uno, su abundancia en la población y qué mutaciones parecen haber evolucionado juntas puede revelar información clave sobre la presión selectiva a la que se encuentra el tumor (debido a la competencia por recursos limitados como nutrientes y oxígeno, luchando por mantener los procesos celulares esenciales a pesar del rápido crecimiento o de ser atacado por el sistema inmunológico) y puede ayudarnos a elegir combinaciones precisas de terapias para atacar las debilidades genéticas e inmunogénicas del tumor.

Nuestro canal de llamadas de mutación actual implementa cuatro llamadores de mutaciones somáticas (MuTect, Strelka, Somatic Sniper y VarScan) para aumentar la confianza de las llamadas. Las mutaciones de baja confianza, como las variantes de baja cobertura, las regiones de baja capacidad de mapa (fuente: encodeproject.org/annotations/ENCSR636HFF/) y los loci de secuencias de ADN con repeticiones y baja complejidad (fuente: www.repeatmasker.org) se filtran automáticamente y las mutaciones seleccionadas se revisan manualmente para garantizar la calidad.

Utilizamos la secuenciación del exoma completo, la secuenciación del genoma completo y la secuenciación de genes dirigidos para identificar los factores genómicos que afectan la actividad inmunitaria antitumoral. Brevemente, nuestros mapas de tubería refinados, la secuencia sin procesar lee en el genoma de referencia humano (GRCh37 / hg19), se anotan las posiciones de las inserciones, deleciones y variaciones de nucleótidos y se eliminan los artefactos de la preparación de la biblioteca.

Personal: Nadeem Riaz, Nils Weinhold, Rajarsi Mandal, Jonathan Havel, Luc Morris

Clonalidad

Estamos interesados ​​en comprender la composición clonal de los tumores. Un clon se define como un grupo de células que comparten las mismas mutaciones, posiblemente debido a un linaje compartido. Cuando un tumor contiene muchos de estos linajes, se le llama "subclonal", y estos subclones que surgen de forma distinta pueden acumular nuevas mutaciones que proporcionan ventajas de crecimiento, lo que les permite superar a los subclones menos competitivos. Con el tiempo, los subclones más competitivos constituyen una mayor proporción general del tumor.

No todos los subclones de un tumor responden necesariamente a la inmunoterapia de la misma manera. Algunos subclones pueden portar mutaciones que provocan una respuesta inmunitaria más fuerte que otros. Por lo tanto, es importante comprender la composición clonal de los tumores para diseñar estrategias que se dirijan a una cantidad suficiente del tumor para perturbar su crecimiento a un nivel clínicamente mensurable.

Estimamos la frecuencia relativa de células dentro de un tumor que portan una mutación según los datos de secuenciación del genoma. Para cada mutación, calculamos la fracción de células cancerosas (CCF) en función de la frecuencia alélica variante de la mutación, su número de copias y la pureza de la muestra. El análisis de CCF puede ayudarnos a identificar subclones de células que se desarrollan de forma independiente durante la vida útil de un tumor y deducir la relación entre la aptitud de esos subclones en relación con otros, así como su susceptibilidad a la focalización inmunitaria.

En una población de células tumorales, a menudo se encuentran mutaciones particulares (círculos de colores) en subconjuntos de células; cualquier célula tumoral determinada contiene algunas, pero no todas, las mutaciones observadas en la población en su conjunto. La eficacia de una inmunoterapia que refuerza la respuesta de las células T a una proteína tumoral mutada en particular puede estar fuertemente influenciada por la cantidad de la población de células tumorales que expresa esa proteína mutante. (Cima) La inmunoterapia n. ° 1 mejora la respuesta de las células T a la proteína A mutante (rosa), que se encuentra en el 50% de las células tumorales. Por lo tanto, cuando la inmunoterapia n. ° 1 permite que estas células T se activen y maten a sus objetivos, la mutación A se elimina del tumor, pero el otro 50% de las células tumorales permanece. (Fondo) La inmunoterapia n. ° 2 mejora la respuesta de las células T a la proteína B mutante (violeta), que se presenta en el 75% de las células tumorales, por lo que el tratamiento da como resultado que solo el 25% de las células tumorales (aquellas sin la mutación B) persistan. Al medir la abundancia de mutaciones en una población de células tumorales a lo largo del tiempo, incluso durante la terapia, podemos aprender cómo se relacionan las mutaciones. Por ejemplo, cuando una mutación desaparece o se vuelve más común, ¿qué otras mutaciones la acompañan? También podemos determinar cómo actúan las inmunoterapias sobre la respuesta inmune. ¿Algunas terapias solo refuerzan las respuestas de las células T a una pequeña cantidad de antígenos, mientras que otras apoyan una estimulación más amplia de las células T? En conjunto, esta información sobre el objetivo del tumor y la naturaleza de la respuesta inmune estimulada se puede utilizar para diseñar con mayor precisión la terapia para cada paciente.

