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¿Puede la vacuna de ARNm desencadenar la fusión celular inducida por proteínas de pico?

¿Puede la vacuna de ARNm desencadenar la fusión celular inducida por proteínas de pico?


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Las vacunas basadas en ARNm no pueden provocar COVID-19 o sus síntomas, ya que solo conducen a la producción de la proteína de pico en la célula.

Sin embargo, la proteína de pico en sí misma puede conducir a la fusión celular: los ensayos cuantitativos revelan fusión celular a niveles mínimos de proteína de pico de SARS-CoV-2 y fusión desde afuera

¿Es este un riesgo potencial de la vacuna de ARNm? ¿Podría imaginarme que la proteína de pico necesita estar unida al virus para inducir este efecto? No pude encontrar ninguna literatura donde se pruebe el efecto de la proteína de pico no unida.


Las vacunas de ARNm codifican una versión mutante de la proteína de pico en la que se bloquea la transición estructural necesaria para fusionar las membranas. Esto se hizo para que la respuesta inmune se centrara en el estado previo a la fusión, que es mucho mejor para neutralizar el virus.

De https://cen.acs.org/pharmaceuticals/vaccines/tiny-tweak-behind-COVID-19/98/i38:

Afortunadamente, Graham y un ex postdoctorado, Jason McLellan, idearon una solución a este problema antes de la pandemia. A través de un poco de biología estructural e ingeniería de proteínas persistente, McLellan descubrió que agregar dos prolinas, la más rígida de los 20 aminoácidos, a una articulación clave de la proteína de punta de una vacuna podría estabilizar la forma de prefusión de la estructura. Esta mutación 2P funcionó en estudios preclínicos de la vacuna MERS de Graham y Moderna, por lo que la aplicaron a la vacuna COVID-19 de Moderna.

No sé si las células que expresan la proteína de pico de tipo salvaje se fusionarían en sincitios, pero parece muy poco probable que suceda con el pico de la vacuna.


Activación de la proteína de pico del coronavirus del SARS a través de la escisión proteolítica secuencial en dos sitios distintos

La proteína de pico de coronavirus (S) juega un papel clave en los primeros pasos de la infección viral, con el dominio S1 responsable de la unión al receptor y el dominio S2 mediando la fusión de la membrana. En algunos casos, la proteína S se escinde proteolíticamente en el límite S1-S2. En el caso del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV), se ha demostrado que la entrada del virus requiere la proteasa endosómica catepsina L; sin embargo, también se encontró que la infección del SARS-CoV podría ser fuertemente inducida por el tratamiento con tripsina. En general, en términos de cómo la escisión podría activar la fusión de membranas, el procesamiento proteolítico de la proteína SARS-CoV S sigue sin estar claro. Aquí, identificamos un sitio de escisión proteolítica dentro del dominio S2 de SARS-CoV (S2 ​​', R797). La mutación de R797 inhibió específicamente la fusión dependiente de tripsina tanto en la fusión célula-célula como en los ensayos de entrada de pseudovirión. También introdujimos un sitio de escisión de furina en el sitio de escisión de S2 'dentro de S2 793-KPTKR-797 (S2'), así como en la unión de S1 y S2. La introducción de un sitio de escisión de furina en la posición S2 'permitió la fusión célula-célula independiente de la tripsina, que se incrementó fuertemente por la presencia de un segundo sitio de escisión de furina en la posición S1-S2. En conjunto, estos datos sugieren un mecanismo de cebado novedoso para una proteína de fusión viral, con un evento de escisión proteolítica crítica en la proteína S del SARS-CoV en la posición 797 (S2 ′), que actúa en conjunto con el sitio de escisión S1-S2 para mediar la membrana fusión e infectividad del virus.

Los virus envueltos acceden a sus células hospedadoras mediante un proceso de fusión de membranas que está mediado por una fusión específica, o proteína de "pico", codificada por el virus e incrustada en la envoltura viral (1, 2). Estas proteínas se agrupan actualmente en 3 clases estructurales distintas, con las denominadas proteínas de fusión de clase I típicamente preparadas para la activación de la fusión mediante escisión proteolítica (3, 4). La activación de la fusión puede ser activada por un pH bajo, la unión del receptor o una combinación de los dos, y el evento de escisión ocurre típicamente en la vecindad del péptido de fusión viral, que se expone a los cambios conformacionales dependientes de la activación de la proteína de la espiga e inicia la reacción de fusión después de su inserción en la membrana de la célula huésped (5). En varios casos, como el virus de la influenza aviar altamente patógena, las mutaciones en el sitio de escisión (monobásico frente a polibásico) y los cambios posteriores en la base molecular de la escisión proteolítica por enzimas similares a la tripsina o furina tienen profundas implicaciones sobre la virulencia (6, 7). Como tal, la comprensión de la escisión de la proteína espiga es fundamental para comprender la patogénesis viral.

El coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) surgió en 2003 como una amenaza significativa para la salud humana, y los coronavirus todavía representan una fuente principal de nuevos virus que emergen en la población humana. La proteína de pico de coronavirus (S) media tanto en la unión del receptor (a través del dominio S1) como en la fusión de la membrana (a través del dominio S2) y muestra muchas características de las proteínas de fusión de clase I convencionales, incluida la presencia de distintas repeticiones de heptada dentro del dominio de fusión (8 ). Los coronavirus existen en 3 grupos distintos y sus proteínas de punta parecen diferir considerablemente en su activación proteolítica (9). Mientras que algunos coronavirus, en particular el virus de la bronquitis infecciosa aviar (IBV) del grupo 3, se escinden eficazmente en el límite entre los dominios S1 y S2, muchos otros coronavirus aparentemente permanecen sin escindir. Los primeros informes que analizaron la proteína de pico de SARS-CoV expresada heterólogamente indicaron que la mayor parte de la proteína no se escindió (10, 11), pero había alguna posibilidad de escisión limitada en la posición S1-S2 (11). Sin embargo, la escisión de S1-S2 podría potenciarse mediante la expresión de las enzimas de la familia de las furinas (12).

El análisis tanto de la infección por SARS-CoV como de la transducción por viriones seudotipados del SARS-CoV S ha indicado que el virus es sensible a los inhibidores de la acidificación endosómica (13-17), y se ha demostrado que los viriones del SARS-CoV S-pseudotipados utilizan el proteasa endosomal catepsina L para infectar células (18, 19). Estos datos sugirieron que el SARS-CoV S requería un nuevo evento de escisión inducido por proteasa endocítica durante la entrada del virus, en contraste con la mayoría de las proteínas de fusión viral de clase I que se preparan durante el ensamblaje del virus o después de la liberación de la célula. Sin embargo, además de la catepsina L, se ha demostrado que varias otras proteasas escinden el SARS-CoV S. Los primeros informes mostraron que la escisión S1-S2 fue mejorada por la tripsina exógena (20), y posteriormente se demostró que la infección por el SARS-CoV aumenta por la adición de proteasas exógenas, como tripsina, termolisina y elastasa (14, 17), así como por expresión del factor Xa (21). Estos datos sugirieron que existe una ruta alternativa no endosómica de entrada del SARS-CoV. En particular, se consideró que la infección mediada por proteasas exógenas era de 100 a 1000 veces más eficiente que por la ruta endosómica (17). Según los patrones de escisión en geles SDS / PAGE, el evento de escisión predominante mediado por la proteasa exógena parece estar en el límite S1-S2, y el análisis bioquímico posterior mediante secuenciación N-terminal identificó R667 (SLLR-S) como un sitio de tripsina escisión (22). De manera similar, la catepsina L exógena también puede escindir la unión S1-S2 en el residuo T678 (VAYT-M) (23).

Aunque la escisión de SARS-CoV S se logra fácilmente en el límite S1-S2, es notable que la mutación de los 2 residuos básicos en esta región (R667 y K672) no afectó la fusión de la membrana cebada con tripsina, a pesar de bloquear la escisión S1-S2 (24), lo que sugiere que el procesamiento proteolítico de SARS-CoV S que conduce a una activación de la infectividad puede ocurrir en un sitio diferente. Aquí, investigamos los sitios de escisión proteolítica en SARS-CoV S y caracterizamos un nuevo sitio de escisión en el dominio S2 (S2 ′), que actúa en concierto con el sitio de escisión S1-S2 para mediar la fusión de membrana mediada por SARS-CoV S y infectividad del virus.


Abstracto

Los coronavirus son expertos en evadir las vías antivirales del huésped inducidas por el ARN viral de doble hebra, incluida la señalización del interferón (IFN), la oligoadenilato sintetasa-ribonucleasa L (OAS-RNasa L) y la proteína quinasa R (PKR). Si bien las respuestas de IFN desreguladas o inadecuadas se han asociado con una infección grave por coronavirus, el grado en el que el SARS-CoV-2 de reciente aparición activa o antagoniza estas vías es relativamente desconocido. Encontramos que el SARS-CoV-2 infecta las células epiteliales nasales derivadas del paciente, presentes en el sitio inicial de la infección, las células alveolares tipo 2 derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iAT2), el principal tipo de células infectadas en el pulmón y los cardiomiocitos (iCM) , consistente con las consecuencias cardiovasculares de la enfermedad COVID-19. La activación robusta de IFN o OAS-RNase L no se observa en estos tipos de células, mientras que la activación de PKR es evidente en iAT2 e iCM. En líneas celulares derivadas de pulmón Calu-3 y A549 ACE2 infectadas con SARS-CoV-2, la inducción de IFN permanece relativamente débil, sin embargo, se observa la activación de OAS-RNase L y PKR. Esto contrasta con el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) -CoV, que inhibe eficazmente la señalización de IFN y las vías OAS-RNasa L y PKR, pero es similar al MERS-CoV mutante que carece de antagonistas inmunitarios innatos. Sorprendentemente, OAS-RNase L y PKR se activan en MAVS células inactivas A549 ACE2, lo que demuestra que el SARS-CoV-2 puede inducir estas vías antivirales del huésped a pesar de la producción mínima de IFN. Además, el aumento de la replicación y el efecto citopático en RNASEL Las células inactivadas A549 ACE2 implican a la OAS-RNasa L en la restricción del SARS-CoV-2. Finalmente, mientras que el SARS-CoV-2 no antagoniza estas vías de defensa del huésped, lo que contrasta con otros coronavirus, la respuesta de señalización de IFN es generalmente débil. Estas interacciones huésped-virus pueden contribuir a la patogénesis única del SARS-CoV-2.

El SARS-CoV-2 surgió en China a fines de 2019, causando la pandemia de COVID-19 con una morbilidad y mortalidad extensas, lo que provocó cambios importantes en la vida cotidiana en muchas partes del mundo. Este fue el tercer coronavirus humano respiratorio letal, después del SARS-CoV en 2002 y el coronavirus causante del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) en 2012, que surgió de los murciélagos en el siglo XXI. Aunque estos virus son todos miembros de la Betacoronavirus género (1), cada uno ha causado un patrón algo diferente de patogénesis y propagación en humanos, con el SARS-CoV-2 solo capaz de propagarse desde individuos asintomáticos o presintomáticos (2). Por lo tanto, es importante comprender cómo interactúan estos virus con su anfitrión.

Los coronavirus están envueltos con genomas grandes de ARN monocatenario (ssRNA) de sentido positivo de alrededor de 30 kb que pueden infectar una amplia gama de mamíferos y otras especies. Los coronavirus usan gran parte de sus genomas, incluido su locus de replicasa conservado Orf1ab de ∼20-kb, para codificar proteínas que antagonizan las respuestas de la célula huésped (3). Como resultado, son muy hábiles para antagonizar las vías inducidas por ARN bicatenario (dsRNA) que son componentes esenciales de la respuesta inmune innata del huésped (4 ⇓ ⇓ ⇓ –8). Además, los genes específicos del linaje CoV que codifican proteínas accesorias, que no son esenciales para la replicación del ARN y son variables entre los linajes CoV, dividen aún más el Betacoronavirus género (9). Estas proteínas accesorias a menudo tienen funciones para antagonizar las respuestas de la célula huésped y, por lo tanto, probablemente contribuyan a las diferencias en la patogénesis y el tropismo observadas entre los diferentes linajes (10 ⇓ –12).

Al igual que otros virus de ARN, los coronavirus producen ARNdc temprano durante el ciclo de infección como resultado de la replicación del genoma y la transcripción del ARNm (13). Los receptores de reconocimiento de patrones de la célula huésped (PRR) detectan el dsRNA viral como patógeno no propio y responden activando varias vías antivirales críticas para la defensa temprana contra la invasión viral. La detección de ARNd por los PRR citosólicos se puede dividir en tres vías clave: producción de interferón (IFN), activación de oligoadenilato-ribonucleasa L (OAS-RNasa L) y activación de proteína quinasa R (PKR) (Fig.1) (14). La detección de dsRNA por MDA5 durante la infección por coronavirus (15) conduce a la producción de IFN tipo I (α / β) y tipo III (λ). Al unirse a su receptor de superficie celular específico, el IFN desencadena la fosforilación de los factores de transcripción STAT1 y STAT2, que luego inducen la expresión de genes estimulados por IFN (ISG) con actividades antivirales (16, 17). Paralelamente, el dsRNA también es detectado por oligoadenilato sintetasas (OAS), principalmente OAS3, que sintetiza oligoadenilatos unidos a 2′-5′ (2-5A) (18, 19), que inducen la dimerización y activación de la RNasa L, lo que lleva a la degradación. de ssRNA viral y del huésped (20). Finalmente, la detección de dsRNA por PKR induce la autofosforilación de PKR, lo que permite que PKR luego fosforile el factor de inicio de la traducción eIF2α, lo que da como resultado la parada de la síntesis de proteínas y la restricción de la replicación viral (21). Si bien la actividad antiviral de RNasa L y PKR no depende de la producción de IFN (18), los genes que codifican OAS y PKR son ISG, por lo tanto, estas vías pueden ser activadas o reforzadas por la producción de IFN. De manera similar, la activación de la RNasa L y PKR puede promover el estrés celular, la inflamación y la muerte apoptótica (22 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –27), lo que reduce aún más la viabilidad de la célula huésped.

El dsRNA indujo respuestas inmunes innatas durante la infección por coronavirus. El ARNdc del coronavirus es reconocido por OAS citosólico, MDA5 o PKR para activar vías inmunes innatas. MDA5 envía señales a través de MAVS, lo que conduce a la producción de IFN tipo I y tipo III y la posterior transcripción de ISG y respuestas de citocinas. Los OAS producen 2-5A que activan la ARNasa L, que escinde el ARNss del huésped y del virus para desencadenar la apoptosis y la inflamación. PKR se autofosforila antes de fosforilar eIF2α, lo que conduce a una detención de la traducción, muerte celular y respuestas inflamatorias. El gráfico fue creado con BioRender.com.

La inducción e inhibición de las respuestas inmunitarias innatas durante la infección por SARS-CoV-2 aún no se han caracterizado por completo. Varios informes recientes implican deficiencias genéticas en las respuestas de IFN (28, 29) o polimorfismos en los genes OAS (30) con la enfermedad COVID-19 más grave, enfatizando la importancia de comprender las interacciones entre el SARS-CoV-2 y estas vías de respuesta innatas. Además, aunque se sabe que el SARS-CoV-2 ingresa al cuerpo humano a través del tracto respiratorio superior, no está claro qué tipos de células del sistema respiratorio superior e inferior contribuyen a la infección sostenida y la enfermedad resultante en las vías respiratorias y en otros lugares. Hemos realizado infecciones por SARS-CoV-2 de células epiteliales nasales primarias, células alveolares tipo 2 derivadas de células pluripotentes inducidas (iPSC) (iAT2) y cardiomiocitos derivados de iPSC (iCM), que en conjunto representan los tejidos del huésped probablemente afectados por Infección clínica por SARS-CoV-2 (31, 32). Evaluamos la replicación viral en estos tipos de células, así como el grado de las consiguientes respuestas de detección de dsRNA. También empleamos dos líneas de células inmunocompetentes derivadas de pulmón, células Calu-3 y A549, para investigar la activación de la vía inducida por dsRNA durante la infección por SARS-CoV-2.


