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Selección de LacZ ': colonias azules a pesar de la ligadura del inserto

Selección de LacZ ': colonias azules a pesar de la ligadura del inserto


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Se ha sugerido que las bacterias transformadas con el vector pBlueScript, que contiene un inserto en el medio del gen lacZ ', aún pueden dar color azul en X-gal, si el inserto es pequeño y está ligado en marco con el gen lacZ' (fuente : mi curso, ResearchGate).

No entiendo cómo es posible que la traducción no termine en el codón de parada codificado por el inserto. ¿Tiene algo que ver con la terminación con fugas? Además, incluso si fuera posible una terminación con fugas, esto significaría que SIEMPRE hay una posibilidad de 1 en 3 de que el inserto esté en el marco.


La mayoría de los insertos interrumpirán la expresión de beta-gal (cambiando el marco de lectura e introduciendo codones de parada) y, por lo tanto, eliminarán la actividad enzimática necesaria para escindir X-gal y producir el color azul.

Su fuente está de acuerdo con usted: insertar un codón de parada detendrá la traducción (no la transcripción) y mantendrá el color blanco.


Muchas colonias, pero todas son azules. ¿Necesito ajustar las proporciones de ligadura? (03 / Mayo / 2007)

El vector es pCR2.1 (¿o se llama pCRDNA2.1? Es de Invitrogen) un vector TA simple con selección azul / blanco en ampicilina. I asumir los extremos están desfosforilados.
Cuando me transformo, obtengo muchas colonias, pero casi todas son azules. Un cribado de colonias (M13 PCR) muestra un producto demasiado pequeño, probablemente un vector vacío, para todas las colonias blancas y las azules que también cribé.

Entonces: eficiencia de transformación decente, pero los vectores lo son. autoligado?

Mis reacciones de ligadura son típicamente:
2ul de tampón (5x)
0,5 ul de ligasa T4
0.5ul vector
2ul inserto
5ul de agua

Ligar 5 minutos a temperatura ambiente, transformar 4ul

Entonces, ¿quizás mi relación inserto: vector no es lo suficientemente alta? El inserto es un producto de PCR limpiado de un gel. ¿Es simplemente una cuestión de probar diferentes proporciones?

Editar: Debo mencionar que esta es la primera vez que uso pCRDNA 2.1. Normalmente uso pGEM-T pero se me acabó. No sé cuántos años tiene este tubo de pCRDNA 2.1. Hasta ahora no me gusta mucho este vector de clonación, no me ha dado más que problemas

No he clonado TA durante varios años, pero si tengo razón, ese es un vector con extremos pegajosos y, si eso es cierto, entonces tengo la respuesta. el problema es que la cola del inserto de poli A se suelta durante la limpieza del gel, por lo que no hay forma de que se produzca una ligadura. No es necesario limpiar el inserto si solo hay un producto de PCR.

Solo para estar seguro, ¿está utilizando la polimerasa Taq para hacer que el producto de PCR sea correcto? No hay polimerasa de corrección de pruebas aquí.

¿Sabes cuánto inserto estás agregando? ¿Podría haber problemas con la recuperación del producto del kit de limpieza?

Si su reacción de PCR está limpia (solo una banda (su producto) y libre de bandas secundarias), podría ser una idea clonar directamente con TA su producto de PCR. Cuanto más esperen los productos de PCR, es más probable que empiecen a perder el voladizo A.

Además, ¿la ligasa T4 en particular y el tampón de ligasa todavía están en buenas condiciones? La ligasa T4 se apaga con bastante facilidad y al tampón de ligasa no le gustan los ciclos de congelación y descongelación. El ATP en el búfer se apaga.

Dado que se trata de la clonación de TA, el vector tiene un saliente T, lo que evita la religación.

Una lista de cosas sobre la clonación de TA
La clonación de TA se basa en que la polimerasa Taq añade A 3 & # 39 adicional al producto de PCR.
Taq solo agrega en promedio solo una A al 70% de los productos de PCR que fabrica.
La mayoría de las personas prefieren usar un producto de PCR fresco (también recomendado por el protocolo) ya que el saliente A cae después de un tiempo.
Lectura de pruebas de productos de PCR con extremos romos del producto de polimerasa.

También puede probar algunas de las colonias azules para un inserto. Dependiendo de lo que esté clonando, la expresión de LacZa activo puede ocurrir incluso con una inserción.

Eso es tan cierto. Si el inserto es pequeño y por suerte está en el marco del gen lacZ. Después de todo, el extremo N de la proteína LacZ no es muy importante, lo que permite la inserción del sitio de clonación múltiple en el gen en primer lugar.

Desearía no tener que purificar en gel 33 Desafortunadamente, no he tenido mucha suerte con mi PCR en las últimas semanas y, a menudo, obtengo múltiples bandas (si reconoces mi nombre de usuario, todavía estoy trabajando en eso maldito montaje PCR - funcionó tan bien las primeras veces & # 33)

Siempre examino todas mis colonias blancas y algunas azules por si acaso. Cuando estaba usando la enzima de corrección de pruebas para mi PCR de ensamblaje y ligándome en pCRBLUNT, tuve que seleccionar muchos azules porque mi inserto tiene exactamente 88 codones (por lo que LacZ todavía está en el marco). Con un vector TA no está en el marco, pero aún lo compruebo.

En teoría, sí & # 33. Pero en realidad seguí adelante y secuenció una de mis colonias que pensé que era positiva y la secuencia regresó con un vector TA re-ligado perfecto. Faltaban los "Yoes" adicionales. Es de suponer que el vector era antiguo y estaba perdiendo sus "yoes". Ese fue el pGEM-T que me he quedado sin desde entonces. pero como dije, no sé cuántos años tiene mi pCR2.1, así que tal vez sea incluso peor.

La ligasa es bastante reciente y pequeñas alícuotas de tampón de ligasa (en tubos de PCR) para minimizar la congelación repetida. En cualquier caso, parece que la ligadura está funcionando para cerrar el vector TA.

Parece que mi producto de PCR probablemente no tiene ninguna cola A. Aunque debería

Hay un documento donde caracterizan eso (probablemente lo hayas visto). Me emocioné mucho pensando que había encontrado mi problema, pero no, lo miré brevemente y mis cartillas están bastante cerca del consenso publicado en ese documento, por lo que realmente debería tener una cola.
¿Quizás perdió las colas A? Quizás, pero he intentado repetidos intentos de PCR y no parece arreglar las cosas.

De todos modos, parece que he pensado en las mismas cosas que ustedes. Pensándolo de nuevo ahora, probablemente tenga algo que ver con mis resultados de PCR realmente pobres en lugar de las condiciones de ligadura. Es una mala señal cuando mis muestras obtienen una banda y no hay nada en el negativo, pero tampoco en el control positivo.

Bueno, gracias por tu aporte & # 33

Cuando utilice un kit comercial, normalmente tendrá buenas posibilidades de ligarse. Verifique a través de invitrogen y avíseles.

Aunque no debería auto-ligarse. Pero de alguna manera es realmente difícil de juzgar. Si el problema persiste, quizás pueda comprobar sus productos de PCR. Secuenciarlo o algo así. Sí. Estoy de acuerdo contigo. En cambio, sospecho de sus productos de PCR. Salud.

si el vector es antiguo o se ha almacenado mal, es posible que haya perdido muchos de sus voladizos T. De lo contrario, dado que dice que debe purificar en gel su producto de PCR, ¿le queda suficiente ADN después de la purificación? ¿O intente agregar los voladizos A después de la limpieza?

No sé si tendré tiempo para revisar esa ligadura (la tesis se entregará en 2 semanas), pero otras personas han tenido problemas con la PCR, por lo que probablemente esa sea la causa.

La próxima vez que haga la clonación, voy a hacer PCR de extremo pegajoso. # 33 & # 33 Sin digestiones ni vectores TA & # 33

Jaja .. todo lo mejor para tu tesis. Erm. Debo decir que la clonación de TA es fácil de hacer en comparación con otros.


Proyección azul-blanca en el laboratorio

Los científicos descubrieron que eliminar una sección del lacZ El gen (una mutación llamada lacZΔM15) crea una enzima β-galactosidasa no funcional. Proporcionar ADN que codifica esta sección de aminoácidos (llamado péptido α) a una célula bacteriana mutante lacZΔM15 en trans complementa la mutación permitiendo una enzima funcional. Este proceso se denomina α-complementación.

