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¿Cómo influye la temperatura en la velocidad de degradación de las proteínas?

¿Cómo influye la temperatura en la velocidad de degradación de las proteínas?


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Para fines de modelado por computadora, estoy buscando algunas mediciones cuantitativas referenciadas del efecto (s) de la temperatura en las reacciones bioquímicas.

Pregunta

En particular, mi pregunta es:

¿Cómo influye la temperatura en la velocidad de degradación de las proteínas?

Reduciendo el alcance de mi pregunta

Mi pregunta podría ser demasiado amplia en el sentido de que podría haber demasiada variación en cómo las diferentes proteínas responden a la temperatura para dibujar una tendencia general. Si es así, alguien que esté dispuesto a responder puede reducir la pregunta al factor de transcripción, al factor de transcripción general (GTF) o incluso al TFIIA.


NO estoy buscando ...

No estoy buscando una explicación teórica de cómo la temperatura influye en este proceso (tengo un conocimiento básico de la importancia de la energía de activación como se muestra en una distribución de Maxwell-Boltzman y de la ecuación de Michaelis-Menten).

Busco…

Estoy buscando una función que pueda conectar mis algoritmos para incorporar la influencia de varias temperaturas en el proceso que quiero simular. Quiero simular la red de genes promedio de un eucariota estándar promedio. Para otro propósito, elegí valores de parámetros provenientes de la levadura. Un índice como el Q10 también sería muy útil.

Pregunta similar ya respondida

Se han formulado y respondido preguntas similares aquí y aquí.


Esta es una respuesta general para las tres preguntas relacionadas:

  • Éste
  • ¿Cómo influye la temperatura en la tasa de renovación de proteínas?
  • ¿Cómo influye la temperatura en la tasa de transcripción?

Ya que dijiste:

Quiero simular la evolución de la arquitectura genética cuando después de un cambio brusco de temperatura o en un entorno temporalmente heterogéneo en términos de temperatura

Debería ver este documento. Han estudiado la dependencia de la tasa de crecimiento de la temperatura. Esto se midió para diferentes organismos (todos poiquilotermos).

Vea esta figura:

Figura S1 de Dell et. al 2011. PNAS

La respuesta térmica unimodal de la tasa de crecimiento radial de los hongos del saco (m / (colonia * s)). Las curvas verde y marrón son regresiones OLS al modelo de Boltzmann-Arrhenius (Ec. 1) para el subconjunto de datos que son los componentes de subida y bajada, respectivamente. Estos componentes fueron extraídos por el algoritmo descrito en Materiales y Métodos. Para esta respuesta en particular, el aumento se obtuvo mediante el algoritmo mediante la eliminación de las mediciones a las 4 temperaturas más altas y la caída mediante la eliminación de las mediciones a las 5 temperaturas más bajas. La curva azul es la que mejor se ajusta al modelo de Johnson & Lewin (Métodos SI) (1). Los valores mostrados son energías de activación estimadas con intervalos de confianza del 95% para los componentes de respuesta respectivos. Las flechas verticales punteadas son temperaturas estimadas para Toptar -la temperatura a la que el valor del rasgo es óptimo-calculado a partir del método directo (rojo) y el modelo de Johnson & Lewin (azul). Consulte SI para obtener más detalles. Los datos son de Fargues et al. (9)

Como puede ver, la curva está sesgada. El lado izquierdo de la curva de Toptar sigue el modelo de energía de activación (Arrhenius / Boltzmann). El lado derecho, aunque dicen que en la leyenda de la figura también se ajusta al modelo, me parece que el fenómeno es algo diferente. La pendiente de la curva se debe quizás a la desnaturalización del sitio activo de la enzima y, por lo tanto, a una pérdida de actividad. Para diferentes enzimas, la cinética de desnaturalización variaría.

Me encontré con el autor de este artículo y así fue como me enteré de este trabajo. Parecía estar de acuerdo en que la mitad de la pendiente correcta podría deberse a la desnaturalización de las enzimas.

También eche un vistazo a este artículo que trata sobre la dependencia de la temperatura de la actividad del proteasoma de un termófilo (los mismos principios se aplican a los mesófilos).

Figura 2 del artículo:

Actividad de hidrólisis de Cbz-Ala-Ala-Leu-pNA normalizada de (cuadrados rellenos) purificado nativo y (círculos rellenos) proteasoma Mj recombinante (α + β) purificado por calor a 70 ° C. Para normalizar la actividad recombinante a la actividad nativa se utilizó un multiplicador de 1,92. Las barras de error para la muestra nativa representan una desviación estándar para ensayos por triplicado. Los errores de temperatura medidos fueron ± 2 ° C.