Detención del ciclo celular en fase G1 inducida por la proteína SARS-CoV 3a a través de la vía ciclina D3 / pRb

El SARS-CoV 3a es una proteína estructural, que se localiza principalmente en el aparato de Golgi y se co-localiza con el SARS-CoV M en células cotransfectadas. Aquí observamos que la expresión transitoria de 3a inhibió el crecimiento celular y evitó la incorporación de 5-bromodesoxiuridina, lo que sugiere que 3a desregula la progresión del ciclo celular. El análisis del ciclo celular demostró que la expresión de 3a se asoció con el bloqueo de la progresión del ciclo celular en la fase G1 en las células HEK 293, COS-7 y Vero 24 a 60 h después de la transfección. El análisis de mutación de 3a reveló que la región C-terminal (176 aa ∼ 274 aa), que incluye un motivo de ATPasa de calcio potencial, era esencial para la inducción de la detención del ciclo celular. El análisis topológico mostró que 3a se localiza predominantemente en el aparato de Golgi, con su N-terminal residiendo en el lumen (Nlum) y C-terminal en el citosol (Ccyt). Al analizar las proteínas celulares que participan en la regulación de la progresión del ciclo celular, demostramos que la expresión de 3a se correlacionó con una reducción significativa del nivel de ciclina D3 y la fosforilación de la proteína del retinoblastoma (Rb) en Ser-795 y Ser-809/811, no con la expresión de ciclina D1, D2, cdk4 y cdk6 en 293 células. Se observaron aumentos en la fosforilación de p53 en Ser-15 en células transfectadas con SARS-CoV M y 3a, lo que sugiere que podría no correlacionarse con la detención de la fase G0 / G1 inducida por 3a. La reducción del nivel de ciclina D3 y la fosforilación de Rb se confirmaron además en células Vero infectadas con SARS-CoV. Estos resultados indican que la proteína SARS-CoV 3a, al limitar la expresión de ciclina D3, puede inhibir la fosforilación de Rb, lo que a su vez conduce a un bloqueo en la fase G1 del ciclo celular y a una inhibición de la proliferación celular.

Nuestros resultados sugirieron que la proteína SARS-CoV 3a juega un papel importante en el ciclo de vida del SARS-CoV y la patogénesis inducida por virus.

El producto del gen SARS-CoV 3a (CDS: 25252-26074), también denominado ORF3, X1 y U274 en otros artículos, se identificó por separado en las células infectadas con SARS-CoV, muestra de pulmón de un paciente con SARS y viriones en bruto (9-11). Anteriormente, se informó que la proteína 3a se encuentra en el aparato de Golgi, y la segunda o tercera regiones transmembrana son responsables de la localización de Golgi (12). La proteína de membrana integral 3a interactúa con otras proteínas estructurales, como las proteínas S, M y E, así como con la proteína no estructural U122, en células Vero E6 infectadas o transfectadas (9). Los artículos publicados recientemente mostraron que el producto del gen 3a es una proteína estructural del SARS-CoV (13, 14). En general, estos hallazgos sugieren que la proteína 3a es una proteína importante en el ciclo de vida viral. En este estudio, primero presentamos evidencia de que la sobreexpresión del gen 3a puede inhibir el crecimiento celular y bloquear la progresión del ciclo celular en la fase G1. El dominio responsable de estas funciones se identificó además mediante la construcción de una serie de mutantes truncados del gen 3a. El mecanismo detrás de la detención de la fase G1 implicó principalmente una disminución en la expresión de la ciclina D3 y la proteína del retinoblastoma fosforilado (Rb). Estos resultados sugirieron que la proteína 3a juega un papel importante en el ciclo de vida del SARS-CoV y la patogénesis inducida por virus.

Las líneas celulares de riñón embrionario humano, HEK 293, y las líneas celulares de riñón de mono verde africano, Vero E6 y COS-7, se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado con FBS al 10%. Los cultivos se incubaron a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO2. Cuando la densidad celular en una placa de cultivo alcanzó el 70% de confluencia, las células se transfectaron con diferentes ADN plásmidos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Brevemente, la cantidad total de ADN transfectado en las células de cada pocillo se ajustó a 2 µg / ml utilizando el vector pCMV-myc vacío.Las células se incubaron con mezclas de transfección durante 5 h y luego se reemplazaron con medio fresco.

El gen 3a utilizado para este estudio se amplificó mediante PCR a partir del genoma del SARS-CoV (ZJ01, AY297028) utilizando Taq ADN polimerasa (NEB). La PCR se realizó con un cebador directo (que contiene un EcoR I sitio) complementario al extremo 5 'del gen 3a y un cebador inverso (que contiene un Xho yo site) complementario al extremo 3 'del gen 3a (Tabla 1). Este producto fue cortado con EcoR I y Xho yoy clonado en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pCMV-myc (Clontech), produciendo un plásmido 3a / pCMV-myc. La secuencia del plásmido se confirmó mediante secuenciación. Los mutantes en serie del gen 3a / pCMV-myc, proteína fluorescente verde (GFP) / pCMV-myc, 3a-hemaglutinina (HA) /pcDNA3.1, proteína de membrana del SARS-CoV (M) / pCMV-myc y M-HA Las construcciones /pcDNA3.1 se hicieron de una manera similar, y los cebadores oligonucleotídicos utilizados se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1. IMPRIMADORES UTILIZADOS PARA CONSTRUCCIONES DE TIPO SALVAJE Y TRUNCADOS 3a

Las secuencias de genes corresponden a SARS-CoV (ZJ01).

* Los nucleótidos subrayados representan el sitio de restricción antes del codón de inicio (ATG).

† Los nucleótidos subrayados representan el sitio de restricción antes del codón de terminación.

Se transfectaron células HEK 293 sembradas en una placa de 24 pocillos (Costar, Cambridge, MA) con 3a / pCMV-myc y pCMV-myc por triplicado. A intervalos de 12 h después de la transfección, las células se aclararon con PBS y se preparó una única suspensión celular mediante tripsinización. Las células viables, que son resistentes a la tinción con azul tripán, se contaron con una cámara de hemocitómetro. Para evitar sesgos, el recuento se realizó a ciegas por dos personas para cada muestra. Se analizaron las células transfectadas con al menos tres clones independientes.

Para el ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2,5-difenil tetrazolio (MTT), se transfectaron células HEK 293 sembradas en una placa de 96 pocillos (Costar) con diferentes concentraciones de 3a / pCMV-myc y plásmidos pCMV-myc por triplicado. Después de 48 h, cada pocillo se complementó con 20 μl de solución de MTT (5 mg / ml) y se incubó durante 3 h. Se retiró el medio y se añadieron 200 µl de DMSO a cada pocillo. Luego se hizo vibrar la placa para disolver los cristales y se midió la absorbancia (O.D.) a 570 nm. Los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces.

Se estudió la localización celular de la proteína SARS-CoV 3a y sus mutantes en células transfectadas según el procedimiento descrito anteriormente (12).

Para la incorporación de 5-bromodesoxiuridina (BrdUrd), se transfectaron células Vero E6 y COS-7 con 3a / pCMV-myc y M / pCMV-myc. A las 24 h después de la transfección, las células en cubreobjetos de vidrio se incubaron con 10 μmol / litro de BrdUrd durante 4 ha 37 ° C y se fijaron con metanol al 100% a 4 ° C durante 10 min. La BrdUrd incorporada se expuso mediante tratamiento con ácido clorhídrico 2 M a 37ºC durante 2 h, seguido de neutralización en tampón borato 0,1 M (pH 8,5). Después de lavar en PBS, las células se permeabilizaron en Triton X-100 / PBS al 0,1% durante 5 min y se incubaron con anti-BrdUrd (1: 100 Sigma, St. Louis, MO) y anti-myc (1: 100 Cell Signalling, Beverly , MA) anticuerpos durante 1 h. Las imágenes se visualizaron y recogieron con un microscopio de fluorescencia confocal conectado a un escáner láser Bio-Rad Radiance 2100 (Bio-Rad, Richmond, CA).

Para la citometría de flujo, se fijaron 2 x 106 células transfectadas durante la noche con etanol frío al 70% a 4ºC. Luego, las células se permeabilizaron en Triton X-100 / PBS al 0,1%, se incubaron con anticuerpo anti-myc (1: 100) y anti-IgG de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (1: 100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), se resuspendió en solución de tinción de yoduro de propidio (PI, 50 μg / ml) (que contiene 20 μg / ml de ARNasa A libre de ADNasa) durante 30 min en la oscuridad y se analizó inmediatamente mediante citometría de flujo. El contenido de ADN y otros datos del clasificador de células activadas por fluorescencia se analizaron con el software CellQuest (Becton Dickinson, San José, CA) (15).

Las células transfectadas (o infectadas) se recolectaron en los tiempos indicados después de la transfección (o infección). La preparación de los lisados ​​celulares totales y el análisis de transferencia Western se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (16). Brevemente, los lisados ​​celulares se aclararon mediante centrifugación a 12.000 × gramo durante 10 min a 4 ° C. Se separaron cantidades iguales de proteína (20 µg) mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas NC (Osmonics, Inc., Westboro, MA). Las membranas se sondaron con anticuerpos primarios (anticuerpos contra myc, β-actina, ciclina D1, ciclina D2, p53, fosfo-p53 en Ser-15, Rb, fosfo-Rb en ​​Ser-795 y Ser-809/811, CDK4, CDK6, ciclina D3, cdc2 y ciclina A, todos los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling) y posteriormente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. La detección de anticuerpos se realizó utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Cell Signalling).

Cuando fue necesario volver a sondear la membrana con otro anticuerpo, la membrana se retiró con tampón de separación (SDS al 2%, β-mercaptoetanol 100 mM, Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8) a 50 ° C durante 30 min y se lavó con TBST ( Tampón Tris-HCl 20 mmol / litro, NaCl 140 mmol / litro, Tween 20 0,1%) antes de su uso.

El SARS-CoV (BJ01, AY278488) se cultivó como se describió anteriormente (17). Cuando la densidad celular en un matraz de cultivo de 60 mm alcanzó el 90% de confluencia, las células Vero E6 se infectaron con 1 x 104 TCID50 de SARS-CoV, en un volumen final de 2 ml de DMEM con FBS al 2% durante 1 ha 37 ° C. Luego, las células se lavaron con PBS y se reemplazaron con medio completo para permitir el crecimiento. A las 6 y 24 h después de la infección, las células se lavaron con PBS y se lisaron en 200 μl de tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, NP-40 al 0,5% (Sigma), desoxicolato de sodio al 0,5%, y SDS al 0,005%. Se utilizó un total de 20 µl del lisado para el análisis de transferencia Western (descrito anteriormente).

El ARN total se preparó a partir de células transfectadas con 3a / pCMV-myc o pCMV-myc. La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) se realizó utilizando los cebadores para ciclina D3 (cebador sentido, 5′-CCT CCT ACT TCC AGT GCG TG-3 ′ cebador antisentido, 5′-GCA ACT CGT CAT ACT CCT GCT T-3 ′) (299 pb) y β-actina (cebador sentido, 5′-CAC TCT TCC AGC CTT CCT TCC-3 ′ cebador antisentido, 5′-CGG ACT CGT CAT ACT CCT GCT T-3 ′) (388 bp) genes .

El análisis estadístico se realizó mediante el uso de Student t prueba. Los datos se expresan como media y DE. Las bandas en la transferencia Western se escanearon con un escáner (Microtek, Carson, CA) y la densidad media de cada banda se analizó utilizando el software Cantidad Uno (Bio-Rad). La expresión de la proteína y los niveles de ARNm se representaron después de la normalización frente a la actina o la señal de proteína total no fosforilada correspondiente.

En este estudio, el gen 3a de SARS-CoV (ZJ01, AY297028), se clonó en el vector pCMV-myc y se expresó en células HEK 293 como se describió anteriormente (12). Hemos observado que las células HEK 293 transfectadas con 3a / pCMV-myc crecen más lentamente que las células transfectadas con pCMV-myc. Por tanto, especulamos que la expresión del gen 3a puede inhibir la proliferación celular. En comparación con las células de control de crecimiento exponencial transfectadas con pCMV-myc, las células que expresan el gen 3a mostraron una disminución significativa en el número de células después de 24 h (Figura 1A). En las células transfectadas con 3a / pCMV-myc, menos del 4,8% de las células estaban muertas, lo que indicó que la razón de la disminución en el número de células no fue la muerte celular, sino que podría ser la inhibición del crecimiento celular inducida por la expresión del gen 3a. . Los experimentos anteriores se repitieron con el ensayo MTT, una prueba colorimétrica más sensible para controlar la proliferación celular. Como se muestra en la Figura 1B, la inhibición del crecimiento de las células HEK 293 transfectadas con 3a / pCMV-myc dependía significativamente de la dosis de plásmido utilizado para la transfección, mientras que el crecimiento de las células HEK 293 transfectadas con 3a / pCMV-myc se inhibió marginalmente en la dosis más alta de plásmido (1.0–2.0μg / ml). Basándose en su aparente capacidad para inhibir el crecimiento celular, se utilizó 1,0 µg / ml de plásmido 3a / pCMV-myc para la transfección en nuestros experimentos posteriores. Para abordar el mecanismo de 3a sobre la inhibición del crecimiento celular, la síntesis de ADN celular se midió adicionalmente mediante la incorporación de BrdUrd (15). En vista de la propensión de las células HEK 293 a formar fácilmente una bola de masa de células después del tratamiento con ácido clorhídrico 2 M, se utilizaron células COS-7 en el ensayo. Como se muestra en la Figura 1C, ∼ 75% de las células COS-7 myc-3a negativas habían incorporado BrdUrd, mientras que casi todas las células que expresaban myc-3a tenían poca o ninguna incorporación de BrdUrd (sólo 2,85% de células positivas). Se obtuvieron resultados similares en células Vero E6 transfectadas con myc-3a (datos no mostrados). Como control, tanto las células myc-M (la proteína de membrana del SARS-CoV) -positivas como las negativas tuvieron tasas similares de incorporación de BrdUrd (63% versus 68%). Estos datos indican que la expresión de 3a inhibe el crecimiento celular y previene la entrada del ciclo celular en la fase S.