El sistema descrito anteriormente se puso en práctica de la siguiente manera. Los científicos diseñaron un sitio de clonación múltiple (MCS) en el péptido α (representado como una cuña naranja en la figura de la izquierda) y lo insertaron en un plásmido, creando un vector de clonación de complementación α. Cuando una reacción de clonación va según lo planeado y su ADN (rojo) se clona en este MCS, el péptido α se interrumpe como se muestra en la celda A y, por lo tanto, no complementará la mutación de la β-galactosidasa de la célula. Una reacción de clonación fallida deja intacto el péptido α y, por lo tanto, la célula tendrá una enzima β-galactosidasa funcional a través de la complementación α (célula B).

Como se muestra en la placa representativa a la derecha, las colonias con un plásmido que contiene un inserto tienen una β-galactosidasa no funcional, y mantienen el hermoso color crema blanquecino del estándar. E. coli. Por otro lado, la β-galactosidasa intacta produce pigmento a partir de x-gal (incluido en el medio de la placa de transformación), volviendo azul la colonia bacteriana. Debemos tener en cuenta que IPTG también se incluye en el medio para garantizar la transcripción del laca operón.


Selección colorimétrica automatizada de colonias: cribado de colonias azul-blancas con la serie QPix 400

El cribado de transformantes bacterianos que contienen plásmidos recombinantes con insertos de genes clonados es un paso esencial en la clonación molecular. Un método informador colorimétrico llamado "cribado azul-blanco" permite la identificación conveniente de colonias recombinantes y no recombinantes según el color. Aunque el cribado azul-blanco proporciona una identificación visual de las colonias transformadas recombinantes, muchos pasos manuales en el proceso de selección de colonias son subjetivos, lentos y propensos a errores.

La serie QPix ™ 400 de recolectores de colonias microbianas de Molecular Devices ofrece una solución automatizada especialmente diseñada para un tramado colorimétrico azul-blanco preciso utilizando imágenes de luz blanca y para el monitoreo efectivo de la eficiencia de la transformación. La solución incorpora un módulo de selección azul-blanco QPix ™ Software 2.0, óptico QPix ™

Filtros cromáticos y soportes de placa fuente ajustables. Este punto culminante de la aplicación describe los resultados de un experimento colorimétrico de selección de colonias de prueba de concepto utilizando el sistema QPix ™ 420. La precisión de las colonias recogidas se verificó adicionalmente mediante secuenciación de ADN.

Principios del cribado azul-blanco

El mecanismo molecular del cribado de colonias azul-blancas se basa en la LacZ gen reportero. En esta técnica, las colonias no recombinantes con un funcional LacZ el gen que codifica la ß-galactosidasa se vuelve azul en presencia de medios de cultivo que contienen X-gal. Esto contrasta con la forma en que las colonias recombinantes con una alteración LacZ El gen debido a la inserción exitosa del gen se vuelve blanco (Figura 1).

Figura 1. Clonación molecular. Representación esquemática de un procedimiento de cribado azul-blanco típico. El cribado azul-blanco de colonias bacterianas implica la clonación de un gen insertado en un vector plásmido con resistencia a los antibióticos y LacZ gen reportero. La ligadura del inserto en el sitio de clonación múltiple del vector inactiva la LacZ gene. La transformación de competente E. coli con la mezcla ligada en presencia de X-gal en los medios de cultivo da como resultado la formación de colonias azules y blancas.

Uso de la clonación molecular para transfectar colonias con el gen de interés

Para crear una construcción modelo, se clonó el gen del factor de crecimiento similar a la insulina humana (IGF) en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector plásmido de clonación pUC57-Kan que contiene resistencia a la kanamicina y LacZ gen (Figura 2A). Químicamente competente E. coli (One Shot® TOP10, Life Technologies) se transformaron con el vector ligado y la mezcla de genes (IGF humano). A continuación, las bacterias transformadas se sembraron en placas sobre medio LB que contenía kanamicina, IPTG y X-gal y se incubaron durante la noche a 37ºC. Las colonias que contienen vectores con y sin el gen insertado se identificaron por color blanco o azul, respectivamente, con el sistema QPix 420 (Figura 2B).

Figura 2. Clonación de IGF humano en vector plásmido de clonación pUC57-Kan y selección de colonias azul-blancas. (A) El inserto de gen, IGF humano, se ligó en el MCS del vector de clonación del plásmido pUC57-Kan. (B) Aparecen colonias azules y blancas en las placas de medio LB que contienen X-gal como resultado de LacZ expresión génica basada en informador utilizada en el cribado de colonias azul-blancas.

Se colocaron soportes de placa fuente ajustables que sostenían placas de Petri que contenían colonias bacterianas en el lecho de formación de imágenes con un filtro cromático QPix (Figura 3A). Las petriplates se sujetaron de forma segura mediante pestillos ajustables en los soportes de las placas (Figura 3B) y se fotografiaron con luz blanca (Figura 3C).

Figura 3. El cribado de colonias azul-blanco que utiliza los sistemas QPix emplea (A) Filtros cromáticos ópticos QPix para una diferenciación de color mejorada y (B) soportes de placa de fuente ajustables para mejorar la flexibilidad de los artículos de plástico. Colonias fotografiadas bajo luz blanca (C) son analizados más a fondo por el software.

Selección automática de colonias azules o blancas

Las imágenes de luz blanca tomadas con el sistema QPix 420 se analizaron utilizando el software QPix 2.0, fácil de usar. Las colonias azules (Figura 4A) o blancas (Figura 4B) se identificaron automáticamente y se seleccionaron por separado utilizando la función de selección automática incorporada (Figura 4C). El usuario puede ajustar el umbral del histograma y definir criterios de selección de colonias, tales como compacidad, relación del eje, diámetro y proximidad manualmente para optimizar la selección. Las colonias azules y blancas seleccionadas se recogieron de forma robótica utilizando el cabezal de recogida de 96 pines totalmente neumático del sistema QPix 420.

Figura 4. (A) Las colonias azules de ejemplo seleccionadas con Auto Select Blue se indican con flechas azules. (B) Las colonias blancas de ejemplo seleccionadas con Auto Select White se indican con flechas blancas. (C) La flexibilidad del software permite el ajuste manual del umbral de intensidad para optimizar los resultados, como para seleccionar colonias azules con energía.

Confirmación de la secuencia de ADN de las colonias seleccionadas

La precisión de la selección colorimétrica y la recogida de colonias azules y blancas se confirmó mediante secuenciación de ADN para verificar la presencia del gen insertado. La amplificación del círculo rodante confirmó que el 98% de las colonias blancas recogidas contenían el inserto de gen clonado, IGF humano, en el vector de plásmido de clonación pUC57-Kan. Además, el 100% de las colonias azules recogidas contenían el vector de clonación pUC57-Kan vacío sin el gen insertado. Los resultados de este experimento brindan una confianza convincente para confirmar la diferenciación de color entre la selección de colonias blancas y azules utilizando la serie QPix 400 de recolectores de colonias microbianas.

Resumen

El cribado de colonias azul-blanco es un método de detección colorimétrico que permite una distinción conveniente de las colonias recombinantes transformadas que albergan el inserto del gen como resultado de la clonación molecular. Molecular Devices ofrece una solución automatizada diseñada para el cribado azul-blanco en la serie QPix 400 de recolectores robóticos de colonias microbianas. La interfaz de software fácil de usar de QPix Software 2.0, junto con los filtros ópticos, permite una diferenciación de color precisa y sólida en luz blanca. Los accesorios, como los soportes para placas con pestillos ajustables, mejoran aún más la compatibilidad de los artículos de plástico. Por lo tanto, la serie QPix 400 proporciona una alternativa altamente eficiente y confiable a los enfoques manuales convencionales basados ​​en colores para el cribado de colonias.


2 DISCUSIÓN (35%)

2.1. Si la enzima de restricción solo corta parcialmente el vector e inserta ADN, (1) ¿cómo sabrá esto y (2) cómo afectará la ligadura? Explica tus respuestas y relacionarlas con tus resultados. (límite de 150 palabras) (0,6 puntos)

Si el vector HindIII se corta parcialmente, dejaría 2 conjuntos de fragmentos, vectores completamente cortados o intactos. El inserto, Lambda, produciría sitios de restricción cortados o sin cortar. Esto a su vez afectaría a la ligadura ya que las hebras complementarias serían más difíciles de detectar o no detectarían en absoluto. La electroforesis en gel se puede utilizar para comprobar qué tan bien se han cortado el vector y los insertos observando los tamaños de fragmentos esperados de las imágenes de gel (Ditta, Stanfield, Corbin y ampamp Helinski, 1980)

2.2. ¿Cómo descartaría que las células competentes tuvieran contaminantes resistentes a ampicilina que generaron las colonias en las ligaciones 1-3? (límite de 60 palabras) (0,6 puntos)

Para que cualquier molécula de ADN crezca y forme colonias, debe contener genes resistentes a la ampilicilina. Un artículo Transformación bacteriana y selección de ampamp. (n.d.) declaró que el ADN de inserción lineal, el vector cortado, los plásmidos recombinantes y los plásmidos no recombinantes eran las mezclas de ligación que debían ser en placa. La ligadura 4, que es el control negativo, son los únicos plásmidos que no formarían colonias. Por tanto, se puede descartar.