Línea de fondo (De mis comentarios)

Puede asumir que las enzimas están en su nivel óptimo. Puede modelar la pérdida de actividad debido al aumento de temperatura (desnaturalización de proteínas) como gamma / chi cuadrado o función exponencial (o la función ajustada en la cinética de desnaturalización) y el efecto de la baja temperatura utilizando las ecuaciones termodinámicas químicas. Pero el punto es que no sabemos si están en su punto óptimo o no o cómo cada uno de ellos puede funcionar a diferentes temperaturas.


El efecto de la temperatura en las membranas celulares

Investigar la estructura de la membrana, incluido el efecto de la temperatura sobre la permeabilidad de la membrana.

Variable independiente

La temperatura del agua en el baño de agua (grados centígrados)

Variable dependiente

El porcentaje de transmisión de luz a través de la solución resultante.

Variables de control

  • Volumen de agua destilada: se deben usar 10 cm³ de agua destilada para llenar los tubos de ebullición cada vez
  • Tiempo restante en el agua: deje cada tubo de ebullición que contenga remolacha durante 30 minutos.
  • Tamaño de la pieza de remolacha: use una regla y un cuchillo para cortar piezas cilíndricas de remolacha de 1 cm de largo
  • Colorímetro utilizado: se debe utilizar el mismo colorímetro en el mismo ajuste azul / verde cada vez, midiendo el porcentaje de absorbancia. La calibración con agua destilada debe realizarse cada vez
  • Volumen de solución de remolacha: se deben agregar 2 cm³ de solución de remolacha a una cubeta cada vez

¿Por qué utilizar remolacha?

Las células de remolacha contienen pigmentos llamados betalaínas en sus vacuolas. Podemos observar el efecto de la temperatura sobre las membranas celulares de la remolacha al observar la fuga de este pigmento, lo que indica el debilitamiento de la membrana celular. En este caso, las betalaínas se muestran como un color púrpura oscuro.

Diagrama de una celda de remolacha

Equipo

  • Remolacha cruda
  • Taladro de corcho tamaño 4
  • Baldosa blanca
  • Cuchillo
  • Gobernante
  • Cubilete
  • Pinzas
  • Pipeta
  • Baños de agua
  • Tubos de ebullición
  • Termómetros
  • Colorímetro con cubetas
  • Cronógrafo
  • Agua destilada
  • Papel de filtro / tejido

Control

Mantener un trozo de remolacha en 10 cm³ de agua destilada a temperatura ambiente puede proporcionar resultados de control.

Método

  1. Utilice un taladro de corcho y un cuchillo para cortar cilindros de remolacha de 8 x 1 cm de longitud sobre una baldosa blanca.
  2. Coloque todas las piezas cortadas en un vaso de precipitados con agua destilada y déjelas durante la noche para eliminar cualquier tinte (betalaínas) liberado cuando se cortó la remolacha.
  3. Lave y seque (con papel de filtro o un pañuelo) las 8 piezas de remolacha.
  4. Llene 8 tubos de ebullición cada uno con 10 cm³ de agua destilada y colóquelos en 8 baños de agua separados de diferentes temperaturas (p. Ej., 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 40 ° C, 50 ° C, 60 ° C , 70 ° C).
  5. Una vez que esté a la temperatura deseada, agregue un trozo de remolacha a cada tubo de ebullición y déjelo por 30 minutos.
  6. Retire los trozos de remolacha suavemente con un par de pinzas y luego agite los tubos para dispersar el tinte.
  7. Configure un colorímetro en porcentaje de absorbancia en el filtro azul / verde. Calibre llenando una cubeta con agua destilada primero y luego agregue 2 cm³ de solución de remolacha de la primera temperatura a una cubeta nueva.
  8. Coloque esta cubeta en el colorímetro para leer el porcentaje de absorbancia. Repita esto para todas las demás piezas.

Resultados y cálculos de amperios

Para obtener el porcentaje de transmisión de cada solución de remolacha en el colorímetro, podemos utilizar la siguiente ecuación:

Porcentaje de transmisión = 100 - porcentaje de absorbancia

Las grabaciones se pueden anotar en una tabla adecuada, así como en un gráfico.

Conclusión

A medida que aumentaba la temperatura, el porcentaje de transmisión aumentó ligeramente hasta un punto en el que aumentó considerablemente.