Predicción de neoantígenos

Un obstáculo importante para el desarrollo de una respuesta inmunitaria fuerte y eficaz a un tumor en crecimiento es el hecho de que las células tumorales son muy similares al tejido sano. Los antígenos que surgen en las células tumorales debido a mutaciones (neoantígenos) permiten que el sistema inmunológico reconozca esas células tumorales como no propias y, por lo tanto, pueden desencadenar una respuesta inmunitaria específica del tumor. Se cree que el número de neoantígenos presentes en un tumor es un factor crucial que determina si una inmunoterapia tendrá éxito para generar una respuesta inmune antitumoral eficaz.

Estamos desarrollando activamente nuevos enfoques computacionales para identificar neoantígenos en cánceres humanos. Nuestro método actual utiliza la misma tubería de llamada de mutación somática que se describe anteriormente (ver Secuenciación genómica), seguida de un análisis de neoepítopo.

Nuestro algoritmo para predecir neoepítopos traduce todas las mutaciones sin sentido identificadas por el proceso de mutación genómica, genera todos los péptidos de 9 aminoácidos (la longitud del péptido presentada con más frecuencia) que contendrían la mutación y utiliza la herramienta netMHC para comparar la tasa predicha de presentación del péptido mutado al péptido de 9 aminoácidos con el aminoácido no mutado (tipo salvaje) en la misma posición por los alelos HLA particulares de ese paciente. Los péptidos para los que la versión mutada se presenta con más fuerza que el tipo salvaje se consideran neoantígenos potenciales.

Personal: Nadeem Riaz, Vladimir Makarov, Diego Chowell

Para comprender mejor la interacción específica entre las mutaciones de un paciente y el sistema inmunológico, los péptidos mutantes se prueban sistemáticamente para determinar su inmunogenicidad, la capacidad de activar las células T tomadas del mismo paciente. Los resultados de este tipo de detección de antígenos pueden ayudar en la creación de inmunoterapias más personalizadas, como vacunas específicas para tumores o terapias de células T adoptivas. Además, la IPOP busca comprender las contribuciones relativas de diferentes tipos de mutaciones y antígenos a las respuestas inmunitarias efectivas con el objetivo de hacer que las terapias específicas del paciente sean más precisas.

Para maximizar la eficacia del cribado, se generan plásmidos que codifican múltiples minigenes en tándem (TMG). Un solo minigen consiste en el ADN que codifica una mutación somática flanqueada en ambos lados por doce aminoácidos de la proteína de origen de tipo salvaje. Se encadenan hasta diez minigenes para generar los TMG utilizados en el cribado. A continuación, se introduce ARNm transcrito in vitro en células dendríticas (DC) autólogas mediante electroporación para permitir el procesamiento y la presentación de HLA de los péptidos que contienen mutaciones somáticas. Las células T derivadas del paciente se cultivan conjuntamente con DC transfectadas con TMG. La activación de células T inducida por péptidos neoantígenos se cuantifica mediante la detección de la producción de citocinas (p. Ej., Interferón gamma) utilizando el ensayo ELISpot de alta sensibilidad. Los resultados se desconvolucionan mediante la retro-mutación (a tipo salvaje) de cada una de las diez mutaciones contenidas en un TMG reactivo y probando cada una para la producción de citocinas en el ensayo de cocultivo descrito anteriormente. La tinción de citocinas intracelulares se utiliza para la validación ortogonal de cualquier acierto positivo de un cribado de antígenos de minigén.