2.3. Si no hay transformantes de las ligaciones 1-3, ¿cuál podría ser el problema? ¿Podría ser un problema en el proceso de transformación o ligadura, y cómo distinguiría esto? (límite de 60 palabras) (0,6 puntos)

Si no hay transformantes de las ligaciones 1-3, podría deberse a contaminación cruzada. Tener una contaminación resistente a ampicilina descartaría posibles errores por parte de la placa de agar. Aparte de la electroforesis en gel, el carril 5, que representa plásmidos de la colonia 1 blancos cortados con EcoRI, formaría colonias si se hubiera producido la transformación.

2.4. ¿Cómo el vector recircularizado y los plásmidos recombinantes producen colonias de diferentes colores en este experimento? Explique su respuesta (límite de 100 palabras) (0,6 puntos)

En los plásmidos recombinantes, los genes LacZ son la diferencia principal. Debido a que es resistente a la ampicilina y contiene el gen lacZ, tras la inserción en el gen LacZ, estaría inactivo. Según una investigación de Ditta, Stanfield, Corbin y Helinski (1980), esto altera la producción de b-galactosidasa que, en cambio, formará colonias blancas. En cuanto al vector recircularizado, el gen lacZ no se interrumpe y se


La clonación de plásmidos permite el aislamiento de fragmentos de ADN a partir de mezclas complejas

Puede insertarse un fragmento de ADN de unos pocos pares de bases hasta & # x0224820 kb en un vector plasmídico. Cuando tal plásmido recombinante transforma un E. coli célula, todas las células de la progenie resistentes a los antibióticos que surgen de la célula transformada inicial contendrán plásmidos con la misma secuencia insertada de ADN (Figura 7-3). El ADN insertado se replica junto con el resto del ADN plasmídico y se segrega en células hijas a medida que crece la colonia. De esta forma, el fragmento inicial de ADN se replica en la colonia de células en un gran número de copias idénticas. Dado que todas las células de una colonia surgen de una única célula parental transformada, constituyen un clon de células. El fragmento inicial de ADN insertado en el plásmido parental se denomina ADN clonado, ya que puede aislarse del clon de células.

Figura 7-3

Procedimiento general para clonar un fragmento de ADN en un vector plasmídico. Aunque no está indicado por el color, el plásmido contiene un origen de replicación y un gen de resistencia a ampicilina. Captación de plásmidos por E. coli Las células son estimuladas por altas concentraciones de CaCl (más.)

La clonación de ADN permite aislar fragmentos de ADN con una secuencia de nucleótidos particular de una mezcla compleja de fragmentos con muchas secuencias diferentes. Como ejemplo simple, suponga que tiene una solución que contiene cuatro tipos diferentes de fragmentos de ADN, cada uno con una secuencia única (Figura 7-4). Cada tipo de fragmento se inserta individualmente en un vector plasmídico. La mezcla resultante de plásmidos recombinantes se incuba con E. coli células en condiciones que facilitan la transformación, las células luego se cultivan en placas selectivas de antibióticos. Dado que cada colonia que se desarrolla surgió de una sola célula que tomó un solo plásmido, todas las células de una colonia albergan el mismo tipo de plásmido caracterizado por el fragmento de ADN insertado en él. Como resultado, las copias de los fragmentos de ADN en la mezcla inicial se aíslan entre sí en las colonias bacterianas separadas. Por lo tanto, la clonación de ADN es un método poderoso pero simple para purificar un fragmento de ADN particular a partir de una mezcla compleja de fragmentos y producir un gran número del fragmento de interés.

Figura 7-4

Aislamiento de fragmentos de ADN de una mezcla mediante clonación en un vector plasmídico. Se insertan cuatro fragmentos de ADN distintos, representados en diferentes colores, en vectores de clonación de plásmidos, produciendo una mezcla de plásmidos recombinantes que contienen cada uno un solo fragmento de ADN. (más. )


Paso 2 de la clonación: el vector y la ligadura Los plásmidos son trozos extracromosómicos circulares de ADN de doble hebra que se encuentran en algunas bacterias. Los plásmidos utilizan la energía de las células bacterianas y las vías metabólicas para replicarse. Para que un plásmido sea útil como vector, debe ser razonablemente pequeño para una fácil transferencia a las células bacterianas y ser capaz de replicarse en grandes cantidades.

Se debe seleccionar un plásmido con un sitio de restricción idéntico a los sitios de restricción en el ADN extraño. Si el plásmido y el ADN extraño se tratan con la misma endonucleasa de restricción, los "extremos pegajosos", o los extremos con voladizos de 5 'o 3', del ADN extraño se pegarán o se volverán a secar en los extremos pegajosos de los plásmidos. Por tanto, el fragmento de ADN se inserta en el vector plasmídico. Una segunda enzima, la ADN ligasa, repara las roturas de las hebras. La ADN ligasa es una enzima necesaria durante la replicación del ADN para reparar las roturas en el ADN y como parte de nuestro mecanismo de reparación del ADN.

Como se mencionó anteriormente en el subconjunto del módulo II-b, los amplicones de PCR se pueden clonar directamente sin digerir los extremos, pero a menudo es más exitoso generar "extremos pegajosos". Se debe planificar que dichos extremos se incluyan en los cebadores (consulte la sección de PCR en Secuenciación de ácidos nucleicos).

Construcción de un vector de clonación recombinante & # 8211 Centro de capacitación en biotecnología de la Universidad de Calgary


INTRODUCCIÓN

La clonación de ADN se ha realizado tradicionalmente digiriendo un plásmido fuente o fragmento de ADN y un vector receptor con enzimas de restricción, extrayendo los fragmentos digeridos de un gel y ligando los fragmentos purificados usando ADN ligasa (ver Protocolos actuales artículo Struhl, 1991). Este enfoque es adecuado para ligar uno o dos fragmentos de ADN en un vector, pero no funciona bien para ligar múltiples fragmentos en un vector en un solo paso. Afortunadamente, se encuentran disponibles nuevos métodos de clonación que permiten el ensamblaje de varios fragmentos en un vector en un solo paso, incluidos los métodos de clonación basados ​​en homología (por ejemplo, ensamblaje de Gibson) y los métodos que se basan en enzimas de restricción de tipo IIS, como la clonación Golden Gate (nombrada en referencia a la clonación de Gateway, pero también como juego de palabras con el nombre del puente). Golden Gate se realiza mediante una reacción de ligadura de restricción en un termociclador. Los parámetros para configurar y realizar una reacción de ensamblaje de Golden Gate estándar se describen en el Protocolo básico 1 y se describen en la Figura 1. La clonación de Golden Gate requiere que el vector y los insertos tengan una estructura específica con respecto a la presencia o ausencia de sitios de restricción específicos. En el Protocolo básico 2 se proporciona un método para convertir un vector de clonación regular en un vector de clonación compatible con Golden Gate. En el Protocolo básico 3 se proporciona un ejemplo para adaptar un inserto a la clonación de Golden Gate, que explica cómo diseñar cebadores para amplificación y clonación de un gen de interés en un vector Golden Gate.

La generación de unidades de transcripción definidas y el posterior ensamblaje de unidades de transcripción en construcciones multigénicas utilizando métodos de clonación tradicionales no es una tarea sencilla. Esto se debe no solo al ensamblaje de ADN en sí, sino también a la dificultad de diseñar estrategias de clonación para grandes construcciones. Una razón de esta limitación es que los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción utilizadas en cada paso de clonación todavía están presentes en las construcciones después de la ligación. Por lo tanto, se deben usar diferentes enzimas de restricción para cada paso sucesivo, lo que hace que la planificación de una estrategia de clonación sea extremadamente difícil o imposible cuando se trabaja con un gran número de genes. Se proporciona una solución a este problema estandarizando las piezas y la estrategia de ensamblaje, combinada con el uso de la clonación Golden Gate para el ensamblaje del ADN en cada paso de clonación. Esta estrategia es empleada por el sistema de clonación modular MoClo (Engler et al., 2014 Weber, Engler, Gruetzner, Werner y Marillonnet, 2011 Werner, Engler, Weber, Gruetzner y Marillonnet, 2012). El sistema MoClo se basa en el uso de partes estándar que se fabrican mediante PCR, se clonan en una estructura de vector y se secuencian. Las partes estándar contienen la secuencia de ADN de un elemento genético básico, como un promotor, una secuencia de codificación o un terminador. El Protocolo básico 4 proporciona un método para clonar partes de productos de PCR en un solo paso (Fig. 1), y un Protocolo alternativo proporciona un método para clonar partes más grandes en dos pasos sucesivos. La estructura estandarizada de las partes permite que se reutilicen en muchas construcciones diferentes sin la necesidad de amplificación por PCR. También permite la estandarización del procedimiento de montaje. Las construcciones multigénicas se ensamblan a partir de piezas básicas mediante una serie de pasos de ensamblaje en un solo recipiente. La estrategia de clonación y los diferentes pasos de clonación utilizados con el sistema MoClo se describen en el Protocolo básico 5.