Figura 1. Inhibición de la proliferación celular mediante la expresión de la proteína SARS-CoV 3a. (A) Inhibición del crecimiento de la proteína 3a en las células transfectadas. Se transfectaron células HEK 293 con cantidades equivalentes de pCMV-myc (control) o 3a / pCMV-myc. A las 12, 24, 36, 48 y 60 h después de la transfección, las muestras se recolectaron y contaron usando un contador manual. Los recuentos de células en cada punto de tiempo fueron los valores medios de tres experimentos independientes con desviación estándar (SD). *PAG & lt 0,05 frente al control. (B) Efectos de diferentes cantidades de ADN plasmídico sobre el crecimiento de células transfectadas con pCMV-myc o 3a / pCMV-myc. Se transfectaron cien microlitros de células HEK 293 con diferentes concentraciones de pCMV-myc o 3a / pCMV-myc en placas de cultivo de 96 pocillos. Después de 48 h, cada pocillo se complementó con solución de MTT y se midió la absorbancia (O.D.) a 570 nm. Los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces y se presentó un experimento con tres duplicados en cada concentración. Los datos mostrados fueron la media de tres experimentos independientes ± DE. *PAG & lt 0,05 frente al control. (C) La sobreexpresión de la proteína 3a inhibió la replicación del ADN de las células COS-7. A las 24 h después de la transfección con 3a / pCMV-myc o M / pCMV-myc, las células COS-7 se incubaron con 10 µmol / litro de BrdUrd durante 4 hy se tiñeron con anticuerpos anti-BrdUrd y anti-myc. Las imágenes se vieron y se recogieron bajo un microscopio de fluorescencia confocal. los paneles izquierdos muestran células positivas para myc-3a o myc-M, el paneles intermedios mostrar las celdas de incorporación BrdUrd, y el paneles derechos mostrar superposición de imágenes de tinción BrdUrd y myc-3a (myc-M).

La desregulación del ciclo celular es una respuesta común de las células huésped a muchas infecciones virales, y se ha demostrado que algunas proteínas virales son eficaces para inducir la detención del ciclo celular, como la orf-a del virus de la inmunodeficiencia felina y la proteína no estructural p28 del coronavirus de la hepatitis murina (MHV ) (18, 19). La citometría de flujo es un análisis celular rápido, cuantitativo y multiparamétrico basado en la medición de la emisión de luz visible y fluorescente. Usando la etiqueta myc para identificar las células transfectadas (células positivas con etiqueta myc) y no transfectadas (células negativas con etiqueta myc) en células HEK 293 transfectadas con 3a / pCMV-myc (15), el ciclo celular de las dos poblaciones Se analizó, y la eficiencia de transfección de 3a / pCMV-myc se reveló que era del 20,2% mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 2A, aproximadamente el 67% de las células positivas para la expresión del gen 3a estaban en la fase G1, mientras que solo aproximadamente el 50% de las células negativas para 3a estaban en la fase G1 a las 24 h después de la transfección. Para confirmar aún más el efecto de la expresión del gen 3a, se transfectaron células HEK 293 con M / pCMV-myc y GFP / pCMV-myc. Se encontró que las eficiencias de transfección de los plásmidos de expresión myc-GFP y myc-M eran 35,7% y 34,0%, respectivamente. Como se muestra en la Figura 2A, las poblaciones positivas y negativas de myc-M y myc-GFP tenían perfiles de progresión del ciclo celular similares, lo que indica que la expresión de myc-M o myc-GFP tuvo poco efecto sobre el ciclo celular. Como controles, las células de control HEK 293 y las células HEK 293 transfectadas con pCMV-myc tenían perfiles de ciclo celular similares, con ∼ 50% de las células en la fase G1 (datos no mostrados). Para probar si la detención de la fase G1 inducida por la expresión del gen 3a era específica de la línea celular o no, se transfectaron por separado pCMV-myc y 3a / pCMV-myc en células COS-7 y Vero E6. Las eficiencias de transfección en los dos tipos de células fueron ∼ 18%. Como en el caso de las células 293, la transfección con pCMV-myc tuvo poco efecto sobre los perfiles del ciclo celular de las células COS-7 y Vero E6 (datos no mostrados). En ambas líneas celulares, se observó la detención de la fase G1 inducida por la expresión del gen 3a, que era tan obvia como la de las células 293, lo que sugiere que un mecanismo común en las diferentes líneas celulares está involucrado en la detención de la fase G1 inducida por la proteína 3a (Figura 2B) .

Figura 2. Detención del ciclo celular en fase G1 inducida por la proteína SARS-CoV 3a. (A) Expresión de la detención del ciclo celular de la fase G1 inducida por el gen 3a. Se transfectó 3a / pCMV-myc, M / pCMV-myc o pCMV-myc en células HEK 293. A las 24 h después de la transfección, se recolectaron muestras y se tiñeron con anticuerpo anti-myc y PI. El contenido de ADN de las células se midió mediante citometría de flujo. Los perfiles del ciclo celular de las células expresadas en myc-3a (o myc-M) se muestran en la columna del medio y representado como "myc positivo", mientras que "myc negativo" en el columna derecha representa las células no transfectadas de la misma población. Los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces. (B) Detención del ciclo celular G1 inducida por la proteína 3a en diferentes células. Se transfectaron células COS-7 y Vero E6 con 3a / pCMV-myc durante 24 h, seguido de tinción con anticuerpo anti-myc y yoduro de propidio. Las células se analizaron mediante citometría de flujo como anteriormente. El histograma mostró los porcentajes de células myc-3a positivas y negativas en varias fases del ciclo celular con medias ± DE para tres conjuntos independientes de experimentos. (C) Detención del ciclo celular G1 inducida por la proteína 3a en diferentes momentos después de la transfección. Se transfectaron células HEK 293 con 3a / pCMV-myc. A las 24, 36, 48 y 60 h después de la transfección, las muestras se recogieron y analizaron mediante citometría de flujo como antes. Las células positivas y negativas para myc-3a se mostraron con una columna diferente. El histograma mostró los porcentajes de células en varias fases del ciclo celular con medias ± DE para tres conjuntos independientes de experimentos. (D) Niveles de expresión de la proteína myc-3a en diferentes momentos después de la transfección. Se transfectaron células HEK 293 con cantidades equivalentes de plásmido 3a / pCMV-myc. En momentos determinados después de la transfección, se prepararon lisados ​​celulares y se sondaron con anticuerpo anti-myc o anti-actina.

La detención de la fase G1 es un punto de control crucial del daño del ADN, que actúa como una salvaguarda importante para la estabilidad genómica. Las células en detención de la fase G1 pueden entrar en apoptosis o recuperarse de la fase G1 para entrar en la fase S (15, 20). Para observar el desenlace de la detención de la fase G1 inducida por la proteína 3a, se realizó un análisis del ciclo celular en células HEK 293 transfectadas con 3a / pCMV-myc de 24 a 60 h después de la transfección. Un aumento significativo en el porcentaje de células en la fase G1, y la reducción concomitante en el porcentaje de células en la fase S, fue notable en las células que expresan la proteína 3a entre 24 y 60 h después de la transfección en relación con las células de control, con una inducción máxima de G1 la detención de la fase se observa a las 24 h después de la transfección (Figura 2C). Después de 24 h, aunque hubo algunos aumentos en el número de células en la fase S, todavía se notaba una detención de la fase G1 en las células que expresaban la proteína 3a, lo que indica que esta detención no se debió a un efecto de densidad celular. El ensayo de transferencia Western mostró que los niveles de expresión de la proteína myc-3a en las células transfectadas fueron similares entre 24 y 60 h después de la transfección (Figura 2D). Las razones del aumento en el número de células en la fase S en los momentos posteriores podrían ser que algunas células que expresan niveles más bajos de myc-3a podrían entrar lentamente en la fase S. Las fases sub-G1, que representan un tipo de apoptosis celular, se observaron de 24 a 60 h después de la transfección, pero no superaron el 6% de las células analizadas. Estos datos apoyan la idea de que la proteína 3a no es un inductor de apoptosis, sino un detenido del ciclo celular.

Para definir el dominio funcional de la proteína 3a involucrada en la inducción de la detención del ciclo celular, se construyó una serie de mutantes truncados según el análisis de bioinformación reportado en otros artículos (Figura 3A) (4, 5, 12). Se propone que la proteína 3a tiene tres regiones transmembrana ubicadas en los residuos 34-56, 77-99 y 103-125. Los mutantes truncados del gen 3a se clonaron en el vector pCMV-myc por separado. Estos mutantes se expresaron y migraron a la masa molecular esperada. La localización subcelular de estas proteínas se analizó en células HEK 293 como se describió anteriormente (12). Como se muestra en la Figura 3B, los mutantes D77-274, D99-274 y D1-222, que contienen de uno a tres de los dominios transmembrana previstos, se coubicaron bien con la proteína de fusión Golgi-DsRed en el citoplasma de las células cotransfectadas , que es similar a la proteína 3a de tipo salvaje. Aunque el mutante D176-274 no contenía dominios transmembrana, se localizó parcialmente con el marcador de Golgi, pero se localizó principalmente en el citoplasma y, en pequeña medida, en el núcleo.

Figura 3. Localización subcelular e inducción de detención del ciclo celular de los mutantes truncados en 3a. (A) Representación esquemática de los mutantes truncados en 3a. Se construyeron mutantes truncados en serie 3a basándose en el análisis bioinformático de la proteína 3a. los cajas representan los dominios transmembrana denominados a, byc para el primer, segundo y tercer dominio, y el barra negra representa el motivo YxxΦ, respectivamente. Las posiciones de los aminoácidos para estos dominios se dan a continuación. Las detenciones del ciclo celular de la fase G1 de estos mutantes 3a se muestran en la Derecha (S, sí N, no). (B) Localización subcelular de mutantes truncados en 3a. Los plásmidos de mutantes en serie de 3a (D77–274, D99–274, D176–274 y D1–222) y pDsRed-Golgi se cotransfectaron en células HEK 293 por separado. A las 24 h después de la transfección, las células de los portaobjetos de vidrio se permeabilizaron con Triton X-100 y se visualizaron con anticuerpo anti-myc. El núcleo se tiñó con Hoechst 33342. Las co-localizaciones de mutantes truncados en 3a en serie con marcador de Golgi se observaron bajo un microscopio de fluorescencia confocal. (C) Los efectos de mutantes truncados en 3a sobre la detención del ciclo celular en fase G1. Los plásmidos de los mutantes truncados en 3a en serie se transfectaron en células HEK 293. A las 24 h después de la transfección, se recolectaron muestras y se tiñeron con anticuerpo anti-myc y PI. El contenido de ADN de las células se midió mediante citometría de flujo como antes. Los perfiles del ciclo celular de las células "myc-positivas" y "myc-negativas" se muestran en la medio y columnas de la derecha respectivamente. Los experimentos se repitieron de forma independiente tres veces.

Además, se realizó un análisis del ciclo celular como antes en células HEK 293. A las 24 h después de la transfección con plásmidos 3a-mutantes / pCMV-myc y pCMV-myc, las células se recogieron y analizaron mediante citometría de flujo. Las eficiencias de transfección de myc-3a, D77-274, D99-274, D176-274 y D1-222 en las muestras analizadas fueron 18,4, 29,2, 22,1, 18,6 y 41,2%, respectivamente.Como se muestra en la Figura 3C, en comparación con las células negativas a la transfección, los mutantes D77-274, D99-274, D176-274 y 3a tenían todos una capacidad similar para inducir la detención del ciclo celular en la fase G1, pero D1-222 no. Se concluyó que el dominio C-terminal de 3a puede ser responsable de la inducción de la detención del ciclo celular. Artículos recientes informaron que el dominio C-terminal de la proteína 3a contiene un motivo Yxxφ (160 aa-173 aa), que fue importante para la internalización de la proteína 3a de la membrana plasmática (9), y un motivo potencial de ATPasa de calcio ( 200 aa – 274 aa) (9, 10). El mutante C-terminal truncado (D1-222), que contiene el motivo Yxxφ (160 aa-173 aa), no pudo inducir la detención de la fase G1, lo que sugirió además que el posible motivo de calcio ATPasa es importante para que la proteína 3a induzca el ciclo celular arrestar.

Se informó que la proteína SARS-CoV 3a se localiza principalmente en el aparato de Golgi. Para obtener más información sobre el mecanismo por el cual la proteína 3a induce la detención del ciclo celular, se analizó la topología de la membrana de la proteína 3a en el aparato de Golgi. Las proteínas SARS-CoV 3a y M se fusionaron con las etiquetas myc y HA en sus terminales N y C, respectivamente, y se expresaron en células HEK 293. La orientación de los epítopos HA y myc se determinó mediante microscopía de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos de HA o myc en células permeabilizadas (tratadas con Triton X-100) y semipermeabilizadas (tratadas con digitonina). La proteína SARS-CoV M, que se propone localizar en el aparato de Golgi con su N-terminal en la luz y su C-terminal en el citosol (Nlum-Ccyt), sirvió como control para confirmar la integridad del complejo de Golgi. (21, 22). Como se muestra en la Figura 4, los epítopos myc de las proteínas 3a y M podrían detectarse ambos después del tratamiento con Triton X-100, pero no después del tratamiento con digitonina, lo que indica una posición lumenal de la etiqueta myc. Por el contrario, los epítopos de HA se detectaron tanto en células tratadas con Triton X-100 como con digitonina, lo que demuestra una localización citosólica del epítopo de HA. Estos datos demostraron claramente que la proteína 3a expresada, así como la proteína M, se localizan en el aparato de Golgi con una orientación NlumCcyt. El análisis bioinformático y el análisis de localización subcelular de la serie de mutantes 3a indicaron que las tres regiones transmembrana se encuentran en el extremo N-terminal entre 34 y 143 aa de la proteína 3a. Como se presenta en los resultados anteriores, el dominio funcional de la proteína 3a para inducir la detención del ciclo celular probablemente se localizó en su región citoplásmica. En esta conformación, se propone que el dominio C-terminal de la proteína 3a puede interactuar fácilmente con la proteína citoplasmática involucrada en la regulación del ciclo celular.

Figura 4. Topología de la proteína 3a en el aparato de Golgi. Se transfectaron células HEK 293 con plásmidos 3a / pCMV-myc, 3a-HA / pcDNA3.1, M / pCMV-myc o M-HA / pcDNA3.1, respectivamente. A las 24 h después de la transfección, se recogieron las células en portaobjetos de vidrio, se permeabilizaron con Triton X-100 o digitonina y luego se observaron con anticuerpo anti-myc o anti-HA. El núcleo se tiñó con Hoechst 33342. La localización celular de las proteínas de fusión 3a y M se analizó bajo un microscopio de fluorescencia confocal.

La fosforilación de Rb es un paso crítico en la transición de fase G1 a S. La fosforilación de Rb está regulada principalmente por complejos de ciclina D asociados con CDK4 / 6 y más tarde por ciclina E asociada con CDK2. Para comprender el mecanismo de detención de la fase G0 / G1 inducida por 3a, primero examinamos el estado de fosforilación de Rb en ​​células transfectadas mediante análisis de transferencia Western. Las células HEK 293 totales transfectadas con plásmidos pCMV-myc, 3a / pCMV-myc y M / pCMV-myc se recogieron 24 h después de la transfección y se analizaron con anticuerpos contra la fosforilación de Rb en ​​Ser-795 y Ser-807/811. Como se muestra en la Figura 5A, myc-3a y myc-M se expresaron en la masa molecular esperada, y cuando se compararon con las células de control y transfectadas con myc, la fosforilación de Rb en ​​Ser-795 y Ser-807/811 fue regulada a la baja en myc-3a- y myc-M-transfectadas y fue más significativo en las células myc-3a-transfectadas, lo que indica que la expresión de 3a inhibe la fosforilación de Rb y bloquea la progresión del ciclo celular en la fase G0 / G1. El estado de fosforilación de Rb se estudió más a fondo en células transfectadas con 3a / pCMV-myc. La expresión de myc-3a se observó en todos los puntos de tiempo con el nivel más alto a las 24 h después de la transfección, mientras que la fosforilación de Rb en ​​Ser-795 y Ser-807/811 disminuyó gradualmente después de la transfección. En los geles reticulados de bisacrilamida, el Rb hiperfosforilado migra lentamente, mientras que el Rb hipofosforilado y no fosforilado comigra y aparece como una banda que migra más rápidamente (18, 20). Usando un anticuerpo anti-Rb, se determinó adicionalmente el estado de fosforilación de Rb. En las células de control transfectadas con pCMV-myc y M / pCMV-myc, la mayoría de Rb apareció como una banda de migración lenta, mientras que en las células transfectadas con 3a / pCMV-myc, la banda de migración rápida se detectó 24 h después de la transfección, lo que indica hipofosforilación de Rb. Estos resultados sugirieron que la proteína 3a detiene la proliferación celular regulando la fosforilación de Rb (Figura 5A).