Personal: Raghu Srivastava, Jonathan Havel, Wei Wu

Las células inmunitarias adaptativas (células T y células B) nos ayudan a reconocer amenazas específicas, como patógenos microbianos (por ejemplo, bacterias, virus, hongos) y tumores. Cada célula T o célula B expresa un receptor en su superficie, el receptor de células T (TCR) o el receptor de células B (BCR), respectivamente, que puede unirse a un objetivo molecular particular y difiere de una célula inmunitaria a la siguiente. Cuando un TCR o BCR encuentra su molécula diana, llamada antígeno, se le indica a la célula T o B que se divida y se multiplique. Cada receptor es único, generado por recombinación aleatoria y alteración del ADN durante el desarrollo en una célula T o B madura, y la cantidad de TCR diferentes que puede generar una persona es enorme: entre 10 12 y 10 20 en el transcurso de un período de tiempo. de por vida, con

10 9 presentes en el repertorio en un momento dado. Es la vasta diversidad de estos receptores lo que permite a cualquier persona responder a antígenos que su sistema inmunológico nunca ha encontrado antes y formar un “ejército” contra un antígeno en particular si representa una amenaza.

Expansión de células T específicas de tumores. A. Cuando el TCR de una célula T se une fuertemente a un antígeno diana, la célula T se activa y prolifera. Por lo tanto, ese TCR se representa con una frecuencia expandida en la población. B. En el contexto de un tumor, una célula T cuyo TCR reconoce un antígeno específico de tumor puede estar representada en mayor abundancia por el mismo mecanismo. Con la inmunogenómica, podemos aprender sobre los tumores y las células T que los reconocen en paralelo: ¿Cuántos TCR hay? ¿Qué tienen en común? ¿Los pacientes con el mismo tumor comparten los mismos TCR expandidos? ¿Cómo reflejan y predicen las proporciones de estos TCR los cambios en la abundancia de dianas de antígenos tumorales?

Muchas de estas células inmunitarias no circulan libremente en la sangre, sino que se infiltran y proporcionan vigilancia en los tejidos. Esta población de linfocitos infiltrantes de tejido (TIL) difiere de la población circulante en que la primera representa solo una pequeña muestra del repertorio total de células T que controlan cualquier tejido en particular, en función de sus receptores, así como de factores de crecimiento y otras moléculas de señalización - para residir en ese órgano o tejido en particular.

Las bibliotecas de TCRseq representan una muestra del repertorio de células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y sangre periférica. Si bien algunos TCR ocurren a la misma tasa en ambas poblaciones (rosa), algunos TCR son relativamente más abundantes en los TIL que en la sangre periférica (verde, púrpura), mientras que algunos tienen una abundancia mucho menor, hasta el punto de que no lo son. t detectado (cian). Los TCR que están más enriquecidos en el tejido tumoral pueden residir allí de manera desproporcionada porque sus TCR se unen a antígenos que están presentes solo en el tejido tumoral, lo que hace que estas secuencias sean de interés para estudios posteriores, como posibles biomarcadores de la progresión tumoral o como plantillas u objetivos terapéuticos ( vea abajo).

Los avances recientes en la secuenciación de próxima generación de alto rendimiento nos permiten capturar los TCR de una muestra completa (TCRseq) (células sanguíneas circulantes o tejido infiltrado por células T) y describir la población en términos de la distribución de esos TCR. Utilizando estadísticas, analizamos la diversidad de estas poblaciones, las comparamos entre sí y buscamos patrones en los grupos de pacientes que reciben tratamiento por cáncer. ¿En qué se diferencia el repertorio de TCR dentro de un tumor del de la sangre circulante?

Actualmente estamos definiendo propiedades que indican reactividad específica del tumor: ¿Cómo se ve la respuesta de las células T antitumorales cuando está funcionando? ¿Cuándo está fallando? ¿Cuándo se ha restaurado mediante inmunoterapia? Estas propiedades pueden ser útiles como biomarcadores multidimensionales para controlar la progresión tumoral y la respuesta terapéutica. También estamos utilizando la secuenciación del repertorio de TCR para identificar receptores que podrían adaptarse para su uso como terapias antitumorales.

Las secuencias de TCR particulares asociadas con la progresión o la regresión de un tumor podrían usarse directamente para desarrollar terapias. (Cima) Los TCR de las células T citolíticas (CTL) que se expanden concomitantemente con la regresión del cáncer podrían probarse como plantillas para las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) modificadas genéticamente, que podrían reconocer y atacar el tumor utilizando un receptor basado en ese TCR. (Fondo) Las células T reguladoras (Tregs) que inhiben la actividad de los CTL antitumorales activos (protegiendo así el tumor) podrían bloquearse mediante inmunoterapias dirigidas a sus TCR.