1: REALIZACIÓN DE UNA REACCIÓN TÍPICA DE CLONACIÓN DE GOLDEN GATE

El principio de la clonación Golden Gate consiste en usar una enzima de restricción de tipo IIS y ligasa en una ligadura de restricción para ensamblar varios fragmentos de ADN en un orden lineal definido en un vector en un solo paso (Fig. 2A). Las enzimas de restricción de tipo IIS escinden el ADN fuera de la secuencia de su sitio de reconocimiento de ADN. Por ejemplo, el sitio de restricción de BsaI (GGTCTC N ↓ N1norte2norte3norte4) consta de una secuencia de sitio de reconocimiento de ADN (GGTCTC) y un sitio de escisión de ADN (↓) que conduce a una proyección de ADN monocatenario de 4 nt (N1norte2norte3norte4) después de la digestión. Para ser adecuados para la clonación de Golden Gate, todos los fragmentos de ADN deben estar flanqueados por sitios de restricción para una enzima de restricción de tipo IIS, con una orientación hacia adentro tal que las secuencias del sitio de reconocimiento de ADN se escinden de los fragmentos de ADN durante la etapa de digestión (Fig. 2B). . El vector de destino también debe contener dos sitios de restricción para el mismo tipo de enzima IIS, pero con una orientación hacia afuera tal que los sitios de reconocimiento de ADN también se escinden del vector mediante la etapa de digestión. Finalmente, todos los salientes monocatenarios de 4 nt (también llamados sitios de fusión) en los extremos de los fragmentos de ADN y el vector deben ser únicos y complementarios para permitir la hibridación al final del siguiente fragmento o vector. Debido a que la molécula de ADN recombinante circular esperada no contiene sitios de restricción para la enzima utilizada, no se puede volver a digerir, lo que permite realizar la restricción y la ligadura en la misma mezcla de reacción. Esto permite que los fragmentos de ADN que se ligaron de nuevo en su esqueleto plásmido inicial se sometan a más ciclos de digestión y ligación hasta que finalmente se incorporen al producto recombinante deseado (Fig. 2C). Esto es útil para la transferencia de un fragmento de un vector al siguiente, pero es cada vez más importante cuando es necesario clonar varios fragmentos en un solo paso. Esto se debe a que el número de posibles eventos de ligadura aumenta exponencialmente con el número de plásmidos en la mezcla de ligadura, mientras que la posibilidad de obtener un producto ligado correctamente en un solo paso se vuelve cada vez más improbable (Fig. 2D). La ligadura de restricción conduce a una alta eficiencia de clonación y permite ligar hasta 24 fragmentos en una única reacción de clonación (Potapov et al., 2018).

Los fragmentos de ADN utilizados pueden ser fragmentos lineales obtenidos por PCR, pero también pueden ser secuencias clonadas en un plásmido circular. Este protocolo describe cómo realizar una reacción de clonación Golden Gate cuando tanto las partes del ADN como el vector de destino están disponibles como plásmidos.

Materiales

  • ADN plasmídico purificado:
    • Vector de destino Golden Gate (consulte el Protocolo básico 2 o disponible en Addgene u otros investigadores)
    • Insertos (ADN plasmídico)
    • 10 U / µl BsaI (New England Biolabs, cat. No. R0535L)
    • 10 U / µl BpiI (Thermo Fisher Scientific, n. ° de catálogo ER1012)
    • 10 U / µl BsmBI (New England Biolabs, cat. No. R0580s)
    • Espectrofotómetro (por ejemplo, Nanodrop 1000, Peqlab)
    • Placas de PCR de 0,2 ml (Thermo Fisher Scientific, nº de catálogo AB0600)
    • Sellos adhesivos para placas de PCR (Thermo Fisher Scientific, n. ° de catálogo AB0588)
    • Ciclador térmico (por ejemplo, C1000 Touch, BioRad)
    • Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
    • Incubadora de bloques a 37 ° y 42 ° C (p. Ej., Eppendorf ThermoMixer)
    • Incubadora de 37 ° C y agitadora
    • Matraces o tubos de cultivo
    • Software de análisis de ADN (por ejemplo, Vector NTI, Thermo Fisher Scientific)

    NOTA: Enzimas de tipo IIS que generan un saliente de 3 nt tras la escisión, como LguI (Thermo Fisher Scientific, nº de cat. ER1931), también se puede utilizar.

    Realizar ligadura de restricción

    1. Mida la concentración de ADN de los plásmidos del inserto y del vector utilizando un espectrofotómetro.

    2. Agregue cantidades iguales de cada inserto y vector a la mezcla de reacción. Utilice 20 fmol de cada plásmido en un volumen de reacción total de 15 o 25 µl de la siguiente manera:

    • X1 µl de ADN de vector
    • X2 µl inserto 1
    • X3 µl inserto 2
    • X4 µl inserto 3
    • 1,0 µl de ADN ligasa de T4
    • 0,5 µl de enzima tipo IIS
    • 1,5 µl de tampón de ligación 10 ×
    • H2O a 15 µl
    • X1 µl de vector
    • X2 µl inserto 1
    • X3 µl inserto 2
    • … …
    • Xnorte inserto de µl norte
    • 1,5 µl de ADN ligasa de T4
    • 1,0 µl de enzima tipo IIS
    • 2,5 µl de tampón de ligación 10 ×
    • H2O a 25 µl

    El volumen de cada plásmido de ADN se calcula mediante la fórmula: 20 (fmol) x tamaño (pb) / concentración (ng / µl) / 1520. Si el volumen calculado es demasiado bajo para un pipeteo preciso (& lt0,3 µl), el plásmido debe diluirse 10 veces en agua y debe agregarse un volumen 10 veces mayor a partir de esta dilución.

    3. Incube la mezcla en un termociclador con las siguientes condiciones:

    • 50 ciclos: 37 ° C durante 2 min, 16 ° C durante 5 min
    • 50 ° C durante 5 min
    • 80 ° C durante 10 min
    • 16 ° C

    Cuando se usa BsaI, el paso final de digestión de 5 minutos se realiza a 50 ° C, ya que BsaI puede digerir tanto a 37 ° C como a 50 ° C. Por el contrario, cuando se usa BpiI, el paso de digestión final todavía se realiza a 37 ° C, ya que esta es la temperatura de digestión óptima para esta enzima.

    Transformar el producto en E. coli

    4. Agregue toda la mezcla de ligadura (15 o 25 µl) a 50 µl competente E. coli células e incubar en hielo durante 30 min.

    5. Choque térmico a 42 ° C durante 90 s. Deje que las células se recuperen en hielo durante 2 min.

    6. Añada 500 µl de medio LB o SOC y agite las células durante 45 min a 37 ° C en un ThermoMixer.

    7. Coloque en placas LB que contengan el antibiótico apropiado y X-gal. Incubar durante la noche a 37 ° C.

    Para reacciones de clonación con uno a tres insertos, placa de 10 a 20 µl. Plaque volúmenes más grandes para un mayor número de insertos, porque el número de colonias obtenidas será menor. Por ejemplo, placa de 50 µl o más para las construcciones que constan de más de tres fragmentos.

    Elija colonias y evalúe clones

    8. Recoger colonias individuales e inocular 5 ml de medio LB. Incubar durante la noche a 37 ° C en una incubadora agitadora.

    Los vectores de clonación Golden Gate generalmente contienen un fragmento LacZ para el cribado azul-blanco (a veces se usa un operón de biosíntesis de carotenoides como marcador para el cribado rojo-blanco). Se recogen las colonias blancas. Para las reacciones de clonación que no requirieron PCR para la preparación de los fragmentos, generalmente es suficiente recoger dos colonias. Para las reacciones de clonación hechas a partir de fragmentos amplificados por PCR, pueden ser necesarios más de dos clones para encontrar uno que no contenga mutaciones inducidas por PCR.