Figura 5. Los efectos de la proteína 3a sobre la fosforilación y / o expresión de Rb, ciclinas y cdks relacionados con el ciclo celular G1. (A) Expresión y fosforilación de Rb en ​​las células transfectadas. Se transfectaron células HEK 293 con cantidades equivalentes de plásmido pCMV-myc, M / pCMV-myc o 3a / pCMV-myc, y las células se transfectaron sin plásmido como control. A las 12, 24, 36 y 48 h después de la transfección, se prepararon lisados ​​celulares y se sondaron con anticuerpo anti-myc, anti-fosfo-Rb en ​​Ser-795 o Ser-809/811, anti-Rb o anti-actina. Las bandas de p-Rb se cuantificaron mediante análisis densitométrico y se representaron después de la normalización frente a actina. El histograma muestra las medias ± DE para tres conjuntos independientes de experimentos. (B) Niveles de ciclina D3, CDK4 y CDK6 en las células transfectadas. Se prepararon lisados ​​celulares como antes y se sondaron con anticuerpo anti-ciclina D3, anti-CDK4, anti-CDK6 o anti-actina. Las células se transfectaron sin plásmido como control. Las bandas de ciclina D3 se cuantificaron usando análisis densitométrico y se representaron gráficamente después de la normalización frente a actina. El histograma muestra las medias ± DE para tres conjuntos independientes de experimentos. (C) Niveles de ciclina D3 y Rb en ​​células infectadas con SARS-CoV. A las 6 y 24 h después de la infección por SARS-CoV, se prepararon lisados ​​de células Vero E6 como antes y se sondaron con anticuerpo anti-ciclina D3, anti-Rb o anti-actina. Las bandas de ciclina D3 se cuantificaron usando análisis densitométrico y se representaron gráficamente después de la normalización frente a actina. El histograma muestra las medias ± DE para tres conjuntos independientes de experimentos. (D) Transcripción de ARNm de ciclina D3 en células transfectadas. Después de la transfección con cantidades equivalentes de pCMV-myc o 3a / pCMV-myc, el ARN total preparado a partir de las células HEK 293 se utilizó para RT-PCR. Las reacciones se realizaron con cebadores para β-actina como controles internos y se detectaron cebadores para ciclina D3 al mismo tiempo. Los productos de PCR se separaron en gel de agarosa al 1,2%. Las bandas de ciclina D3 se cuantificaron usando análisis densitométrico y se representaron después de la normalización frente a actina. El histograma muestra las medias ± DE para tres conjuntos independientes de experimentos. (mi) Expresión y fosforilación de p53 en las células transfectadas. Los lisados ​​celulares se prepararon como antes y se sondaron con anti-p53, anti-fosfo-p53 en Ser-15 o anticuerpo anti-actina. Las células se transfectaron sin plásmido como control. Las bandas de p-p53 se cuantificaron usando análisis densitométrico y se representaron después de la normalización frente a las cantidades de p53. El histograma muestra las medias ± DE para tres conjuntos independientes de experimentos.

Rb Ser-795 y Ser-809/811 son objetivos de los complejos activos de ciclina D / CDK4 / 6 (23). La disminución observada en su fosforilación nos llevó a examinar la expresión de ciclina D1, D2, D3, cdk4 y cdk6 en células transfectadas con 3a / pCMV-myc mediante transferencias Western. No se observaron cambios significativos en los niveles de cdk4 y cdk6 entre pCMV-myc, M / pCMV-my y 3a / pCMV-myc. Y la expresión de cdk4 y cdk6 no fue obviamente diferente de 12 a 48 h después de la transfección con 3a / pCMV-myc (Figura 5B). Por el contrario, la ciclina D3 se redujo en las células expresadas en myc-3a y myc-M y se volvió más significativa en las células expresadas en myc-3a en comparación con los controles. Además, el nivel de ciclina D3 se redujo significativamente de 12 a 48 h después de la transfección con 3a / pCMV-myc, lo que fue consistente con los cambios de fosforilación de Rb (Figura 5B). La expresión de ciclina D1 y D2 no se observó en HEK 293 transfectado con 3a / pCMV-myc, M / pCMV-myc y pCMV-myc, respectivamente (datos no mostrados).

Además, se examinaron la expresión de ciclina D3 y la fosforilación de Rb en ​​células Vero E6 infectadas con SARS-CoV. En este experimento, no se observaron efectos citopáticos (CPU) a las 6 h después de la infección, mientras que aproximadamente 24 h después de la infección, las células mostraron un 25% de CPU. Como se muestra en la Figura 5C, el nivel de proteína de ciclina D3 disminuyó a las 6 h y disminuyó significativamente a las 24 h después de la infección. En comparación con la infección simulada, las bandas que migran rápidamente que representan las formas hipofosforiladas y no fosforiladas de Rb aparecieron a las 6 h y de manera significativa a las 24 h después de la infección. La disminución de los niveles de ciclina D3 y la aparición de las formas hipofosforiladas y no fosforiladas de Rb en ​​las células infectadas fueron coherentes con las de las células transfectadas. Además, la transcripción del ARNm de ciclina D3 se analizó mediante un ensayo de RT-PCR. En comparación con las células de control, el nivel de transcripción de ciclina D3 disminuyó obviamente en las células transfectadas con 3a / pCMV-myc (Figura 5D). A partir de los datos anteriores, se concluyó que en las células transfectadas con 3a / pCMV-myc y las células infectadas con el SARS-CoV, la expresión de ciclina D3 se redujo, lo que, a su vez, puede conducir a la fosforilación de Rb, un bloqueo en la fase G1. del ciclo celular, y una inhibición de la proliferación.

Es bien sabido que los inhibidores de CDK (CKI) interfieren con la progresión del ciclo celular y provocan la detención del ciclo de una fase específica. Estos inhibidores perturban el proceso de fosforilación al interactuar directamente con sus proteínas diana, como las ciclinas o las CDK. Como se muestra en la Figura 5E, la fosforilación de p53 en Ser-15 fue regulada al alza en las células expresadas en el gen 3a y M y aumentó gradualmente de una manera dependiente del tiempo en las células transfectadas con 3a / pCMV-myc, mientras que los niveles de proteína de p53 no se vieron afectados por la expresión de los genes 3a y M. Como no se observaron diferencias significativas en la fosforilación de p53 entre las células expresadas en el gen 3a y M, y los niveles de p21 Cip y p27 Kip, miembros de la subfamilia Cip / Kip, no cambiaron por la expresión 3a o M (datos no mostrados), Se propone que la fosforilación de p53 podría ser inducida por una mayor expresión de proteínas extrañas en el aparato de Golgi y no asociada con la detención de la fase G1 inducida por 3a.

Según los conceptos actuales, el compromiso del ciclo celular después del paso del punto de restricción requiere la estimulación sostenida por mitógenos de la síntesis de ciclinas de tipo D lábiles, que se asocian con la quinasa dependiente de ciclina (CDK) 4/6 para fosforilar las proteínas de la familia Rb y secuestrar las Inhibidor de CDK como p21 (WAF1) y p27kip1. La ciclina D3 se expresa en casi todas las células en proliferación y ha mostrado el patrón de expresión más amplio de las tres ciclinas de tipo D (ciclina D1, D2 y D3). Lin y colaboradores informaron que el complejo Cdk6-ciclina D3 es único entre las combinaciones de ciclina D y quinasa en la capacidad de promover el inicio del ciclo celular, evitando la inhibición por p27 (KIP1) y p21 (CIP1) con un parecido a la ciclina viral. enlazado Cdk6 (24). Se informó que el gen supresor de tumores PTEN, la activación de PKA y algunos agentes antitumorales como los glucocorticoides habían detenido la progresión del ciclo celular en la fase G1 al disminuir los niveles de ARNm de ciclina D3 y / o al inducir su degradación proteasómica. Además, la expresión forzada de ciclina D3 anuló la detención del ciclo celular inducida por PTEN, mientras que el silenciamiento de la ciclina D3 mediante la interferencia del ARN inhibió aún más la entrada de la fase S, lo que indica un papel clave para la represión de la ciclina D3 en estos eventos (25, 26). Las disminuciones en el nivel de proteína de ciclina D3 se observaron en el virus del sarampión (MV) y las células infectadas con MHV y pueden desempeñar algunas funciones para el virus en la inducción de la detención del ciclo celular G1 (20, 27). En este artículo, informamos por primera vez que la expresión del gen SARS-CoV 3a detuvo la progresión del ciclo celular en la fase G1 mediante una modulación descendente significativa de la ciclina D3. Sería interesante definir la ruta de la proteína 3a para disminuir la expresión de ciclina D3.

El papel de la detención del ciclo celular inducida por la proteína 3a no se determinó en el ciclo de vida del SARS-CoV, pero se propuso a partir de estudios recientes. Se informó recientemente que la infección por MHV, un miembro de la familia de los coronavirus, da como resultado la inhibición de la síntesis de ADN celular del huésped y la acumulación de células en la fase G1 en la activación de células DBT y 17Cl-1 mediante la inducción de la ciclina D2 y la degradación de la ciclina E (28). Se informó que la expresión de la proteína no estructural p28 del MHV induce la detención de la fase G1 en las células transfectadas y podría ser responsable de que el MHV induzca la detención del ciclo celular (18). El aumento de los datos propuso que la detención del ciclo celular en la fase G1 podría favorecer la replicación del coronavirus y exacerbar la patogenicidad inducida por el virus, especialmente en algún aspecto, por ejemplo, aumentar las cantidades de conjuntos de ribonucleótidos para la síntesis eficiente del ARN del coronavirus, evitando la inducción y ejecución de la muerte celular temprana en células infectadas, ayudando en el ensamblaje eficiente del coronavirus, beneficiando la traducción dependiente del casquete de las proteínas del coronavirus y disminuyendo la eficiencia de destrucción de las células infectadas por el coronavirus por las células T citotóxicas (20, 28). En este artículo, informamos que la expresión de 3a podría inhibir significativamente el crecimiento celular e inducir la detención de la fase G1 celular en diferentes tipos de células transfectadas y células Vero E6 infectadas. Esto sugirió que la proteína 3a puede favorecer la replicación del SARS-CoV al inducir la detención del ciclo celular en la fase G1 y, además, juega un papel importante en la patogénesis inducida por el SARS-CoV.

Los autores agradecen al Prof. Eric J. Snijder (Centro Médico de la Universidad de Leiden, Países Bajos), al Prof. Milton Taylor (Universidad de Indiana, EE. UU.), Al Dr. Sherief (Rutgers) y al Dr. Gang Li por la lectura crítica del manuscrito Associated- Profe. Zhou Tao para el ensayo de microscopía confocal y los Dres. Liu Hong-Yan, Li Su-Yan y Feng Yan-Bin para la construcción de algunos plásmidos. Los autores también agradecen al Dr. Baochang Fan (Universidad de Indiana) por su ayuda.


¿Puede la vacuna de ARNm desencadenar la fusión celular inducida por proteínas de pico? - biología

El órgano sensorial anfídico está compuesto por dos células gliales denominadas células de la vaina y la cavidad que se asocian con las terminaciones dendríticas de 12 neuronas sensoriales. La ablación del precursor de la glía de la vaina anfídica dio como resultado dendritas de neuronas anfídicas dramáticamente acortadas, lo que sugiere que la glía es importante para la extensión de las dendritas (T. Bacaj, resultados no publicados). Para estudiar este fenotipo con mayor profundidad realizamos un cribado mutante para buscar animales en los que la extensión dendrítica sea defectuosa (Heiman y Shaham, 2009). Identificamos 15 mutantes, definiendo al menos tres genes diferentes. Clonamos dos de estos genes, dyf-7 y dex-1 (ver figura). La proteína DYF-7 es una proteína de dominio transmembrana de Zona Pelúcida (ZP) similar a la beta tectorina de mamífero, una proteína que forma la membrana tectorial en la cóclea de vertebrados, y a las proteínas de Zona pelúcida de ovocitos de mamífero. DYF-7 se expresa en neuronas anfídicas, funciona durante la extensión dendrítica en el embrión y se localiza en las puntas dendríticas. dex-1 y dyf-7 exhiben interacciones genéticas sinérgicas sensibles al frío, lo que sugiere que las dos proteínas podrían interactuar. Sorprendentemente, DEX-1 es similar a la alfa tectorina, una proteína de la membrana tectorial también similar a la proteína Zonadhesin del esperma. DEX-1 también se requiere durante la extensión dendrita y se expresa en células no neuronales, y quizás en la glía. Sorprendentemente, usando imágenes en vivo en embriones usando reporteros fotoconvertibles, demostramos que las dendritas no emanan del cuerpo celular y se extienden. Más bien, un brote dendrítico se ancla usando DEX-1 y DYF-7, y la dendrita se extiende a medida que el cuerpo celular migra. A este nuevo modo de formación de dendritas lo llamamos "extensión retrógrada" (ver Figura).

También hemos examinado la envoltura glial de las neuronas durante el desarrollo mediante el estudio de la daf-6 gen (Perens y Shaham, 2005). Demostramos que DAF-6 define una nueva clase de proteínas relacionadas con Patched conservadas en Drosophila y vertebrados. DAF-6 se localiza en las membranas gliales que rodean un subconjunto de dendritas anfídicas y mutaciones en daf-6 muestran defectos en la formación del canal glial a través del cual se proyectan las neuronas sensoriales. Animales en los que las terminaciones sensoriales dendríticas son defectuosas (como dyf-13 mutantes caracterizamos a Blacque et al., 2005) localizan mal el DAF-6 glial y tienen una envoltura glial anormal, lo que sugiere que una señal neuronal incide en el DAF-6 para permitir la formación adecuada de la vaina glial. DAF-6 se expresa y afecta a la mayoría de las estructuras tubulares en C. elegans, descubriendo una posible conexión hasta ahora insospechada entre la envoltura neuronal y la tubulogénesis. Finalmente, hemos identificado un módulo de quinasa, que contiene la quinasa LIT-1 que se opone a las funciones de DAF-6 y restringe la tubulogénesis, lo que sugiere que la interacción entre DAF-6 y LIT-1 es crucial para establecer el diámetro luminal del canal anfídico. .