TCRseq @ MSK

Realizamos la secuenciación de TCR de muestras clínicas en el sitio en colaboración con la Operación de Genómica Integrada, proporcionamos análisis de los datos de secuenciación sin procesar (cuando corresponda), así como análisis de usuario final con soporte (en desarrollo). IPOP actualmente admite las siguientes plataformas comerciales de generación de bibliotecas TCR:

  • Perfil iR (TCRa y TCRb) - iRepertoire
  • Creación de perfiles a / b de TCR humano más inteligente (TCRa y TCRb) - Clontech
  • ImmunoSEQ (solo TCRb) - Biotecnologías adaptativas

Estamos probando e integrando activamente nuevos productos y plataformas, y desarrollando herramientas analíticas relacionadas con la inmunoterapia en colaboración con cBioPortal.

Personal: Jennifer Sims y Jonathan Havel

Uno de los objetivos de IPOP es extraer la información inmunogenómica que permitirá a los médicos anticipar qué pacientes tienen más probabilidades de responder a la inmunoterapia. Estudiamos el fenotipo tumoral, o comportamiento celular, que está determinado en gran medida por los niveles en los que se expresa cada gen. En particular, utilizamos la secuenciación de alto rendimiento de ARN de biopsias de tumores para estudiar cómo cambia la expresión de genes a medida que avanza el cáncer, cuándo se administra la terapia y cuándo la terapia es efectiva. La comparación de tumores de pacientes que responden con los de pacientes que no nos permite identificar conjuntos distintos de características tumorales que puedan traducirse en biomarcadores diagnósticos, pronósticos y terapéuticos que se utilizarán en pacientes futuros.

Los niveles de expresión de los genes también proporcionan información sobre el entorno en el que evoluciona el tumor, en particular cómo reacciona el propio sistema inmunológico del paciente. Usando técnicas computacionales de vanguardia, podemos integrar esta información para comprender qué tipos de células inmunes tienen éxito en este proceso.

Expresión diferencial

Los tumores difieren entre sí, en parte porque el sistema inmunológico de cada paciente reacciona a un tumor utilizando un conjunto único de células para tratar de destruirlo. El comportamiento anormal de las células tumorales, la actividad inmunitaria antitumoral específica, la actividad inmunitaria inflamatoria no específica y el daño tisular dan forma a los perfiles de expresión génica de las células tumorales y no tumorales de formas únicas.

El ARN del tejido tumoral se somete a una secuenciación de próxima generación de alto rendimiento, lo que genera "lecturas" cortas de nucleótidos como salida. Estas lecturas están ordenadas y alineadas con el genoma humano, dando la cantidad de ARN de cada gen. Para cada gen, podemos probar estadísticamente la expresión diferencialmente más alta o más baja entre dos grupos de muestras (por ejemplo, los tumores de los pacientes que responden a la terapia y los pacientes que no responden). Entonces podemos identificar genes expresados ​​diferencialmente, o grupos de genes funcionalmente relacionados, que reflejan diferentes programas de genes expresados ​​o diferentes composiciones celulares entre tumores.

Una aplicación de los análisis de expresión génica diferencial es comparar los perfiles de pretratamiento y postratamiento de los tumores que respondieron a la inmunoterapia con los que no lo hicieron. También podemos identificar genes marcadores o grupos de genes relacionados funcionalmente que, si son inusualmente altos o bajos antes del tratamiento, se corresponden con mejores respuestas a terapias particulares. Estas firmas predictivas podrían permitir una simple biopsia previa al tratamiento para ayudar a adaptar el régimen de tratamiento de un paciente.

En IPOP, nuestra canalización para automatizar y visualizar estos análisis mejora constantemente. Las herramientas de visualización de datos de alta dimensión, como oncoprints y mapas de Visne, nos permiten organizar y representar docenas de parámetros (p. Ej., Datos de expresión génica RNASeq en paralelo con parámetros clínicos) simultáneamente, sin sacrificar su complejidad, para enriquecer nuestra comprensión del entorno inmunológico del cáncer. .

En un estudio reciente, la agrupación jerárquica de la expresión de genes en biopsias de tumores de pacientes que respondían fuertemente (+++), respondían débilmente (+) o no respondían (-) a la terapia anti-PD-1 identificó dos subconjuntos de genes, uno de los cuales se expresó en gran medida entre los pacientes clínicamente sensibles y uno de los cuales se expresó en gran medida entre los pacientes que no respondieron. El enriquecimiento de genes relacionados funcionalmente en estos grupos se puede utilizar para inferir cómo dicha firma genética está relacionada con estos niveles de respuesta inmune.