    9. Preparar el ADN con un kit miniprep, eluyendo en un volumen de 50 μl.

    10. Digerir 1 µl de eluato en una reacción de 10 µl usando una enzima adecuada (a menudo BsaYo o BpiCuando utilice el sistema MoClo, consulte el Protocolo básico 4) para confirmar el montaje correcto mediante huellas dactilares de ADN.

    11. Si se utilizó amplificación por PCR para preparar los fragmentos de ADN, secuencie el plásmido.

    2: ALOJAMIENTO DE UN VECTOR PARA LA CLONACIÓN DE GOLDEN GATE

    La clonación de Golden Gate requiere que los fragmentos de ADN y el vector receptor se ajusten a requisitos específicos, como la presencia de sitios de restricción de enzimas de tipo IIS en los extremos de los fragmentos y el vector, y la falta de los mismos sitios de restricción en las secuencias internas de los fragmentos y vector. Many vectors suitable for Golden Gate cloning are available from several research groups, and the number of vectors available will likely grow in the future. Nevertheless, converting a standard cloning vector into a Golden Gate cloning vector is sometimes required for a user's specific needs. There are many strategies to do that, including using Gibson DNA assembly or Golden Gate cloning.

    An example is provided here for converting the pET-28b (+) vector for use with Golden Gate cloning. In this example, a LacZ alpha fragment flanked by two BsaI sites is inserted in the vector, replacing the multicloning site (Fig. 3A). los LacZ fragment will be used later for blue-white screening. Here, the two fusion sites flanking the LacZ fragment are AATG and GCTT, corresponding to the MoClo standard for cloning of coding sequences (see Basic Protocol 4). However, they can be any other sequences that a user might want, as long as they are different from each other and non-palindromic. Indeed, overhangs consisting of palindromic sequences can anneal to the same overhang of an additional copy of the same fragment in the other orientation, leading to stable ligation products that are nevertheless incorrect and resulting in a significant reduction of the cloning efficiency. In the example provided here, the ATG that is part of the first fusion site corresponds to a methionine start codon, which is cloned in-frame with a His tag present in the upstream vector sequences. The vector and the LacZ fragment are obtained by PCR, and assembly is performed using a second type IIS enzyme, BpiI. Since there are four BpiI sites in the vector, they are removed using primers designed to insert single-nucleotide mutations in the DNA recognition sequences.

    Additional Materials (also see Basic Protocol 1 )

    • Gene-specific primers from commercial vendor (e.g., Eurofins Genomics)
    • Plasmid template for amplification of LacZ cassette (e.g., pUC19, New England Biolabs, cat. no. N3041S)
    • Vector plasmid DNA (e.g., pET-28b (+), Novagen, Merck Millipore, cat. no. 69418)
    • High-fidelity PCR amplification kit (e.g., KOD Hot Start DNA Polymerase, Millipore Sigma, VWR, cat. no. 71086-3)
    • PCR fragment purification kit (e.g., NucleoSpin Gel and PCR Clean-up, Macherey Nagel, cat. no. 740609.250)

    1. Design primers to amplify LacZ fragment.

    Primer locations and sequences for this example are shown in Figure 3. The first two primers, Pr1 and Pr2, are designed to amplify the LacZ fragment from pUC19. pUC19 is selected as a template because it has a different antibiotic resistance gene (Amp R ) from the recipient vector (Kan R ). This reduces the probability of obtaining incorrect constructs by carryover of the undigested template vector when screening clones after transformation. The amplified fragment contains a functional unit for the LacZ marker for blue-white screening. Primers Pr1 and Pr2 have BpiI restriction sites (gaagac in Fig. 3B) with 4-nt fusion sites corresponding to sequences AATG and GCTT, respectively. The fusion sites in the two primers are followed by BsaI restriction sites in opposite orientation (reverse complement of ggtctc = gagacc in Fig. 3B). los BsaI sites will become part of the resulting vector and will be used for Golden Gate cloning once the vector is made.

    The pET-28b vector contains four BpiI restriction sites in internal sequences, which need to be removed by making single-nucleotide substitutions (a process called domestication). Eight primers are needed for this purpose (Pr3 and Pr6-14). Silent mutations are made for restriction sites located in coding sequences (in this case, the Lac I repressor, which has two BpiI sites). A final pair of primers (Pr4 and Pr5) is made to avoid having to amplify fragments larger than 2 kb this pair of primers is optional. Primers Pr3-14 all have a BpiI site with a fusion site selected to be compatible with the fusion site of the fragment to which it will be ligated.

    When ordering, it is sufficient to get the lowest amount possible (i.e., 0.01 µmol) with minimal purification (salt free).

    1. Set up one 50-μl PCR reaction with primer pair Pr1-2 using pUC19 as a template.
    2. Set up six 50-μl reactions with primers pairs Pr3-4 to Pr13-14 using pET-28b (+) as a template.

    3. Run 5 μl from each reaction on a gel to see if the PCR was successful.

    4. Purify the remaining 45 μl from each reaction using a column-based kit (i.e., Macherey Nagel NucleoSpin DNA Clean-up kit).

    This will separate the PCR product from any remaining DNA polymerase and dNTPs, as well as primer dimers that are produced at various levels in most PCR reactions.

    5. Quantify purified PCR products using a spectrometer such as a Nanodrop.

    6. Perform the Golden Gate cloning reaction (see Basic Protocol 1) using the enzyme BpiI. Transform the product into E. coli (see Basic Protocol 1) and select blue colonies.

    In this particular example, transformants should be plated on LB containing kanamycin and X-gal. Correct colonies should not be white, but blue.

    7. Prepare DNA using a miniprep kit.

    8. Digest 1 µl with BsaI in a 10-µl reaction.

    Two fragments of 5.3 kb and 506 bp are expected for this particular construct.

    Sequencing the entire plasmid with primers designed at various positions within the plasmid is desirable because PCR was used for amplification of the entire vector. However, since some regions required for replication or expression of the LacZ marker should be functional if the plasmid replicates and the colonies are blue, the entire plasmid may not need to be sequenced. At a minimum, all elements that will later be required for expression of the gene should be sequenced, including the region extending from the T7 promoter to the terminator. Sequencing of the region containing the two introduced BsaI sites is essential to make sure that the sequence of the two fusion sites is as expected.

    The cloning vector can now be used for Golden Gate cloning.

    3: ACCOMMODATING AN INSERT TO GOLDEN GATE CLONING

    This protocol explains how to design primers to accommodate a sequence of interest to Golden Gate cloning and then clone the amplified fragments in a Golden Gate destination vector. An example is given for cloning the coding sequence of an Arabidopsis thaliana isoflavone reductase amplified from an Arabidopsis cDNA template (Genbank accession NM_106183).

    Additional Materials (also see Basic Protocols 1 and 2 )

    • cDNA or DNA template for PCR (here, cDNA from Arabidopsis)
    • Plasmid DNA of Golden Gate destination vector

    1. Design silent mutations in the open reading frame of the sequence of interest en silico using cloning software (e.g., Vector NTI).

    In this example, the coding sequence contains one BsaI site (Fig. 4A). It is removed in silico by a single-nucleotide substitution, resulting in a silent mutation (shown in red in Fig. 4B).

    2. Add to the coding sequence two flanking fusion sites for compatibility with the vector.

    In this case, add one A before the start codon to give AATG, and add GCTT after the stop codon.

    The added sequence is shown in red in Figure 4B, and fusion sites are shown in blue.

    3. Select a fusion site at the site of the mutation.

    Two PCR fragments will be amplified, one on each side of the mutation (I and FR in Fig. 4A), and then assembled via a fusion site that overlaps or is near the mutated nucleotide. The fusion site needs to be different from the other fusion sites (AATG and GCTT) and should not be palindromic. It should contain at least one G or C (more, if possible), as sites containing only As or Ts may work less well for DNA assembly (Potapov et al., 2018 ). When many fusion sites are needed, the Ligase Fidelity Viewer program (New England Biolabs, http://ggtools.neb.com/viewset/run.cgi) can be used to check the suitability of all sites. In the present example, a single sequence, GGAC, is selected (shown in yellow in Fig. 4B).

    4. Design primers starting at all fusion sites. Select two primers in opposite orientation for each mutated site (in this case, only one site). Make the primers long enough to give an appropriate melting temperature for PCR amplification.

    5. Add the sequence of the BsaI recognition site (tt ggtctc a) to the beginning of all primers.

    The final list of primers is shown in Figure 4C.