C. elegans glia regula activamente la estructura y función neuronal: Para comprender qué funciones, si las hay, podría desempeñar la glía durante la función neuronal, probamos las consecuencias de la ablación de la glía de la vaina anfídica en animales en los que el sistema nervioso ya se ha ensamblado (Bacaj et al., 2008). Descubrimos que en los animales operados las dendritas permanecían completas, sin embargo, las neuronas no funcionaban, como se manifiesta por los déficits de los animales operados en casi todas las modalidades sensoriales que hemos probado. Al examinar las neuronas anfídicas que se sabe están asociadas con cada función sensorial, mostramos que, en algunos casos, los defectos en la función neuronal iban acompañados de defectos estructurales en las terminaciones sensoriales especializadas de las dendritas sensoriales que están cubiertas por la glía (ver Figura). Sin embargo, en otros casos no fueron evidentes defectos estructurales obvios por microscopía óptica o electrónica, lo que sugiere que los factores secretados por la glía pueden regular la actividad neuronal. Para comenzar a caracterizar esta supuesta actividad secretada, buscamos entre los genes enriquecidos en glia identificados en nuestros estudios de microarrays para genes gliales que contengan secuencias señal para la secreción. Estudiamos uno de esos genes, Figura 1, que codifica una proteína con varios dominios de adhesión extracelular conservados también presentes en la proteína trombospondina, un regulador glial conocido de la sinaptogénesis. Encontramos que las mutaciones en este gen no tienen ningún efecto sobre la estructura neuronal o glial por microscopía óptica o electrónica.Sin embargo, sorprendentemente, los mutantes exhiben defectos funcionales en las neuronas sensoriales. Estos resultados demuestran de manera concluyente que la glía anfídica desempeña un papel activo importante en la regulación de la función neuronal.

Glía como células sensoriales: Aunque la mayoría de nuestros estudios están orientados a comprender las funciones de la glía a través de sus interacciones con las neuronas, hemos descubierto que la glía puede tener funciones sensoriales independientes de las neuronas en C. elegans (C. Procko y S. Shaham, manuscrito en preparación). Demostramos que un gen para una proteína receptora de la superficie celular se expresa en la glía de la vaina anfídica de una manera dependiente de la temperatura, apagándose a 15 ° C y encendido a 25 ° C (ver Figura). Esta capacidad de detección de temperatura es independiente de las neuronas termosensoriales conocidas en C. elegans, según lo evaluado por estudios genéticos y de ablación celular. La expresión del gen dependiente de la temperatura depende del factor de transcripción TTX-1, conocido por regular la función de la neurona termosensoria anfídica AFD. Si bien todavía estamos explorando el significado y el mecanismo de esta función de detección de temperatura glial, nuestros resultados sugieren que la glía puede tener funciones independientes de las neuronas en C. elegans. Estas funciones no se han estudiado en profundidad en otros animales.

Aunque se sabe mucho sobre la maquinaria molecular que promueve la ejecución de la apoptosis, se ha prestado poca atención a los mecanismos que regulan esta maquinaria en células individuales durante el desarrollo animal. Estamos abordando tres preguntas interrelacionadas: en primer lugar, nuestro objetivo es comprender las características moleculares que distinguen a las células destinadas a vivir de las destinadas a morir. En segundo lugar, nuestro objetivo es comprender cómo se logra el control temporal de la muerte celular. En tercer lugar, nuestro objetivo es determinar si la muerte celular dependiente de caspasa es el único modo de muerte celular durante el desarrollo animal, o si existen vías alternativas de muerte.

La decisión de morir: Una hipótesis de por qué ciertas células mueren y otras sobreviven durante el desarrollo animal es que las células destinadas a morir expresan proteínas que promueven la muerte que no se expresan en las células destinadas a vivir. Supusimos que una de esas clases de proteínas pueden ser las proteínas proapoptóticas del dominio BH3 solamente, ya que muchas de estas proteínas existen en los vertebrados, lo que sugiere que pueden desempeñar funciones específicas de la célula en la muerte celular programada. En C. elegans, la proteína del dominio BH3 de EGL-1 regula la muerte de células germinales tanto somática como inducida por daño del ADN, y se expresa en células que viven y mueren, lo que sugiere que no es un determinante de muerte específico de la célula. Por lo tanto, examinamos el C. elegans base de datos de secuencias para buscar otras proteínas del dominio BH3 e identificamos un nuevo gen que llamamos ced-13 (Schumacher et al., 2005). La sobreexpresión de CED-13 promueve la muerte celular dependiente de caspasa. La proteína CED-13 interactúa, a través de su dominio BH3, con la proteína CED-9 relacionada con Bcl-2, y esta interacción es necesaria para que ocurra la muerte celular. Mutaciones en ced-13 no afectan la muerte celular del desarrollo somático o de la línea germinal, pero afectan la muerte celular inducida por daño del ADN. ced-13 El ARNm solo se detecta en el C. elegans línea germinal, y solo en respuesta al daño del ADN. Esta transcripción regulada requiere absolutamente la C. elegans gen p53. Por tanto, hemos identificado la primera C. elegans gen de muerte celular cuya expresión está restringida a un subconjunto de células moribundas. Además, estos estudios han contribuido a dilucidar la vía que controla la muerte celular inducida por daños en el ADN (ver Figura). Sorprendentemente, en C. elegans, dos genes de dominio BH3, egl-1 y ced-13, están regulados transcripcionalmente por p53, con egl-1 teniendo un papel más amplio en la muerte celular. De manera similar, en los vertebrados, dos genes del dominio BH3, Noxa y PUMA, están regulados transcripcionalmente por p53, y uno, PUMA, tiene una función de muerte celular más amplia. Esta aparente conservación sugiere que ced-13 y egl-1 pueden tener diferentes funciones en respuesta al daño del ADN, o que están reguladas por diferentes estímulos.

Control temporal del inicio de la muerte celular: El control temporal de la muerte celular programada es necesario para garantizar que las células mueran solo en el momento adecuado durante el desarrollo animal. En algunos C. elegans células somáticas, transcripción de egl-1 promueve la muerte celular. La proteína EGL-1 inhibe la proteína CED-9 / Bcl-2, lo que da como resultado la liberación del activador de caspasa CED-4 / Apaf-1. La activación posterior de la caspasa CED-3 por CED-4 conduce a la muerte celular. A pesar del importante papel de egl-1 transcripción en la promoción de la actividad de CED-3 en células destinadas a morir, no está claro si el control temporal de la muerte celular está mediado por egl-1 expresión. La mayoría C. elegans las células que mueren durante el desarrollo somático lo hacen entre 30 y 60 minutos después de nacer, lo que dificulta la disección de las contribuciones de los genes de muerte celular individuales al control del momento en que comienza la muerte celular. Por lo tanto, decidimos estudiar el C. elegans célula de espiga de cola (Maurer et al., 2007). Esta célula binucleada muere cinco horas después de su nacimiento, y sobrevive diez veces más que la mayoría de las células destinadas a morir en C. elegans, facilitando así el análisis de la cinética del inicio de la muerte celular. Mientras que la mayoría de las células moribundas en C. elegans son indiferenciados, la célula en punta de la cola exhibe extensas características diferenciadas antes de morir, incluido un proceso filamentoso posterior que puede funcionar como un andamio para modelar el C. elegans cola. Hemos demostrado que egl-1 y ced-9 jugar sólo un papel menor en la muerte de la C. elegans célula de espiga de cola, lo que demuestra que el control temporal de la muerte de las células de espiga de cola se puede lograr en ausencia de egl-1. Mediante el uso de reporteros de GFP y estudios de RT-PCR, demostramos que el momento del inicio de la muerte celular en espiga de cola está controlado por la inducción transcripcional de la ced-3 gen de la caspasa. En la celda de la cola, ced-3 la expresión se induce minutos antes de que la célula muera, y esta inducción es suficiente para promover la desaparición de la célula. A partir de un cribado genético, aislamos tres mutantes que previenen tanto ced-3 expresión y muerte de la célula del pico de la cola. Demostramos, utilizando estrategias de clonación estándar, que dos de estos mutantes interrumpieron un gen que codifica el factor de transcripción PAL-1, el C. elegans homólogo del gen supresor de tumores intestinales de mamíferos Cdx2. PAL-1 se expresa en la célula del pico de la cola y puede unirse in vitro para ced-3 sitios promotores críticos para la muerte de las células de la cola, lo que sugiere que promueve la muerte celular activando directamente ced-3 transcripción (ver figura). Estos resultados destacan un papel no descrito previamente para la regulación transcripcional de caspasas en el control del momento de inicio de la muerte celular durante el desarrollo animal, y sugieren que la transcripción celular específica de caspasas puede ser un modo importante de regular la muerte celular específica. Además, nuestros resultados sugieren que la formación de tumores en ausencia de la función Cdx2 en mamíferos puede ser causada, al menos en parte, por defectos en la expresión de caspasa. De hecho, en el tracto digestivo, la expresión de Cdx2 está presente en el nivel más alto en células epiteliales diferenciadas que finalmente sufren apoptosis.

Descubrimiento de una nueva vía de muerte celular del desarrollo morfológicamente conservada no apoptótica: Para comprender mejor el control temporal de la muerte celular e identificar mecanismos adicionales que regulan la muerte celular específica de la célula en C. elegans También hemos estudiado la muerte de la célula enlazadora específica masculina (Abraham et al., 2005). La muerte de la célula enlazadora, dos días después de su nacimiento, durante o justo después de la transición L4 / adulto, puede facilitar la fusión entre la gónada y la cloaca, conectando el sistema reproductor masculino con el exterior. La ablación de las células vecinas a la célula enlazadora y el examen de mutantes en los que la célula enlazadora migra de forma anormal apoyan la idea de que la célula enlazadora emplea un programa autónomo de la célula para promover su desaparición. Estos estudios que realizamos también demuestran que una señal local que regula la eficiencia de la muerte de las células enlazadoras está presente en la región cloacal. Descubrimos que la muerte de las células enlazadoras está controlada por el microARN. let-7 y por el factor de transcripción de dedo de Zn LIN-29, ambos componentes de la principal vía de tiempo del desarrollo en C. elegans, lo que sugiere que la señal temporal que promueve la muerte de las células enlazadoras puede estar mediada por esta vía. LIN-29 funciona dentro de la célula enlazadora para promover su desaparición, de acuerdo con la idea de que la célula enlazadora emplea un programa de muerte autónoma de la célula. Una cascada de mapas de quinasa funciona en paralelo a LIN-29 para promover la desaparición de las células enlazadoras (Elyse Blum, resultados no publicados). Para determinar qué genes de muerte celular pueden ser objetivos de LIN-29, examinamos animales que portaban mutaciones en estos genes. Sorprendentemente, descubrimos que la muerte de las células enlazadoras es completamente independiente de todas las C. elegans genes de muerte celular, incluido el C. elegans caspasa ced-3 y todos los demás genes relacionados con la caspasa. La muerte de las células enlazadoras se produce de manera eficiente incluso en animales que portan múltiples mutaciones que bloquean la muerte de otras C. elegans células destinadas a morir. Además, aunque la célula enlazadora puede ser engullida por el programa canónico de engrosamiento de células apoptóticas cuando la célula se encuentra en una posición anormal en el animal, se requiere un programa de engrosamiento no descrito previamente para su eliminación en su ubicación normal. La microscopía electrónica de las células enlazadoras moribundas revela características no apoptóticas, incluida la almenación nuclear en ausencia de condensación de cromatina, inflamación de las mitocondrias y del retículo endoplásmico, y acumulación de estructuras unidas a la membrana citoplasmática de una o varias capas (ver Figura). Se producen cambios morfológicos sorprendentemente similares durante la muerte del desarrollo normal de las neuronas en la médula espinal de los vertebrados y los ganglios ciliares, lo que sugiere que la base molecular de este programa de muerte celular no canónica puede conservarse. Aunque se han postulado vías de muerte celular programada no apoptóticas, independientes de caspasa, se sabe poco acerca de sus constituyentes moleculares o posibles funciones in vivo. Por lo tanto, por primera vez, hemos proporcionado pruebas de la en vivo existencia de tal vía, y están bien preparados para descubrir su base genética. A pesar de la omnipresencia de la muerte celular durante el desarrollo de los mamíferos, las mutaciones en genes de apoptosis conocidos en el ratón no logran bloquear el progreso general del desarrollo. Además, en el sistema inmunológico de mutantes de apoptosis de ratón, el número total de células no aumenta en un grado que podría predecirse dado el gran número de células eliminadas durante el desarrollo normal de las células T y B. Aunque estas observaciones pueden explicarse por el control de retroalimentación del número de células y / o la redundancia dentro de la caspasa y otras familias de genes de muerte celular, también es posible que estas muertes celulares estén reguladas por una vía completamente diferente similar a la que regula la muerte de las células enlazadoras. Si este es el caso, este modo alternativo de muerte celular debe, por lo tanto, jugar un papel importante durante el desarrollo normal de los vertebrados.

Control temporal de la expresión transgénica específica de la célula: Los promotores específicos de células solo permiten el control espacial de la expresión transgénica en C. elegans. Desarrollamos un método, utilizando el rescate celular específico del factor de choque térmico-1 (hsf-1) mutantes, que permiten la regulación espacial y temporal de la expresión transgénica (Bacaj y Shaham, 2007). Demostramos la utilidad de este método para la expresión del gen informador cronometrado y para estudios temporales de la función del gen (ver Figura). Nosotros transformamos hsf-1 (sy441) mutantes con dos transgenes simultáneamente. El primer transgén, denominado controlador, consistió en el hsf-1 ADNc bajo el control de la región promotora de 5 kb del gen vap-1, que se expresa específicamente dentro de la célula glial de la vaina anfídica. El segundo transgén, denominado respondedor, consistió en el gen que codifica GFP bajo el control de la región promotora de 400 pb del hsp-16.2 gene. hsf-1 (sy441) los animales que llevaban ambos transgenes como una matriz extracromosómica, y criados a 20ºC, no mostraron expresión de GFP detectable. Sin embargo, después de la administración de un choque térmico a 34 ° C durante 30 min, se observó expresión de GFP específicamente dentro de las células de la vaina anfídica. La fluorescencia de GFP fue visible dentro de 1 h después del cambio de temperatura y todavía era evidente después de 24 h. Ahora hemos demostrado la utilidad de este método para al menos tres combinaciones diferentes de promotor / célula.

Optimización de pantallas genéticas en C. elegans: En los cribados genéticos, el número de gametos mutagenizados examinados es un parámetro importante para evaluar el progreso del cribado, el número de genes de un fenotipo mutable dado, el tamaño del gen, el coste y la mano de obra. Dado que los exámenes genéticos a menudo implican el examen de miles o decenas de miles de animales, las estrategias para optimizar los exámenes genéticos son importantes para minimizar el esfuerzo y maximizar el número de gametos mutagenizados examinados. Tales estrategias no se han descrito para cribados genéticos en C. elegans. Hemos descrito los principios generales de las pantallas genéticas en C. elegansy utilizar una estrategia binomial modificada para obtener una expresión general del número de gametos mutagenizados examinados en un cribado genético. Usamos esta expresión para calcular los parámetros de detección óptimos para una amplia gama de tipos de detección genética (Shaham, 2007). Además, desarrollamos una sencilla herramienta de optimización de pantallas genéticas en línea que se puede utilizar independientemente de este documento. Nuestros resultados demuestran que la elección de la relación de tramado óptima de F2 a F1 (ver Figura) puede mejorar significativamente la eficiencia de la trama.