Composición celular (deconvolución in silico)

Muchos tipos diferentes de células inmunitarias se infiltran en los tejidos, donde desempeñan diferentes funciones en la vigilancia de tumores, lesiones o infecciones. Por ejemplo, ciertos tipos de células T son capaces de matar directamente células disfuncionales, tumorigénicas o infectadas, mientras que los monocitos y macrófagos absorben restos de células que flotan libremente y presentan estos posibles antígenos a las células T.Esta interacción, que requiere tanto células T como células presentadoras de antígenos, puede ayudar a activar o suprimir localmente todas las células T que reconocen los mismos antígenos. Mientras tanto, las células B producen anticuerpos que pueden extenderse rápidamente por todo el cuerpo para neutralizar una amenaza particular. Por tanto, la abundancia relativa de diferentes tipos de células puede indicar qué modos de reconocimiento de tumores están activos y cuáles pueden suprimirse.

El tipo y grado de infiltración inmunitaria en los tumores juega un papel importante en la eficacia de la inmunoterapia. La abundancia del ARN mensajero (ARNm) de genes particulares en una biopsia de tejido no solo nos permite identificar genes de expresión diferencial entre muestras, sino que también nos permite calcular la abundancia relativa de diferentes tipos de células inmunes en el microambiente local. En resumen, a partir del ARNm de la muestra global, podemos detectar una alta expresión de genes característicos o el enriquecimiento de un subconjunto de genes que son específicos de un tipo de célula, y compararlo con la expresión de genes específicos de otros tipos de células. Usamos algoritmos computacionales como Supporter Vector Machines (SVMs) o Single-Sample Gene Set Enrichment (ssGSEA) para traducir la expresión de estas firmas en abundancias relativas de las correspondientes poblaciones de células inmunes.

Debido a que las inmunoterapias realizan diferentes funciones, como mantener la activación de las células inmunitarias, rescatar las células inmunitarias que se activaron y luego se agotaron o estimular la reactividad antitumoral entre las células inmunitarias que antes no estaban expuestas a los antígenos tumorales, comprender qué tipos de células inmunitarias están presentes (o no) en el microambiente tumoral tiene implicaciones para predecir la respuesta a estas inmunoterapias y elegir la adecuada para cada paciente.

De una muestra de tumor a granel, las moléculas de ARNm se extraen de la mezcla de células inmunes (de color y gris) y células no inmunes (marrones, como un tumor). La ejecución de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento en la mezcla de ARNm proporciona el perfil de expresión génica de la muestra de biopsia (izquierda). Utilizando firmas de expresión génica conocidas, la proporción de moléculas de ARNm que representan cada población inmunitaria infiltrada se puede desconvolucionar (abajo) y se puede inferir la composición (abundancia relativa) de los tipos de células inmunitarias en la población (derecha).

Personal: Fengshen Kuo, Alexis Desrichard

Las células T reconocen las amenazas microbianas y el cáncer al unirse a fragmentos degradados de proteínas extrañas (péptidos) que les presentan las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Estas moléculas de presentación se expresan en la superficie de la mayoría de los tipos de células, pero especialmente en determinadas células inmunitarias que vigilan los tejidos.

Los genes que codifican las proteínas MHC de clase I (denominados genes HLA de clase I en humanos) se encuentran en el cromosoma 6 y hay tres de ellos: HLA-A, HLA-B y HLA-C. Cada persona tiene dos copias (alelos) de cada gen (una de cada padre), y dado que estos genes son los más polimórficos (variables en la secuencia de ADN) de todo el genoma humano, los seis alelos que tiene cada persona suelen ser todos diferentes, y rara vez coinciden con los de individuos no relacionados genéticamente. Hay alelos específicos (por ejemplo, HLA-A * 02: 01) que son más frecuentes en todo el mundo. Además, la frecuencia de los alelos HLA varía según las regiones geográficas y las poblaciones.

Frecuencia de alelos HLA-A seleccionados en diferentes regiones geográficas. Se muestran las frecuencias normalizadas de algunos alelos HLA-A en diversas regiones geográficas. Para cada alelo HLA-A, cada barra de color representa la frecuencia del alelo en una región geográfica particular. Los datos se obtuvieron de http://www.allelefrequencies.net/.