    6. Amplify the two PCR fragments using the appropriate primers pairs (Isof1-2 and Isof3-4 Fig. 4A) from the Arabidopsis cDNA template in a 50-µl reaction. Run 5 µl on a gel to check that the correct fragment was amplified. Purify the remaining 45 µl using a column-based kit according to manufacturer's instructions.

    7. Set up and perform the assembly reaction as described (see Basic Protocol 1).

    Because this example describes a simple cloning with only two fragments cloned into the vector, a simple incubation at 37°C for 2 hr, 50°C for 5 min, and 80°C for 10 min should be sufficient.

    8. Transform the ligation mix into competent E. coli, plate on LB containing kanamycin and X-gal, and screen the resulting colonies.

    Minipreps are digested with two enzymes with restriction sites flanking the insert, or with enzymes that have sites in the vector in insert. Because PCR was used for cloning, the cloned insert must be sequenced using primers for sequences in the vector flanking the insert.

    4: GENERATING SMALL STANDARDIZED PARTS COMPATIBLE WITH HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) USING LEVEL 0 VECTORS

    Assembly of DNA fragments from plasmids using Golden Gate cloning can be done quickly and efficiently. In contrast, assembly from PCR products requires more work, because PCR products often contain primer dimers formed by mis-annealing of primers during PCR amplification. Because primer dimers are flanked by the same type IIS restriction sites as the PCR products, they can be cloned, resulting in incorrect constructs and lowering the cloning efficiency (Fig. 5). Even if no primer dimers are made, the cloned constructs need to be sequenced to make sure that they do not contain PCR-induced mutations. Therefore, it makes a lot of sense to have a system where cloned and sequenced DNA parts can be reused in different constructs. For example, parts that contain regulatory sequences such as promoters and terminators can be reused in many different constructs.

    The modular cloning system MoClo was designed to facilitate the reuse of cloned parts in different constructs (Fig. 6). It is based on the use of basic parts that are put together using Golden Gate cloning. The basic parts are cloned as level 0 modules and assembled in level 1 cloning vectors to make transcription units. The level 1 constructs are then assembled to make level M and P multigene constructs. Basic parts contain the coding sequence of a basic genetic element flanked by two BsaI restriction sites in opposite orientation (Fig. 7). Cloning of the basic parts requires amplification from DNA or cDNA as a template. The amplified product is cloned in a recipient vector using Golden Gate cloning. The cloning steps consist of defining the part type, design primers containing BsaI restriction sites at the ends of the fragments, removing sites from internal sequences, and cloning the amplified fragments in a vector.

    Additional Materials (also see Basic Protocols 1 and 2 )

    • cDNA or DNA template for PCR (here, cDNA from Arabidopsis)
    • Universal level 0 cloning vector pAGM9121 (Addgene, plasmid #51833)

    1. Define the type of level 0 module (part).

    Parts can consist of promoters, coding sequences with or without a stop codon, C- or N-terminal fusion tags, and terminators (Fig. 7A). Each part is flanked by two BsaI sites in opposite orientation (Fig. 7B). The 4-bp sequences of the BsaI cleavage sites (fusion sites) are specific for each type of module and define which parts can be fused together. For example, a promoter module with TACT as the 3′ fusion site (Pro in Fig. 7A) can be fused only to an untranslated leader sequence with the same fusion site at the 5′ end (5UTR2 in Fig. 7A). For each part type, a specific cloning vector is available with compatible fusion sites. Alternatively, all part types can be cloned into the universal level 0 cloning vector pAGM9121 (Figs. 7D and 8) as described in this protocol. Level 0 modules may also be composites of several basic parts. For example, constructs containing a complete transcription unit can be cloned directly as level 0 modules between fusion sites GGAG and CGCT. Other types of genetic elements, such as a phage recombination site or a matrix attachment region, can also be cloned as level 0 modules between fusion sites GGAG and CGCT.

    2. Introduce silent mutations in the gene sequence en silico.

    Basic parts should not contain restriction sites for the type IIS enzymes that are used with the MoClo system (BsaI, BpiI, and optionally BsmBI). Restriction sites are removed by introducing single-nucleotide mutations, which is first performed en silico. Removal of internal sites in coding sequences can always be done with a silent mutation. Removal of sequences in promoter regions is more difficult, because sequences important for promoter function are not always known. Therefore, after domesticating promoter sequences, it will be necessary to validate experimentally in the host organism that the promoter still works as intended. Domestication of the Arabidopsis UGT78D2 gene (GenBank accession NM_121711) is presented here as an example. This gene contains one BsaI site, two BpiI sites, and one BsmBI site (Fig. 9A), which are removed by introducing four silent mutations (red in Fig. 10).

    3. Add the two standard fusion sites flanking the part.

    Because this module will be a coding sequence with a stop codon (CDS1), one A is added before the start codon to give AATG, and the sequence GCTT added after the stop codon (both fusion sites are highlighted in blue in Fig. 10).

    4. Add sequences for compatibility with the universal cloning vector.

    In this example, the part will be cloned into the universal level 0 cloning vector pAGM9121. Therefore, CTCA and CGAG are added at the beginning and end of the fragment to provide the necessary compatibility (highlighted in green in Fig. 10). These sequences will become part the BsaI restriction sites that will flank the final level 0 module.

    5. Select the nonstandard fusion sites that will be used for PCR fragment assembly.

    These are the 4-nt sequences that will be used to assemble the PCR products during cloning. They need to be different from each other and from the fusion sites that will be used in the vector (CTCA and CTCG for the universal cloning vector, or AATG and GCTT for the CDS1-specific cloning vector). They also need to be different from the reverse complement of any of the selected fusion sites to avoid inappropriate fragment ligation. The selected sequences are highlighted in yellow in Figure 10.

    6. Design primers starting at all fusion sites, standard and nonstandard.

    For fusion sites at sites mutated to remove restriction sites, primers are designed in both orientations. The primers should be long enough to have an appropriate melting temperature. This can be calculated using any of the many programs available online or can be done manually.

    7. Add the type IIS enzyme recognition sequence.

    Porque BpiI is used for assembly, the sequence tt gaagac aa is added to all primers. Primer sequences and locations are shown in Figure 9.

    8. PCR amplify the fragments.

    Amplify five fragments from Arabidopsis cDNA in separate 50-µl reactions using primer pairs Gtpr1-2 to Gtpr9-10 and a proofreading polymerase. Run 5 µl on a gel to check that each fragment was amplified as expected.

    9. Column purify the fragments.

    The amplified fragments need to be purified to remove remaining polymerase, primers, and dNTPs, and most of the primer dimers that are often present in the reaction. If a single fragment was amplified, using a DNA purification kit (e.g., Macherey Nagel DNA purification kit) is sufficient. Gel extraction of the PCR fragments of the correct size may be necessary if several DNA fragments were amplified.

    10. Set up cloning in the universal level 0 vector pAGM9121 as described (see Basic Protocol 1).

    11. Transform in E. coli and pick two white colonies. More colonies can be picked later if sequencing of these clones does not show the correct sequence.

    12. Screen colonies by digesting miniprep DNA with BsaI.

    13. Sequence the clones using the vector primers lev0seqf and lev0seqr (Fig. 9B).

    : GENERATING LARGE STANDARDIZED PARTS COMPATIBLE WITH HIERARCHICAL MODULAR CLONING (MoClo) USING LEVEL –1 VECTORS

    While small parts (<1.2 kb) can be sequenced using standard primers located in flanking vector sequences, large parts cannot be sequenced entirely from vector primers. Additional sequencing primers have to be designed within the part to sequence its middle section. To facilitate sequencing without the need for custom sequencing primers for each part, an alternative strategy consists of cloning part fragments (sub-parts) that are no more than 1-1.2 kb long, sequencing the sub-parts using vector primers, and then assembling the sequenced sub-parts using a second assembly reaction to make the final level 0 module (Fig. 11). Sub-parts are cloned in a universal level –1 cloning vector (pAGM1311, Fig. 12).

    Additional Materials (also see Basic Protocol 4 )

    1. Define the part type, introduce silent mutations, add the standard fusion sites, and add sequences for compatibility with the universal cloning vector as described (see Basic Protocol 4, steps 1-4).

    2. Select the nonstandard fusion sites that will be used for PCR fragment assembly.

    These are the 4-nt sequences that will be used to assemble the PCR products during cloning. They need to be different from each other and from the fusion sites that will be used in the vector (in this case, ACAT and TTGT for the universal level –1 vector see step 5 below). They also need to be different from the reverse complement of any of the selected fusion sites to avoid inappropriate fragment ligation. The selected sequences are the same as those in Basic Protocol 4 (highlighted in yellow in Fig. 10).