Aumento de la expresión de CCR7 en el contexto de las infecciones por Denv

Se ha observado una alta expresión de CCR7 en inmunocitos en la infección por DENV. Las CD son las células diana más importantes, y se ha demostrado que la expresión de CCR7 aumenta en las CD-mo estimuladas por DENV (Wu et al., 2011). Sin embargo, las DC-mo con mayor expresión de CCR7 tienen una mayor oportunidad de interactuar con abundantes células T y comienzan a secretar citocinas, metaloproteinasas y quimiocinas en la zona T de los ganglios linfáticos que drenan. Las manifestaciones clínicas de la infección por DENV incluyen el dengue y fenómenos potencialmente fatales, como el dengue hemorrágico (DH) y el síndrome de choque por dengue (DSS). La interacción entre el DENV y los efectores inmunitarios diana, las citocinas o las quimiocinas puede conducir al desarrollo de manifestaciones clínicas graves, como el dengue hemorrágico (Wu et al., 2009). En la terapia clínica, algunos medicamentos, como la leflunomida, inhiben la producción excesiva de citocinas y quimiocinas de las DC-mo infectadas con DENV al suprimir la maduración de las DC-mo (Wu et al., 2011). De manera similar, se ha demostrado que la infección por DENV aumenta específicamente los niveles de ARNm y proteína de Gal-9. Además, el pequeño ARN de interferencia de Gal-9 regula negativamente la expresión de CCR7 y suprime la migración de DC específica de DENV hacia los quimioatrayentes CCL19 y CCL21. Por lo tanto, un inhibidor de Gal-9 podría ser útil para prevenir la inmunopatogénesis en la infección por DENV (Hsu et al., 2015). Moléculas funcionales similares podrían ser útiles en el desarrollo de fármacos para prevenir la inmunopatogénesis de DENV al reducir el número de células que expresan CCR7.


Rickettsia

Las rickettsias son bacterias intracelulares obligadas gramnegativas que se transmiten a los seres humanos a través de varios vectores [130, 131]. Varias especies de rickettsias son patógenas y, en Europa, especies pertenecientes al grupo de la fiebre manchada (SFG) Rickettsiae, como R. massiliae, R. conorii, R. slovaca, R. raoultii, R. sibirica, R. mongolotimonae, R. helvetica y R. monacensis se transmiten por garrapatas [130, 131]. Aunque se encuentra bajo investigación continua, no existe una vacuna disponible contra las rickettsiosis [132]. A diferencia del grupo de tifus transmitido por pulgas Rickettsia que pueden propagarse rápidamente entre los humanos, para las rickettsias SFG transmitidas por garrapatas, los humanos parecen ser huéspedes accidentales y probablemente sin salida [132]. Además, las rickettsiosis SFG en Europa suelen tratarse bien con antibióticos [132, 133], lo que podría plantear dudas sobre la necesidad de una vacuna específica y, por tanto, favorecer las estrategias preventivas basadas en vacunas contra garrapatas dirigidas a la transmisión de múltiples TBP.

Como bacterias intracelulares obligadas, se requiere que las rickettsias SFG invadan las células de su huésped, por lo que han desarrollado varios procesos específicos [134] que, en principio, podrían alterarse para interferir con su infectividad. Numerosos esfuerzos para lograr una inmunidad eficaz y duradera contra los agentes altamente patógenos. R. rickettsii se han realizado utilizando subunidades o bacterias muertas enteras [135]. Desafortunadamente, inactivo R. rickettsii-las vacunas basadas en la vacuna proporcionaron una inmunidad limitada al acortar el curso de la enfermedad o al reducir las tasas de letalidad [135, 136]. Se desarrollaron vacunas de subunidades basadas en proteínas de la membrana externa tanto para R. rickettsii y R. conorii pero no resultó en una inmunidad duradera [135, 136]. Por lo tanto, los enfoques clásicos para desarrollar una vacuna contra las rickettsias SFG no han tenido éxito hasta ahora. Una vacuna contra las garrapatas basada en la interacción entre las rickettsias SFG y la garrapata podría proporcionar un enfoque alternativo, particularmente cuando es eficaz contra múltiples enfermedades transmitidas por garrapatas.

A través de ensayos de inhibición molecular y bioquímica, han salido a la luz varios candidatos potenciales para la interrupción de la invasión de células de garrapatas y la transmisión de patógenos [137]. Las rickettsias SFG parecen interactuar con la maquinaria de actina de las células del huésped, ya sea artrópodo o mamífero, para propagarse entre las células a través de la motilidad basada en actina (ABM) [134, 138, 139]. Este fenómeno se ha descrito en detalle para otras bacterias intracelulares como Listeria monocytogenes, que interactúa con la maquinaria de la célula huésped para inducir la polimerización de los filamentos de actina, proporcionando así L. monocytogenes motilidad citoplasmática [139, 140]. Aunque la mayoría de los patógenos que se propagan a través de ABM utilizan las mismas vías del huésped preexistentes, parecen interactuar con él de diferentes maneras [141]. Quizás se pueda utilizar más conocimiento sobre estas interacciones específicas para interferir con la propagación de bacterias específicas de célula a célula. El complejo de proteínas Arp2 / 3 es un componente importante en la regulación del citoesqueleto de actina de la mayoría de las células eucariotas [142] y varios estudios, tanto en líneas celulares de mamíferos como de garrapatas, han demostrado que este complejo es reclutado por SFG. Rickettsia para entrar en las células del huésped a través de la endocitosis [134, 142,143,144]. Estudios que utilizan concentraciones variables de un inhibidor del complejo Arp2 / 3 y perfiles transcripcionales de infectados frente a no infectados. Dermacentor variabilis células estableció su importancia para R. montanensis invasión [142, 144]. Se han mostrado resultados similares para R. monacensis, R. conorii y R. rickettsii examinando las proteínas rickettsiales que interactúan con el complejo Arp2 / 3, como RickA [143, 145, 146].Otras proteínas del huésped involucradas en la invasión de células rickettsiales, como Cdc42, PI 3-quinasas, fosfotirosina quinasa (PTK), c-Src, quinasa de adhesión focal (FAK), Ku70, V-ATPasa, α-catenina, Rho GTPasas Rac1 y N -Las WASP también han sido investigadas en menor medida [134, 142, 143, 147, 148]. Sin embargo, se observaron diferencias entre Rickettsia especies. Por ejemplo, se encontró que Rho GTPasas Rac1 juega un papel importante en la internalización de R. montanensis dentro D. variabilis células, mientras que se consideraron innecesarias para R. conorii invasión de células VERO [142, 143]. Estos resultados podrían acreditarse a las diferencias en la interacción rickettsial-huésped entre especies de rickettsias. Sin embargo, también podrían estar relacionados con la diferencia de métodos (inhibición bioquímica y alteración de la señalización, respectivamente) o debido al uso de artrópodos. versus células mamíferas.

El cruce de la barrera del intestino medio y la colonización de las glándulas salivales de las garrapatas son procesos imperativos para la transmisión de patógenos. vía garrapata saliva [6]. Un estudio que utiliza PCR de hibridación sustractiva y de presentación diferencial en R. montanensis-infectado D. variabilis las hembras encontraron expresión diferencial de nueve clones con homología con proteínas conocidas, incluido un precursor de la proteína de la glándula salival putativa SGS-3 (Oi312-SGS-3), que se redujo significativamente en las glándulas salivales de las hembras infectadas, mientras que la cadena α de la tubulina (Oi1013 -tubulina α-cadena) y Ena / proteína similar a fosfoproteína estimulada por vasodilatador (Oi619-VASP) se regularon positivamente. Además, encontraron que estas tres, así como otras seis proteínas putativas [isoforma 1 de ATPasa A translocadora de protones vasculares / vesícula recubierta de clatrina (Oi6113-V-ATPasa recubierta de clatrina), proteína farnesilada peroxisomal (Oi411-PfX), α-catenina, cadherina (Oi812-α-catenina), ATPasa transportadora de cobre (Oi212-Cu2 + ATPasa), proteína rica en glicina (Oi814-GRP) y proteína Dreg-2 (Oi616-Dreg-2)] se regularon negativamente en el intestino medio de la garrapata. Las proteínas identificadas en este estudio podrían estar implicadas en la invasión celular y la respuesta al estrés del huésped [149]. Curiosamente, en un estudio posterior que examinó la expresión diferencial de factores derivados de garrapatas de tipo inmunitario putativos en D. variabilis cuando está infectado por R. montanensis o R. amblyommii, se encontró que la exposición a rickettsias regulaba negativamente la expresión de la S-transferasa 1 (dvgst1) y el inhibidor de la proteasa de Kunitz (dvkpi) en el intestino medio. Esto sugiere que la infección por rickettsias del intestino medio podría implicar la regulación a la baja de las moléculas inmunes de la garrapata [150]. La respuesta inmune y al estrés de las garrapatas a la infección por rickettsias ha sido evaluada en otros estudios, encontrando proteínas como la macroglobulina α-2 y la ferritina que están involucradas en la inhibición de exo-proteasas de parásitos y la reducción del daño celular, respectivamente [151, 152]. .

A pesar de la abundancia bien descrita de datos sobre proteínas implicadas en la mediación de la infección por rickettsias en garrapatas y su posterior transmisión, es difícil predecir qué proteínas son las más adecuadas como dianas para las vacunas que bloquean la transmisión y se carece de pruebas experimentales que utilicen huéspedes inmunizados. Además, diferentes Rickettsia Se demostró que las especies provocan una respuesta diferente en su huésped garrapata [142, 143] y hay mucho que aprender sobre la interacción entre R. helvetica y R. monacensis con Ricinus garrapatas. Rickettsia helvetica se ha asociado con enfermedades, pero el alcance de su patogenicidad todavía se está estudiando y debatiendo [153, 154]. Invasión celular por R. monacensis parece ser similar a la de otras rickettsias SFG patógenas [146, 155]. A diferencia de, R. helvetica mostró secuencias de aminoácidos interrumpidas o truncadas en genes que codifican proteínas involucradas en la invasión celular en SFG Rickettsia y la microscopía de barrido láser confocal reveló que las bacterias se propagan por descomposición celular en lugar de propagación de célula a célula [154]. Esto podría significar que los antígenos que se dirigen a las proteínas que se encuentran en los estudios descritos anteriormente podrían no ser útiles para la interrupción de R. helvetica colonización y transmisión por la garrapata huésped. A la luz de las aparentes similitudes entre R. helvetica y no patógeno Rickettsia especies, su alta prevalencia en las poblaciones de garrapatas y la transmisión vertical efectiva [156], su efecto sobre la aptitud de las garrapatas deben evaluarse. En las últimas dos décadas, ha surgido una gran cantidad de información sobre la relación entre los artrópodos y sus endosimbiontes, cada vez más compleja con el uso de nuevas tecnologías de alto rendimiento que permiten el análisis de microbiomas [157, 158]. Las relaciones mutualistas garrapatas-endosimbiontes se han descrito para Coxiella, Francisella y Rickettsia, y se ha demostrado que afectan la fertilidad de las garrapatas, la aptitud general y posiblemente incluso la capacidad vectorial [157, 159]. Si tales efectos se encontraran entre Ricinus garrapatas y R. helvetica, la interferencia de los procesos subyacentes involucrados podría explotarse para afectar Ricinus aptitud y / o transmisión de patógenos. Estos hallazgos resaltan aún más la importancia del examen de los mecanismos específicos involucrados en R. monacensis-I. ricino y R. helvetica-I. ricino interacciones.


Exosomas en la comunicación tumor-leucocitos

Uno de los sellos distintivos del cáncer es la capacidad de las células tumorales para emplear diferentes estrategias para evadir la vigilancia inmunológica del huésped (Hanahan y Weinberg, 2011). La evidencia contemporánea apunta hacia un papel central de los exosomas derivados de tumores en la modulación de la respuesta inmune e influir en el desarrollo del cáncer al mediar en el diálogo entre las células inmunes y cancerosas (Czernek y D & # x000FCchler, 2016). De hecho, se ha demostrado que los exosomas derivados de tumores secuestran el programa de vigilancia inmunológica del huésped al amplificar las señales derivadas del tumor, incluidas las implicadas en la inflamación y, en ciertos casos, la tumorigénesis (Grivennikov et al., 2010 Cavallo et al., 2011) y escape de células tumorales del sistema inmunológico (Wieckowski et al., 2009 Whiteside, 2013).

También se sabe que los exosomas derivados de tumores no solo son actores clave en la edición inmune del nicho del tumor primario, sino también en los nichos premetastásicos y metastásicos, ya que pueden burlar a los actores estromales e inmunes para superar la respuesta inmune (Hanahan y Weinberg, 2011), fomentando la configuración de microambientes pro-metastásicos (Syn et al., 2016). En esta sección, analizaremos cómo los exosomas pueden mediar en la comunicación célula-célula entre los componentes celulares del sistema inmunológico y las células tumorales y desempeñar un papel en la biología tumoral (Figura 2).

Figura 2. El papel de los exosomas en la comunicación entre el tumor y las células madre / inmunitarias. Los exosomas desempeñan un papel clave en la interacción entre el tumor y las células inmunes / madre, incluidos los macrófagos (M & # x003A6), las células asesinas naturales (NK), los neutrófilos, las células dendríticas (DC), las células B y T, las células supresoras derivadas de mieloides ( MDSC) y células madre mesenquimales (MSC), que contribuyen a la configuración de respuestas pro (flechas rojas) y antitumogénicas (flechas verdes).

Funciones de los exosomas en la polarización de macrófagos y neutrófilos

Todos los tipos de células inmunes son potencialmente sensibles a los efectos de inmunomodulación de exosomas derivados de tumores. Sin embargo, los exosomas pueden inducir diferentes niveles de modificación en cada una de estas células, como es el caso de los macrófagos. Los macrófagos activados, por ejemplo, muestran una plasticidad fenotípica notable de acuerdo con las señales ambientales, y generalmente se dividen en un continuo de estados funcionalmente polarizados M1 y M2. En general, con base en la polarización Th1 / Th2, los macrófagos M1 son proinflamatorios y tumoricidas (clásicamente activados), mientras que M2 son antiinflamatorios y apoyan el tumor (alternativamente activados) (Martinez et al., 2008 Gautier et al., 2012 Xue et al., 2014 You et al., 2015). En un microambiente tumoral, los macrófagos pueden ser educados en macrófagos asociados a tumores (TAM) que muestran características M2, promoviendo la angiogénesis y liberando factores de crecimiento pro-tumorigénicos, quimiocinas y citocinas (Mantovani et al., 2004 Rogers y Holen, 2011 Quatromoni y Eruslanov, 2012 Schiavoni et al., 2013). En este contexto, se ha demostrado que los exosomas derivados de tumores desempeñan un papel clave en el estado de polarización de los macrófagos. Por ejemplo, los exosomas derivados del cáncer colorrectal inducen fenotipos de macrófagos pro-tumorigénicos mediante el uso de proteínas centradas en el citoesqueleto como unidades funcionales. De hecho, el reordenamiento del citoesqueleto es una característica primordial de la activación y maduración de los macrófagos (Chen Z. et al., 2016). Otro ejemplo involucra el cáncer de ovario epitelial, donde los exosomas que contienen miR222-3p indujeron un cambio en el estado de activación de los macrófagos hacia una polarización M2, en un proceso mediado por la regulación a la baja de la vía SOCS3 / STAT3 (Ying et al., 2016). Además, se observó que los exosomas ricos en miR-25-3p- y miR-92a-3p de líneas celulares de liposarcoma humano inducen la secreción de IL-6 por TAM, lo que conduce a un aumento en la proliferación celular del liposarcoma (Casadei et al., 2017). En la leucemia linfocítica crónica (LLC), se demostró que los exosomas derivados de tumores que contienen ARN Y no codificante hY4 inducen fenotipos asociados a la LLC en los monocitos receptores, incluida la liberación de citocinas, como el ligando 2 de quimiocina del motivo CC (CCL2), CCL4 e IL -6, y la expresión de PD-L1, lo que sugiere un posible mecanismo de escape inmunológico basado en exosomas (Haderk et al., 2017). Además de modular la polarización de los macrófagos, se demostró que los exosomas derivados de tumores influyen en la migración de los macrófagos. Por ejemplo, Bandari et al. mostró en un informe reciente que cuando se exponen a agentes antitumorales comúnmente utilizados, como Bortezomib, Carfilzomib o Melphalan, las células de mieloma producen exosomas ricos en Heparanasa que inducen la migración y la secreción de TNF - & # x003B1 por los macrófagos (Bandari et al., 2018).