Estamos examinando cómo los alelos HLA que usa un paciente afectan la respuesta a la inmunoterapia. La presentación de péptidos a las células T por las proteínas MHC juega un papel crítico en la respuesta inmune adaptativa e influye fuertemente en cómo las células T responden a ese péptido. Por ejemplo, algunas moléculas de MHC activan fuertemente las células T, lo cual es deseable si ese antígeno representa una amenaza (como una infección viral o una proteína disfuncional o mutada producida por un tumor) pero puede ser peligrosa si el antígeno es normal y se presenta en una persona sana. células. Dado que potenciar el reconocimiento correcto de péptidos propios frente a péptidos no propios por parte de las células T es una función importante de los MHC, y esta distinción se confunde en el caso del cáncer, es importante utilizar datos de secuenciación genómica para identificar qué seis alelos HLA tiene un paciente. al tratar de determinar cómo reaccionará su sistema inmunológico a sus péptidos tumorales mutados.

Actualmente, el estándar de oro para identificar qué alelos HLA tiene un paciente es la tipificación basada en PCR, en la que el locus HLA se amplifica específicamente y luego se secuencia. Dado que la secuenciación genómica ha logrado una cobertura cada vez mayor, el genotipado de HLA in silico ofrece una alternativa eficiente que es económica cuando el genoma de un paciente ya se está secuenciando. Las herramientas de software actuales proporcionan una resolución precisa de hasta el 99% para la mayoría de las aplicaciones clínicas. Para aplicaciones clínicas que requieren una mayor precisión, como la predicción de la presentación de antígenos tumorales por ciertos alelos HLA, que difieren de sus otros alelos más cercanos en solo unos pocos nucleótidos, estamos refinando los procesos computacionales para la identificación de HLA utilizando enfoques de conjunto, ponderación basada en la población y ensamblajes alternativos de los genomas humanos de referencia.

Personal: Diego Chowell, Vladimir Makarov, Fengshen Kuo

Comprender la composición celular de las células tumorales e inmunes a nivel de marcadores proteicos fenotípicos es una parte fundamental de la investigación de la inmunología tumoral. IPOP utiliza varias técnicas experimentales para cuantificar mejor la expresión de proteínas de interés en células tumorales e inmunes individuales. La citometría de flujo basada en anticuerpos permite la cuantificación precisa de proteínas extracelulares e intracelulares de interés. Utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), las poblaciones de células tumorales o inmunitarias individuales se pueden subdividir aún más para el análisis posterior, incluida la secuenciación de ADN y ARN.

En ocasiones, los investigadores pueden desear cuantificar la expresión de una gran cantidad de proteínas intracelulares y extracelulares simultáneamente a partir de una sola muestra. La citometría de flujo convencional limita el número de parámetros simultáneos detectables debido a la superposición espectral generada por el fluoróforo. Para superar esta barrera, IPOP utiliza la tecnología de citometría de masas por tiempo de vuelo (CyTOF). CyTOF identifica proteínas intracelulares y extracelulares utilizando anticuerpos conjugados con metales pesados ​​de tierras raras. Después de la tinción basada en anticuerpos, la muestra se ioniza y posteriormente se identifica la composición de anticuerpos de las células individuales. La principal ventaja de CyTOF es su capacidad para analizar un panel robusto definido por el usuario de dianas celulares simultáneamente a partir de una sola muestra utilizando un enfoque basado en anticuerpos. Los datos multiparamétricos se pueden analizar posteriormente utilizando software de citometría de flujo convencional o técnicas más sofisticadas que incluyen gráficos SPADE o ViSNE. Los proyectos IPOP CyTOF se realizan actualmente en colaboración con Mount Sinai Human Immune Monitoring CORE (HIMC) (212-824-9354, [email protected]).

Los linfocitos infiltrantes de tumores y las células mononucleares de sangre periférica de un paciente con carcinoma escamoso de cabeza y cuello se agruparon mediante su tinción para marcadores inmunofenotípicos (los grupos representan células con fenotipos similares, donde la proximidad en el gráfico indica similitud), utilizando el vecino estocástico con distribución t algoritmo de incrustación (t-SNE). La escala de color indica la proteína CD8 detectada, normalizada a través de las células, que distingue los tipos de células (agrupaciones) que expresan este marcador del linaje de células T citolíticas.


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