    3. Design primers starting at all fusion sites, standard and nonstandard, as described (see Basic Protocol 4, step 6).

    4. Add the type IIS enzyme recognition sequence.

    For cloning in level –1 vectors, BsaI is used for assembly, and thus the sequence tt ggtctc a is added to the 5′ end of all primers.

    5. Add sequences for compatibility with the universal level –1 cloning vector.

    The two fusion sites of the universal cloning vector are ACAT and TTGT, and they contain part of a BpiI restriction site that will flank the sub-part after cloning (Fig. 12). Therefore, the sequences ACAT and ACAA (reverse complement of TTGT) must be added to the two primers that delimit the group of PCR fragments that will be cloned together. These sequences are added immediately 3′ of the BsaI site and before the universal level 0 vector fusion site (CTCA or CTCG). In this example, the first three PCR products will be cloned together in the universal level –1 vector pAGM1311, and the fourth and fifth products will also be cloned together in pAGM1311. Primer sequences and locations for the first level –1 construct (Gtpr1′ to 6′) and second level –1 construct (Gtpr7′ to 10′) are shown in Figure 11.

    6. PCR amplify the fragments (see Basic Protocol 4, step 8) using the appropriate primer pairs (Gtpr1′-2′ to Gtpr9′-10′).

    7. Column purify the fragments (Basic Protocol 4, step 9).

    8. Set up two Golden Gate cloning reactions as described (see Basic Protocol 1) using the universal level –1 vector pAGM1311. Clone the first three products together in one reaction and the fourth and fifth products in the second reaction (level –1 modules in Fig. 11A).

    9. Transform in E. coli and pick two white colonies. More colonies can be picked later if sequencing of these clones does not provide the correct sequence.

    10. Screen colonies by digesting miniprep DNA with BpiI.

    11. Sequence clones using the vector primers Levm1seqF and Levm1seqR (Fig. 11B).

    12. Assemble level 0 modules from the level –1 sub-parts. Set up a Golden Gate cloning reaction to assemble the two selected level –1 clones in the universal level 0 cloning vector pAGM9121 (see Basic Protocol 1).

    13. Transform in E. coli células.

    14. Screen colonies by digesting miniprep DNA with BsaI.

    Since PCR was not used to make these constructs, sequencing is not required.

    5: ASSEMBLING TRANSCRIPTION UNITS AND MULTIGENE CONSTRUCTS USING LEVEL 1, M, AND P MoClo VECTORS

    Assembly of multigene constructs using the MoClo system is done hierarchically (Fig. 6). The first step is assembly of level 0 parts in level 1 destination vectors to make constructs that usually contain a transcription unit. The second is assembly of multigene constructs which is done in alternating stages using level M and P vectors. Up to six transcription units can be assembled in a level M cloning vector to make a level M multigene construct. Then, up to six level M constructs can be further assembled into a level P vector to make a level P construct containing up to 36 transcription units. Level P constructs can themselves be further assembled into level M vectors to make even larger constructs. This process can be repeated indefinitely, until constructs become too large to be cloned as plasmids in E. coli. Level M and P assembly use Bsayo y BpiI in an alternating fashion.

    Additional Materials (also see Basic Protocol 1 )

    • Level 0 parts
    • Level 1, M, and P destination vectors from MoClo Toolkit (Addgene, kit #1000000044)

    Assemble transcription units in level 1 vectors

    1. Select standard level 0 parts.

    The first step for planning the assembly of a multigene construct is to identify all basic parts required for each transcription unit. For example, to make a construct containing four transcription units, each composed of three parts—including a promoter with 5′-UTR (pro + 5U), a coding sequence (CDS1), and a 3′-UTR with terminator (3U + Ter)—a total of twelve parts is required.

    A list of all part types is shown in Figure 7. Parts that are not already available are cloned as described (see Basic Protocol 4). Some are already available for plants (MoClo Plant Parts Kit, Addgene, kit #1000000047), Clamidia (https://www.chlamycollection.org/product/moclo-toolkit/ Crozet et al., 2018 ), and cyanobacteria (http://www.addgene.org/browse/article/28196941/ Vasudevan et al., 2019 ).

    2. Select level 1 destination vectors.

    Fourteen level 1 vectors are available: seven for cloning a transcription unit in the forward orientation in seven different positions in the final construct, and seven for the reverse orientation (Fig. 13A). All contain two BsaI sites and the fusion sites GGAG and CGCT to provide compatibility with level 0 modules. They also contain two BpiI sites for excision of the assembled transcription unit in the next step of assembly. los BpiI fusion sites are designed to provide compatibility from one vector to the next. In an example where four transcription units are cloned in the forward orientation, vectors for positions 1 to 4 for the forward orientation (pL1F-1, pL1F-2, pL1F-3, and pL1F-4) are selected.

    los BpiI fusion site at the end of vector 7 (TGCC) is the same as the site at the beginning of vector 1, allowing one to clone more than seven genes in a multigene construct by reusing the same seven vectors indefinitely. Thus, an eighth transcription unit is cloned using vector 1, a ninth transcription unit is cloned using vector 2, and so on (Fig. 13C).

    In the example in Figure 13C, two transcription units are cloned in reverse orientation, and therefore vectors for cloning in the reverse orientation are selected. The choice of whether a transcription unit should be cloned in one orientation or the other is decided solely by the user needs.

    3. Assemble level 1 constructs.

    Constructs are assembled using four Golden Gate cloning reactions, each containing the three selected basic parts and level 1 vector. An example for cloning the first transcription unit is shown in Figure 14. The cloning reaction is performed as described (see Basic Protocol 1). Because level 1 vectors contain a LacZ fragment for blue-white screening, two white colonies are picked. As assembled transcription units are flanked by BpiI sites, miniprep DNA is checked by BpiI digestion.


    Designing primers for PCR based cloning:

    Leader Sequence: Extra base pairs on the 5' end of the primer assist with restriction enzyme digestion (usually 3-6bp)

    Restriction Site: Your chosen restriction site for cloning (usually 6-8bp)

    Do not cut within your insert

    Are in the desired location in your recipient plasmid (usually in the Multiple Cloning Site (MCS)), but do not cut elsewhere on the plasmid

    In our example, we will use EcoRI and NotI to ligate our cDNA into the recipient plasmid. Remember to insert your DNA in the correct orientation in the recipient plasmid by viewing the MCS and fusing the upstream restriction site to the forward primer and the downstream restriction site to the reverse primer.

    Next, we need to examine the DNA sequence that we want to amplify and design primers that will bind to and replicate it. The following image shows the ends of the ORF and how these are used for primer design:

    Because we are cloning an ORF, we want to clone from the start codon (ATG) to the stop codon (TGA, in this example). Assuming you are amplifying from plasmid DNA (rather than from genomic DNA or a cDNA library), roughly 18-21bp is usually sufficient to give specificity and to also be compatible with a standard PCR reaction. Therefore, our Forward Primer will use the sequence 5'-ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3' for the region that binds the ORF and we will add the EcoRI restriction site (GAATTC) to the 5’ end of this primer, making our Forward Primer 5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'.

    Many restriction enzymes do not cut DNA efficiently at the end of a linear piece (see NEB for more information). Thus, we recommend that you add 3-6 bases upstream of your restriction site to improve cutting efficiency. You can generally add any 6 bases, but you should ensure that the bases do not result in the formation of a hairpin structure within your primer. In our case, we will add TAAGCA, resulting in a final Forward Primer sequence of 5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'.

    For the Reverse Primer, the design is similar, but we need to use the reverse complement to get PCR amplification. We can start similarly, taking the final 18bases of the ORF, including the stop codon (5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGA-3'), then adding NotI (GCGGCCGC) and then TAAGCA to improve restriction enzyme digestion. This gives us a sequence of 5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3' (30bp with 18bp of homology to the ORF). We now need to generate the reverse-complement of this sequence so that we can successfully amplify the ORF. You can generate the reverse-complement using existing software (a quick internet search will lead you to here and many others). If we put the sequence we chose for our reverse primer (5’-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3’) into this calculator we get a final Reverse Primer sequence of 5’-TGCTTAGCGGCCGCTCAGTACTTCGAGATATGCCA-3’.