Los exosomas derivados de tumores se relacionan con frecuencia con la activación de NF - & # x003BAB en macrófagos y la promoción de microambientes pro-tumorigénicos. Por ejemplo, se demostró que los exosomas derivados del cáncer gástrico inducen la activación de NF - & # x003BAB en macrófagos, lo que lleva a un aumento en la expresión de factores proinflamatorios como IL-6 y TNF - & # x003B1, lo que a su vez promueve la proliferación. de células de cáncer gástrico (Wu et al., 2016). Chow et al. Obtuvieron observaciones similares, quienes demostraron que los exosomas derivados del cáncer de mama también estimulan la vía NF - & # x003BAB en los macrófagos, lo que conduce a la secreción de las citocinas proinflamatorias IL-6, TNF - & # x003B1, GCSF y CCL2 (Chow et al., 2014). Otro ejemplo implica exosomas derivados de tumores de pulmón que contienen miR-21 y miR-29a. Se demostró que estos exosomas se unen al receptor tipo Toll (TLR) 7 y TLR8, lo que lleva a la activación de NF - & # x003BAB y la secreción de las citocinas inflamatorias pro-metastásicas TNF - & # x003B1 e IL-6. A su vez, se demostró que estas citocinas inducen la formación de un microambiente pulmonar que apoya la carga metastásica pulmonar (Fabbri et al., 2012).

También se sabe que los TAM inducen respuestas inflamatorias, desempeñando un papel clave en la configuración de microambientes tumorales que apoyan la formación y progresión de metástasis. Por ejemplo, una vez absorbidos por los macrófagos residentes en el hígado, en un mecanismo mediado por la integrina exosómica & # x003B1V & # x003B25 (Hoshino et al., 2015), exosomas derivados del cáncer de páncreas que contienen altos niveles de factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) (Costa -Silva et al., 2015) indujeron la regulación positiva de factores secretados asociados con la fibrosis hepática, como TGF & # x003B2 (Costa-Silva et al., 2015), y genes proinflamatorios involucrados con metástasis, como S100A8 y S100P (Lukanidin y Sleeman, 2012 Hoshino et al., 2015). En respuesta a este microambiente inflamatorio, las células estrelladas hepáticas cambian a un estado activado marcado por la regulación positiva de la expresión de fibronectina. Este microambiente rico en fibronectina promueve la acumulación de macrófagos derivados de la médula ósea y la formación de un microambiente premetastásico que apoya la metástasis hepática (Costa-Silva et al., 2015).

Además de mediar las respuestas inmunitarias, los macrófagos también pueden modular la biodistribución de exosomas derivados de tumores. Los macrófagos CD169 & # 43 del seno subcapsular, por ejemplo, forman una capa física que bloquea los exosomas derivados de tumores y la diseminación # x00027 en el bazo y los ganglios linfáticos (Saunderson et al., 2014). De acuerdo con esto, la alta densidad de macrófagos CD169 & # 43 en los ganglios linfáticos se correlaciona positivamente con una supervivencia general más larga en pacientes con carcinoma colorrectal (Ohnishi et al., 2013). Pucci et al., Sin embargo, demostraron que esta barrera de macrófagos puede ser interrumpida por exosomas derivados del melanoma, permitiendo la entrada de estos exosomas en la corteza de los ganglios linfáticos, donde interactúan con las células B y fomentan la progresión tumoral al inducir la producción de autoanticuerpos (Pucci et al. al., 2016).

Los exosomas derivados de tumores no son los únicos participantes en la comunicación entre el tumor y los macrófagos, ya que los exosomas derivados de los macrófagos también pueden ejercer efectos en la biología de las células tumorales. Por ejemplo, los exosomas derivados de los macrófagos pueden inducir la invasión tumoral al transferir Wnt5a de los macrófagos a las células cancerosas, lo que lleva a la activación de la vía de señalización de Wnt & # x003B2-catenina independiente, en un proceso que define una nueva estrategia de invasión maligna por la mama. cáncer (Menck et al., 2013). Además, se demostró que los exosomas derivados de TAM modulan la quimiorresistencia. De hecho, Zheng et al. mostró que los exosomas producidos por TAM que contienen miR-21 podrían conferir resistencia al cisplatino a las células de cáncer gástrico, en un proceso mediado por la regulación a la baja de PTEN (Zheng et al., 2017). Wu y sus colegas destacaron el papel relevante de los exosomas en el microambiente del tumor, desentrañando una capa adicional de complejidad en la red de comunicación tumor-huésped. En este trabajo, se demostró que los exosomas derivados de TAM podrían suprimir la migración de células endoteliales al dirigirse a la vía miR-146b-5p / TRAF6 / NF-kB / MMP2. Curiosamente, los exosomas derivados del cáncer de ovario pudieron revertir este efecto inhibidor mediante la transferencia de lncRNA (Wu et al., 2017).

Los neutrófilos también se conocen como mediadores clave de la respuesta inmune innata, ya que son esenciales para proteger al huésped contra la infección y para apoyar la reparación de tejidos (Mayadas et al., 2014). Al igual que los macrófagos, los neutrófilos también muestran plasticidad fenotípica, que está influenciada por diferentes señales derivadas de tumores y que pueden ejercer efectos pro o antitumorales. De hecho, los tumores pueden manipular los neutrófilos al principio de su proceso de diferenciación, creando un repertorio diverso de estados de polarización funcional (Fridlender et al., 2009 Coffelt et al., 2016). En este contexto, se ha demostrado que los exosomas son mediadores emergentes de las interacciones tumor-neutrófilos. Por ejemplo, los exosomas derivados del cáncer de mama pueden promover el crecimiento tumoral al inducir el reclutamiento de neutrófilos derivados de la médula ósea en los sitios del tumor (Bobrie et al., 2012). Además, los neutrófilos han surgido como mediadores cruciales en el desarrollo del nicho premetastásico (Wculek y Malanchi, 2015), ya que los ARN exosomales derivados del cáncer de mama pueden activar el TLR3 del estroma del huésped, induciendo el reclutamiento de neutrófilos, que es fundamental para la configuración de la premetastásico. nichos (Kenific et al., 2016 Liu et al., 2016).

Exosomas & # x00027 Papel en la supresión de asesinos naturales & # x00027 Respuesta citolítica

Las células asesinas naturales (NK) son otro componente importante del sistema inmunológico, ya que estas células linfoides innatas pueden ensamblar una actividad citotóxica rápida (& # x0201Cready to kill & # x0201D), lo que les permite controlar las infecciones microbianas y la progresión tumoral en un proceso. regulado por un equilibrio de señales activadoras e inhibidoras (Morvan y Lanier, 2015). Diferentes informes afirman que la citotoxicidad de las células NK está significativamente alterada en entornos oncológicos, en parte debido al efecto inmunosupresor de los exosomas derivados de tumores. Este efecto inmunosupresor se ha asociado con una expresión alterada de los receptores de superficie que activan las células NK. Por ejemplo, se demostró que los exosomas derivados del plasma de pacientes con leucemia mielógena aguda (LMA), que contienen CD33, CD34, CD117, MICA / MICB y TGF - & # x003B2, disminuyen la actividad citotóxica de las células NK, en un proceso que involucra la fosforilación de Smad. y regulación a la baja del receptor NKG2D en células NK (Szczepanski et al., 2011 Whiteside, 2013), que fue reversible por IL-15 (Szczepanski et al., 2011). Otro ejemplo involucra el trabajo de Berchem et al., Quienes demostraron que los exosomas derivados de tumores producidos por células hipóxicas son cualitativamente diferentes de sus contrapartes normóxicas. Usando varios modelos de tumores, revelaron que los exosomas derivados de tumores hipóxicos eran capaces de regular negativamente las funciones de las células NK, en un mecanismo también mediado por la transferencia de TGF - & # x003B21 y la disminución de los niveles de NKG2D en las células NK. Los autores también describieron miR-23a y TGF - & # x003B2 como un factor inmunosupresor transferido a las células NK que se dirige directamente a la expresión de CD107a, lo que conduce a una disminución de las respuestas antitumorales (Berchem et al., 2016). De hecho, en presencia de exosomas derivados de tumores, NKG2D es uno de los receptores NK más profundamente afectados, que tienen las cadenas A (MICA) y B (MICB) relacionadas con el MHC de clase I como ligandos cruciales para su inducción (Mincheva-Nilsson y Baranov, 2014). Por consiguiente, Groh et al. mostró que los pacientes con cáncer exhiben una disminución de la expresión de la superficie de NKG2D en las células NK circulantes en comparación con los individuos sanos (Groh et al., 2002). Además, Ashiru et al. demostraron que el desprendimiento del alelo MICA expresado con más frecuencia en poblaciones humanas, MICA * 008, en exosomas derivados de tumores induce la regulación negativa de NKG2D en la superficie celular NK & # x00027s, lo que conduce a una función citotóxica deteriorada (Ashiru et al., 2010 ). Además, un estudio reciente mostró que los exosomas derivados de tumores de próstata con ligandos NKG2D inducen selectivamente una regulación a la baja dependiente de la dosis de la superficie celular NKG2D tanto en las células NK como en las células T CD8 & # 43, lo que conduce a una función citotóxica alterada de ambos tipos de células inmunes (Lundholm et al. al., 2014). También se demostró que los exomas derivados de tumores que llevan ligandos NKG2D (como MIC-A / B y ULBP 1 y 2) actúan como señuelos, alterando la citotoxicidad de las células NK mediada por NKG2D y facilitando la evasión inmunitaria de las células de leucemia / linfoma (Hedlund et al. al., 2011).

Un mecanismo adicional de evasión inmune fue descrito por Liu et al., Quienes demostraron que los exosomas derivados de la mama murina eran capaces de inhibir la proliferación de células NK estimuladas por IL-2 y bloquear la activación de células NK mediada por IL-2, aboliendo así su citotóxico. respuesta a las células tumorales (Liu et al., 2006). Además, también se encontró que los exosomas derivados de tumores que contienen ligandos del receptor de la muerte, como FasL, en su membrana inducen la apoptosis de las células NK, de manera similar a lo que sucede con las células T (Andreola et al., 2002 Saito et al., 2013 ). Por otro lado, se ha descrito que los fármacos contra el cáncer inducen a las células de carcinoma hepatocelular quimiorresistentes a liberar exosomas que provocan respuestas de células NK antitumorales, en un mecanismo mediado por proteínas exosómicas de choque térmico (Lv et al., 2012).Al igual que en otros entornos de comunicación entre células inmunitarias tumorales, también se ha demostrado que las células NK influyen en la biología de las células tumorales a través de la producción de exosomas. Se ilustró en un trabajo reciente de Zhu et al., Que muestra que los exosomas derivados de células NK pueden inducir efectos citotóxicos en células de melanoma. in vitro, lo que representa una estrategia antitumoral potencialmente nueva (Zhu et al., 2017).

Papel de los exosomas en el deterioro de la respuesta de linfocitos citotóxicos (CTL) y la inducción de tolerancia inmunitaria / células reguladoras inmunitarias

La pieza central de la inmunidad antitumoral es la respuesta eficaz de las células T CD4 & # 43 y CD8 & # 43. En este contexto, los exosomas derivados de tumores también se han descrito como potentes mediadores de la proliferación, activación y apoptosis de estas células, lo que permite la evasión tumoral de la vigilancia inmunitaria. Por ejemplo, se ha demostrado que la muerte de las células T es inducida por exosomas derivados de tumores a través de vías apoptóticas tanto extrínsecas como intrínsecas. De hecho, la inducción de la apoptosis de las células T por exosomas derivados de tumores se produce a través de vías mediadas por receptores que involucran Fas Ligand (FasL), TRAIL y PDL-1 (Abusamra et al., 2005 Kim et al., 2005 Wieckowski et al., 2009). Además, Abusamra et al. demostraron que los exosomas derivados del cáncer de próstata que expresan FasL desencadenan la apoptosis de células T de una manera dependiente de la dosis (Abusamra et al., 2005). En otro ejemplo, se demostró que los exosomas derivados del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello inducen la apoptosis de las células T CD8 y # 43 activadas a través de la escisión de la caspasa 3, la liberación de citocromo C mitocondrial, la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, la fragmentación del ADN y los cambios tempranos de la membrana, incluida la anexina. Unión V (Czystowska et al., 2011). La vía PI3K / AKT también está dirigida por exosomas en células T CD8 y # 43 activadas, ya que se demostró que los exosomas derivados de tumores causan la desfosforilación de Akt de una manera dependiente del tiempo, lo que conduce a la regulación a la baja de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-xL y Mcl-1 y regulación positiva de la proteína proapoptótica Bax (Czystowska et al., 2009, 2011). Además, la producción de exosomas derivados de tumores que contienen MICA / B y FasL está asociada con el deterioro de los efectos de la inmunidad tanto innata como adaptativa (Abusamra et al., 2005 Lundholm et al., 2014). Por lo tanto, se ha sugerido que dichos exosomas pueden modular las funciones de los linfocitos imitando & # x0201Muerte celular inducida por activación & # x0201D (AICD) (Blanchard et al., 2002 Perone et al., 2006 Taylor y Gercel-taylor, 2011) . Otro ejemplo involucra los exosomas derivados del melanoma, que se demostró que suprimen la proliferación y la viabilidad de las células T CD8 & # 43 al administrar PTPN11 (proteína y ARNm) (Wu et al., 2017). Además, los exosomas derivados del carcinoma nasofaríngeo humano pueden inhibir la proliferación y diferenciación de células T en células Th1 y Th17, promoviendo la generación de células T reguladoras (Treg), disminuyendo la fosforilación de ERK, STAT1 y STAT3 y aumentando la fosforilación de STAT5 en las células T receptoras. Estos exosomas derivados de tumores también aumentaron la secreción de las citocinas proinflamatorias IL-1 & # x003B2, IL-6 e IL-10, y disminuyeron la liberación de IFN & # x003B3, IL-2 e IL-17, ambos en Células T CD4 & # 43 y CD8 & # 43. Se exploró más a fondo el contenido de exosomas de sueros de pacientes y líneas celulares de carcinoma nasofaríngeo, demostrando estar enriquecidos en miR-24-3p, & # x02212891a, & # x02212106a-5p, & # x0221220a-5p y & # x022121908. El mismo trabajo mostró que estos grupos de miARN regulan negativamente la vía de señalización MARK1, lo que afecta la proliferación y diferenciación de las células T (Ye et al., 2014).