    Introducing Recombinant Molecules into Eukaryotic Hosts

    The use of bacterial hosts for genetic engineering laid the foundation for recombinant DNA technology however, researchers have also had great interest in genetically engineering eukaryotic cells, particularly those of plants and animals. The introduction of recombinant DNA molecules into eukaryotic hosts is called transfeccion. Genetically engineered plants, called transgenic plants, are of significant interest for agricultural and pharmaceutical purposes. The first transgenic plant sold commercially was the Flavr Savr delayed-ripening tomato, which came to market in 1994. Genetically engineered livestock have also been successfully produced, resulting, for example, in pigs with increased nutritional value [1] and goats that secrete pharmaceutical products in their milk. [2]

    Electroporation

    Compared to bacterial cells, eukaryotic cells tend to be less amenable as hosts for recombinant DNA molecules. Because eukaryotes are typically neither competent to take up foreign DNA nor able to maintain plasmids, transfection of eukaryotic hosts is far more challenging and requires more intrusive techniques for success. One method used for transfecting cells in cell culture is called electroporación. A brief electric pulse induces the formation of transient pores in the phospholipid bilayers of cells through which the gene can be introduced. At the same time, the electric pulse generates a short-lived positive charge on one side of the cell’s interior and a negative charge on the opposite side the charge difference draws negatively charged DNA molecules into the cell (Figure 8).

    Figure 8. Electroporation is one laboratory technique used to introduce DNA into eukaryotic cells.

    Microinjection

    Figure 9. Microinjection is another technique for introducing DNA into eukaryotic cells. A microinjection needle containing recombinant DNA is able to penetrate both the cell membrane and nuclear envelope.

    An alternative method of transfection is called microinjection. Because eukaryotic cells are typically larger than those of prokaryotes, DNA fragments can sometimes be directly injected into the cytoplasm using a glass micropipette, as shown in Figure 9.

    Gene Guns

    Transfecting plant cells can be even more difficult than animal cells because of their thick cell walls. One approach involves treating plant cells with enzymes to remove their cell walls, producing protoplasts. Entonces un gene gun is used to shoot gold or tungsten particles coated with recombinant DNA molecules into the plant protoplasts at high speeds. Recipient protoplast cells can then recover and be used to generate new transgenic plants (Figure 10).

    Figure 10. Heavy-metal particles coated with recombinant DNA are shot into plant protoplasts using a gene gun. The resulting transformed cells are allowed to recover and can be used to generate recombinant plants. (a) A schematic of a gene gun. (b) A photograph of a gene gun. (credit a, b: modification of work by JA O’Brien, SC Lummis)

    Shuttle Vectors

    Another method of transfecting plants involves vectores de lanzadera, plasmids that can move between bacterial and eukaryotic cells. los tumor-inducing (TI) plasmids originating from the bacterium Agrobacterium tumefaciens are commonly used as shuttle vectors for incorporating genes into plants (Figure 11). In nature, the TI plasmids of A. tumefaciens cause plants to develop tumors when they are transferred from bacterial cells to plant cells. Researchers have been able to manipulate these naturally occurring plasmids to remove their tumor-causing genes and insert desirable DNA fragments. The resulting recombinant TI plasmids can be transferred into the plant genome through the natural transfer of TI plasmids from the bacterium to the plant host. Once inside the plant host cell, the gene of interest recombines into the plant cell’s genome.

    Figure 11. Click for a larger image. La tI plasmid of Agrobacterium tumefaciens is a useful shuttle vector for the uptake of genes of interest into plant cells. The gene of interest is cloned into the TI plasmid, which is then introduced into plant cells. The gene of interest then recombines into the plant cell’s genome, allowing for the production of transgenic plants.

    Viral Vectors

    Viral vectors can also be used to transfect eukaryotic cells. In fact, this method is often used in terapia de genes (see Gene Therapy) to introduce healthy genes into human patients suffering from diseases that result from genetic mutations. Viral genes can be deleted and replaced with the gene to be delivered to the patient [3] the virus then infects the host cell and delivers the foreign DNA into the genome of the targeted cell. Adenoviruses are often used for this purpose because they can be grown to high titer and can infect both nondividing and dividing host cells. However, use of viral vectors for gene therapy can pose some risks for patients, as discussed in Gene Therapy.

    Piénsalo

    • What are the methods used to introduce recombinant DNA vectors into animal cells?
    • Compare and contrast shuttle vectors and viral vectors.

    Conceptos clave y resumen

    • Biotechology is the science of utilizing living systems to benefit humankind. In recent years, the ability to directly alter an organism’s genome through genéticoIngenieria has been made possible due to advances in recombinant DNA technology, which allows researchers to create recombinant DNA molecules with new combinations of genetic material.
    • Clonación molecular involves methods used to construct recombinant DNA and facilitate their replication in host organisms. These methods include the use of enzimas de restricción (to cut both foreign DNA and plasmid vectors), ligadura (to paste fragments of DNA together), and the introduction of recombinant DNA into a host organism (often bacteria).
    • Blue-white screening allows selection of bacterial transformants that contain recombinant plasmids using the phenotype of a gen reportero that is disabled by insertion of the DNA fragment.
    • Genomic libraries can be made by cloning genomic fragments from one organism into plasmid vectors or into bacteriophage.
    • cDNA libraries can be generated to represent the mRNA molecules expressed in a cell at a given point.
    • Transfection of eukaryotic hosts can be achieved through various methods using electroporación, gene guns, microinjection, vectores de lanzadera, y viral vectors.

    Opción multiple

    Which of the following is required for repairing the phosphodiester backbone of DNA during molecular cloning?

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer d. DNA ligase is required for repairing the phosphodiester backbone of DNA during molecular cloning.[/hidden-answer]

    All of the following are processes used to introduce DNA molecules into bacterial cells excepto:

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. Transcription is no used to introduce DNA molecules into bacterial cells.[/hidden-answer]

    The enzyme that uses RNA as a template to produce a DNA copy is called:

    1. a restriction enzyme
    2. ADN ligasa
    3. la transcriptasa inversa
    4. ADN polimerasa

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. The enzyme that uses RNA as a template to produce a DNA copy is called reverse transcriptase.[/hidden-answer]

    In blue-white screening, what do blue colonies represent?

    1. cells that have not taken up the plasmid vector
    2. cells with recombinant plasmids containing a new insert
    3. cells containing empty plasmid vectors
    4. cells with a non-functional lacZ gene

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer c. Blue colonies represent cells containing empty plasmid vectors.[/hidden-answer]

    La tI plasmid is used for introducing genes into:

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]Answer b. La tI plasmid is used for introducing genes into plant cells.[/hidden-answer]

    Verdadero Falso

    Recombination is a process not usually observed in nature.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]False[/hidden-answer]

    It is generally easier to introduce recombinant DNA into prokaryotic cells than into eukaryotic cells.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]True[/hidden-answer]

    Complete el espacio en blanco

    The process of introducing DNA molecules into eukaryotic cells is called ________.

    [reveal-answer q=�″]Show Answer[/reveal-answer]
    [hidden-answer a=�″]The process of introducing DNA molecules into eukaryotic cells is called transfeccion.[/hidden-answer]

    Piénsalo

    1. Name three elements incorporated into a plasmid vector for efficient cloning.
    2. When would a scientist want to generate a cDNA library instead of a genomic library?
    3. What is one advantage of generating a genomic library using phages instead of plasmids?
    4. Is biotechnology always associated with genetic engineering? Explica tu respuesta.
    5. Which is more efficient: blunt-end cloning or sticky-end cloning? ¿Por qué?
    1. Liangxue Lai, Jing X. Kang, Rongfeng Li, Jingdong Wang, William T. Witt, Hwan Yul Yong, Yanhong Hao et al. "Generation of Cloned Transgenic Pigs Rich in Omega-3 Fatty Acids." Nature Biotechnology 24 no. 4 (2006): 435–436. &crarr
    2. Raylene Ramos Moura, Luciana Magalhães Melo, and Vicente José de Figueirêdo Freitas. "Production of Recombinant Proteins in Milk of Transgenic and Non-Transgenic Goats." Brazilian Archives of Biology and Technology 54 no. 5 (2011): 927–938. &crarr
    3. William S.M. Wold and Karoly Toth. "Adenovirus Vectors for Gene Therapy, Vaccination and Cancer Gene Therapy." Current Gene Therapy 13 no. 6 (2013): 421. &crarr


    Ver el vídeo: METODO ANTICONCEPTIVO: LIGADURA DE TROMPAS (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Kamal

    Te felicito, este muy buen pensamiento está cayendo por el camino

  2. Driskell

    Sí, esa es la respuesta inteligible.

  3. Dunleigh

    es excelente idea Te apoyo.

  4. Tavis

    ¿Has estado escribiendo este artículo durante mucho tiempo?

  5. Corky

    Le ruego a su perdón que interviniera ... a mí una situación similar. Invito a la discusión.



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