La falta de respuesta de las células T CD8 & # 43 también se puede lograr dañando la vía de señalización del TCR (receptor de células T), que median las interacciones del péptido TCR & # x02013MHC & # x02013 y la activación de las células T, en un mecanismo que involucra la transferencia de la cadena CD3 & # x003B6 de las señales de activación. al núcleo. Soderberg y col. demostraron que los exosomas derivados del melanoma transfieren TNF - & # x003B1 a células T CD4 & # 43 y CD8 & # 43, lo que afecta al complejo TCR & # x02013CD3 y provoca la alteración de las células T (Soderberg et al., 2007). De acuerdo, varios estudios también informaron que los exosomas derivados de tumores de pacientes con cáncer median la inhibición de la expresión de la cadena CD3 & # x003B6 en las células T, lo que afecta la activación de las células T (Taylor et al., 2003 Kim et al., 2005 Taylor y Gercel-taylor, 2011).

Otro paso crítico en la respuesta inmune antitumoral son las células T CD4 & # 43 y CD8 & # 43 que se dirigen al sitio del tumor primario (Taylor et al., 2003 Kim et al., 2005 Taylor y Gercel-taylor, 2011) . Lee y col. demostraron que al eliminar ICAM1 en la membrana de sus exosomas, las células cancerosas previenen la interacción entre linfocitos y células endoteliales, disminuyendo así el reclutamiento de células inmunes adaptativas (Lee et al., 2010).

Además de la alteración de las respuestas de los CTL, otro mecanismo presente en las células tumorales que promueve el escape de la vigilancia inmunitaria implica la interferencia en el proceso de diferenciación de las células inmunitarias na & # x000EFve hacia un fenotipo inmunosupresor. Por ejemplo, los exosomas derivados de tumores son capaces de inducir la expansión de las células Treg CD4 & # 43 CD25 & # 43 Foxp3 & # 43 y su actividad supresora, y de desencadenar la apoptosis de las células T CD8 & # 43 (Wieckowski et al., 2009) . Además, se informó que los exosomas producidos por varios tipos de tumores humanos y murinos transfieren miR214 a las células T CD4 y # 43 periféricas, estimulando la evasión inmune al regular negativamente el PTEN y promoviendo la expansión de Treg (Yin et al., 2014).

En un estudio reciente, Muller et al. demostraron que los exosomas derivados de tumores también pueden inducir la regulación diferencial de genes clave relacionados con la función inmunitaria en CD4 & # 43 T, CD8 & # 43 T y Treg convencionales. En las células T CD4 & # 43, por ejemplo, los genes inhibidores fueron regulados positivamente por exosomas derivados de tumores, lo que condujo a una pérdida de CD69 en su superficie y una disminución funcional de estas células. Por otro lado, los exosomas indujeron la expresión de CD39 y la producción de adenosina en Treg, mientras que regulaban a la baja los niveles de expresión de ARNm de los genes involucrados en el control de las vías inmunosupresoras (Muller et al., 2016). Colectivamente, al explotar diversos mecanismos que actúan en concierto, los exosomas derivados de tumores contribuyen a un entorno inmunosupresor y tolerancia periférica, que desempeñan un papel fundamental en el crecimiento y la progresión del tumor.

Papel de los exosomas en la diferenciación y maduración de los países en desarrollo

Las células dendríticas (CD) son meditadores versátiles del sistema inmunológico, formando una red notable que da forma a la inmunidad innata y adaptativa, de acuerdo con las señales periféricas (Merad et al., 2013). La importancia de las CD está asociada con su función como células presentadoras de antígenos (APC) profesionales, ya que son capaces de realizar la presentación de antígenos y el inicio de la respuesta de las células T primarias, incluidas las que con frecuencia se dirigen contra las células tumorales (Liu et al., 2017).

La presencia de exosomas derivados de tumores durante la generación de CD se asoció con una baja expresión de moléculas coestimuladoras y producción de citocinas inhibidoras por estas células, en un proceso seguido de supresión de la proliferación de células T y citotoxicidad antitumoral (Valenti et al. ., 2006). Además, se demostró que los exosomas derivados de tumores captados por las CD inmaduras inhiben el proceso de maduración de estas células (Yang et al., 2011).

La capacidad de reconocimiento de antígenos de las CD también puede ser modulada por exosomas derivados de tumores, que afectan la expresión de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en las CD. Los exosomas derivados del cáncer de páncreas, por ejemplo, pueden regular negativamente la expresión de TLR4 (a través de miR-203) en las CD, induciendo la producción de TNF - & # x003B1 e IL-12 e inhibiendo las respuestas antitumorales mediadas por las CD desencadenadas por TLR4 (Zhou M .et al., 2014). En resumen, un número creciente de informes ha mostrado que los exosomas derivados de tumores también pueden mediar en la inmunosupresión del huésped modulando la diferenciación, maduración y función de las CD.

Papel de los exosomas en las células B

Las células B son actores importantes en la modulación de la respuesta inmune inducida por tumores, siendo los segundos linfocitos infiltrantes de tumores más abundantes (Yuen et al., 2016). En 1996, Raposo et al. informaron por primera vez que los linfocitos B secretan exosomas, y que estas partículas contienen MHC de clase II capaz de realizar la presentación de antígenos e inducir respuestas de células T CD4 & # 43 específicas de antígeno (Raposo et al., 1996). Además de los diversos informes de producción de exosomas por las células B, y de los posibles roles de estas partículas en el sistema inmunológico (Escola et al., 1998 Clayton et al., 2005 Rialland et al., 2006 Buschow et al., 2010 ), también se informó que estas células están influenciadas por exosomas derivados de tumores. De hecho, los exosomas derivados del cáncer de esófago que contienen HSP90 pueden influir en las células B na & # x000EFve para que se conviertan en un fenotipo regulador inmunosupresor que exprese TGF - & # x003B2 (Li Y. et al., 2015). Además, se demostró que las células de melanoma y linfoma liberan exosomas que inducen la producción de IL-10 en las células B esplénicas. A su vez, la IL-10 promueve la generación de células B reguladoras que inhiben la actividad de las células T (Yang et al., 2012), lo que sugiere un nuevo mecanismo de inducción de células B inhibidoras basado en rutas impulsadas por exosomas.

Participación de los exosomas en la estimulación de la inmunidad contra el cáncer

Se sabe que los exosomas producidos por las células cancerosas inducen predominantemente la inmunosupresión y apoyan la tumorigénesis. Sin embargo, varios informes muestran que estas nanopartículas también son capaces de estimular la inmunidad (Reiners et al., 2014 Czernek y D & # x000FCchler, 2016 Liu et al., 2017 Yoshimura et al., 2017). Este doble papel de los exosomas derivados de tumores se debe principalmente a su capacidad para expresar antígenos asociados a tumores. Además, los exosomas se consideran fuentes ideales de antígenos para la educación de APC, especialmente debido a su fácil recolección de la circulación periférica mediante el uso de métodos no invasivos. De hecho, los primeros informes mostraron que los antígenos en los exosomas derivados de tumores pueden transferirse a las CD e inducir respuestas inmunitarias antitumorales específicas (Andre et al., 2002 Robbins y Morelli, 2014). Por ejemplo, las CD pulsadas con exosomas derivados de células de carcinoma hepatocelular (HCC) condujeron a un aumento en los niveles de IFN & # x003B3 y células T CD8 & # 43, y en la reducción de los niveles de IL10 y TGF - & # x003B2 en ratones portadores de HCC ( Rao et al., 2016). Otro ejemplo involucra las células cancerosas tratadas con agentes antitumorales, que pueden liberar exosomas que contienen ADN capaces de activar las CD a través de la vía dependiente de STING y reforzar la inmunidad antitumoral (Kitai et al., 2017).

Además, los exosomas derivados de tumores pueden mejorar la inmunidad antitumoral mediante la transferencia de citocinas o proteínas de choque térmico (Liu et al., 2017). De hecho, HSP60 y HSP90 son abundantes en exosomas derivados de células de linfoma B de ratón sometidas a choque térmico, estando estos exosomas asociados con un aumento de las respuestas inmunitarias antitumorales de las células T (Chen et al., 2006). De acuerdo con estos hallazgos, los exosomas HSP70 / Bag-4 & # 43 derivados de tumores estimulan la actividad de las células NK, induciendo la liberación de granzima B y la apoptosis de las células de cáncer de páncreas (Gastpar et al., 2005). Sobre la base de estos efectos antitumorales generados por los exosomas derivados de tumores, varias líneas de investigación se han centrado en el desarrollo de vacunas tumorales basadas en exosomas. Las estrategias comunes implican la modificación genética de las células productoras de exosomas para modificar el contenido de exosomas, incluyendo IL2 (Yang et al., 2007) e IL18 (Dai et al., 2008) y mejorar la inmunogenicidad impulsada por exosomas. Además, otras estrategias se basan en estimular la liberación de exosomas que actúan sobre la toxicidad de las células NK al estresar las células tumorales con, por ejemplo, fármacos anticancerosos (Lv et al., 2012).

La capacidad de inducir una inmunidad eficaz no se limita a los exosomas derivados de tumores, ya que las células inmunitarias también pueden liberar exosomas capaces de actuar sobre el sistema inmunitario y provocar respuestas antitumorales. Los exosomas derivados de DC, por ejemplo, pueden actuar como partículas presentadoras de antígeno (Zitvogel et al., 1998) y estimular linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno. en vivo (Raposo et al., 1996 Zitvogel et al., 1998). Además, se demostró que los exosomas derivados de DC que contienen ICAM-1 y los exosomas derivados de células B que contienen moléculas MHC de clase I y II, moléculas coestimuladoras (CD80 y CD86) e ICAM-1 promueven la función de presentación de antígenos en las células inmunitarias del receptor. (Clayton et al., 2001 Th & # x000E9ry et al., 2001 Andr & # x000E9 et al., 2004 Segura et al., 2005). Estos exosomas pueden modular las respuestas inmunitarias ya sea directamente, al exponer estas moléculas, o indirectamente, al transportar componentes internos a las células circundantes. Tomando los efectos mencionados anteriormente, los exosomas derivados de DC representan una estrategia importante para suprimir el crecimiento tumoral a través de nuevos enfoques de vacunación sin células (Tian y Li, 2017).

Hasta la fecha, la inmunoterapia celular basada en CD ha presentado varias limitaciones, como fluctuaciones en la composición molecular de las CD, desafíos en la definición de su composición, bajos niveles de expresión en la membrana de los complejos péptido-MHC-II, presencia de citocinas inmunosupresoras capaces de convertir las CD en estado tolerogénico, obstáculos para almacenar CD vivas y problemas relacionados con la gestión de la estabilidad durante períodos más largos (Palucka y Banchereau, 2012 Pitt et al., 2016). En comparación con los protocolos de inmunoterapia celular basados ​​en DC, las estrategias basadas en exosomas de DC presentan ventajas significativas, ya que los exosomas tienen una composición molecular mejor definida para cada paciente, niveles más altos de complejos de péptido & # x02013MHC-II y mayor estabilidad de almacenamiento debido a su composición de lípidos ( Pitt et al., 2016 Yoshimura et al., 2017). Aunque todavía se necesitan más estudios, se han logrado avances importantes en las aplicaciones clínicas de las vacunas basadas en exosomas de DC. De hecho, los pacientes con neoplasias malignas avanzadas, incluidos aquellos con cáncer de pulmón de células no pequeñas (Morse et al., 2005 Besse et al., 2016), melanoma metastásico (Escudier et al., 2005) y cáncer colorrectal (Dai et al., 2008), que fueron vacunados con exosomas derivados de DC mostraron activación de respuestas inmunes basadas en células T y NK. Además, se han completado dos ensayos clínicos de fase I (Escudier et al., 2005 Morse et al., 2005) y un ensayo clínico de fase II (Besse et al., 2016) utilizando exosomas derivados de DC, lo que demuestra la viabilidad y seguridad de Este enfoque.


Información del autor

Afiliaciones

Escuela de Estudios en Biotecnología, Universidad de Jiwaji, Gwalior, 474001, MP, India

Zakir Khan, Godavarthi B. K. S. Prasad & amp Prakash Singh Bisen

Departamento de Ciencias Biomédicas, Departamento de Patología, Centro Médico Cedars-Sinai, Los Ángeles, CA, 90048, EE. UU.

Departamento de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad King Saud, Riyadh, Arabia Saudita

Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.


Conclusiones

Las principales actividades de E5 se pueden reanudar de la siguiente manera:

Aunque E6 y E7 proporcionan las principales actividades transformadoras de los HPV HR, E5 puede aumentar su función y contribuir a la progresión del tumor:

Cuando se expresa solo, HPV E5 tiene una actividad transformadora débil.

En modelos de ratones transgénicos, la expresión de 16E5 en la piel produce hiperproliferación epitelial con formación espontánea de tumores, mientras que en ratones tratados con estrógenos, la expresión de E5 solo puede inducir cánceres [182], lo que sugiere un papel de E5 como una verdadera oncoproteína.

La presencia de episomas virales en tumores cervicales positivos para VPH 16 además de integrantes virales conduce a la hipótesis de que existen múltiples vías para la tumorigénesis inducida por VPH (véase más arriba). Además de la hipótesis básica de expresión de alto nivel de E6 y E7 como consecuencia de la abrogación de los efectos represivos de E2 debido a la pérdida del gen E2 durante la integración, otra vía puede estar activa en células que aún mantienen episomas virales, en la que E5 aumentaría la actividad de E6 y E7. La expresión de E5 aumenta con la diferenciación para promover la proliferación de células diferenciadas y la replicación viral productiva.

La localización del VPH E5 en el retículo endoplásmico sugiere que su actividad puede estar relacionada con el tráfico de proteínas de la membrana citoplasmática a través de este compartimento celular, en particular de los receptores del factor de crecimiento y de las moléculas implicadas en el control inmunológico.

Existen múltiples objetivos de unión intracelular documentados para 16E5, como el miembro de la familia del receptor EGF ErbB4 [77], la subunidad de 16 kDa de la H + -ATPasa vacuolar [39, 55], la cadena pesada del HLA tipo I [104], calnexina [51], el transportador de zinc ZnT-1, las proteínas de tipo canal transmembrana EVER1 y EVER2 [115, 117] el miembro de la familia de receptores de importación nuclear KNβ3 [45], BAP31 y A4 [44, 52] (Figura 2).

Sin embargo, el papel de 16E5 en la carcinogénesis parece estar limitado a las primeras etapas de la carcinogénesis cervical porque el gen E5 se elimina con frecuencia cuando el genoma del VPH se integra durante la progresión maligna [28, 68, 183]. No obstante, la expresión de 16E5 detectada por inmunohistoquímica se informó en aproximadamente el 80, 90 y 60% de las LSIL infectadas por el VPH 16, las SIL de alto grado y los carcinomas de cuello uterino, respectivamente [28]. Además, se presentaron datos de un número limitado de pacientes en el 1er Taller Internacional sobre Oncogén E5 [184], lo que sugiere que la expresión de E5 puede conducir a una peor respuesta al tratamiento con taxanos (Venuti, datos no publicados). Por lo tanto, dirigirse a E5, que se expresa con frecuencia en las primeras etapas de la transformación maligna, puede ser un enfoque racional para prevenir que las lesiones premalignas progresen a cánceres cervicales invasivos [175]. La reciente erradicación exitosa de tumores inducidos por VPH en ratones mediante vacunación anti-E5 [176] indica que E5 puede usarse en inmunoterapia. La neutralización de E5 o de vías de señalización inducidas por E5, por lo tanto, ya sean inmunológicas o químicas, podría ser ventajosa particularmente en infecciones por VPH y lesiones precancerosas donde no hay tratamientos disponibles.



Comentarios:

  1. Tawfiq

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  3. Chrysostom

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  4. Meztijora

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