El pigmento de betalaínas estaba contenido en la vacuola de las células de remolacha. La membrana celular contiene el contenido de la célula como una barrera. La membrana celular está formada por la bicapa de fosfolípidos y moléculas de proteína. Estas proteínas están formadas por aminoácidos enlazados. Los enlaces de hidrógeno dentro de la proteína determinan su forma tridimensional. Sin embargo, a medida que aumentaba el calor, los enlaces de hidrógeno se debilitaban debido al aumento de la energía cinética de los átomos individuales. Una mayor energía cinética creó más espacios en la bicapa de fosfolípidos para que se filtraran las betalaínas. En cierto punto, los enlaces de hidrógeno rotos hicieron que las proteínas cambiaran de forma y se desnaturalizaran, dejando agujeros más grandes en la membrana celular. Esto es cuando incluso mayores cantidades de betalaínas se filtraron a través de la membrana y, por lo tanto, colorearon una solución con más fuerza. En resumen, un aumento de temperatura provocó una mayor destrucción de la membrana celular, lo que permitió que se filtrara más pigmento por difusión.


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El proteasoma

El proteasoma es una gran partícula cilíndrica que consta de al menos 33 subunidades, con un peso molecular total de aproximadamente 2,5 MDa 3,4. Existen varias variantes del proteasoma que realizan funciones ligeramente diferentes. Por ejemplo, las células del sistema inmunológico contienen una forma particular del proteasoma que produce péptidos para mostrarlos en la superficie celular 5. Nos centraremos en la versión del proteasoma que se encuentra en todas las células y es responsable de la degradación específica de las proteínas reguladoras y la eliminación de las proteínas dañadas. Esta forma, llamada proteasoma 26S, está compuesta por una partícula del núcleo 20S cubierta por una partícula reguladora 19S 3,4 en uno o ambos extremos (Fig. 1a). En las bacterias, una serie de proteasas dependientes de ATP comparten un diseño estructural común con el proteasoma y cumplen funciones equivalentes (Fig. 1b). El proteasoma y estas proteasas bacterianas están relacionadas lejanamente y pertenecen al grupo de proteínas AAA + (ATPasas asociadas con diversas actividades celulares).

La estructura general del proteasoma eucariota y la proteasa ClpAP bacteriana.

Las dos proteasas tienen una arquitectura común. Los sitios de proteasa están enterrados en una cámara interna de la partícula central, que está cubierta por partículas reguladoras que controlan el acceso a la cámara proteolítica y contienen un anillo hexamérico de ATPasa.

A: sección transversal lateral del proteasoma 26S eucariota. La partícula del núcleo 20S está flanqueada por partículas reguladoras de 19S, y los sitios proteolíticos se encuentran en los anillos & # x003b2 de la partícula del núcleo 20S. Se representan las proteínas de armazón Rpn1 y Rpn2, los receptores de ubiquitina Rpn10 y Rpn13 y los bucles que recubren el anillo de ATPasa. Solo se muestra un conjunto de bucles para mayor claridad.

B: sección transversal lateral de la proteasa ClpAP de Escherichia coli. ClpP contiene los sitios proteolíticos y está protegido en ambos extremos por el anillo ClpA ATPasa.

La partícula del núcleo 20S es una pila de cuatro anillos heptaméricos, que se ensamblan para formar una estructura cilíndrica 3. Los dos anillos exteriores están formados por subunidades & # x003b1 y los dos anillos interiores están formados por subunidades & # x003b2, que contienen los sitios activos proteolíticos en una cavidad central (Fig. 1a). Se puede llegar a la cámara de degradación a través de un canal que corre a lo largo del eje longitudinal de la partícula del núcleo. La entrada al canal es estrecha, aproximadamente 13 & # x000c5 6,7, de modo que las proteínas plegadas deben desplegarse al menos parcialmente antes de que puedan translocarse en la partícula del núcleo 20S y degradarse 8.

La partícula reguladora 19S está compuesta por al menos 19 subunidades dispuestas en dos subcomplejos & # x02013 la tapa y la base. La partícula reguladora contiene subunidades de ATPasa, bloquea la entrada al canal de degradación y desempeña un papel en el reconocimiento, el despliegue y la translocación del sustrato en la partícula del núcleo 20S 4,5 (Fig. 1a).


Cuantificación de tasas de fotodegradación DOM

Las tasas de fotodegradación de la columna de agua de DOM (Fig.2) se rigen por tres procesos dependientes de la longitud de onda: (1) la cantidad de luz solar que llega a la superficie del agua, (2) la tasa de absorción de la luz solar por CDOM en el agua y (3) el rendimiento cuántico aparente (AQY), que cuantifica la fotolabilidad DOM como moles de producto formado por moles de fotones absorbidos por CDOM.

La tasa de fotodegradación de la columna de agua de DOM es el producto integrado de dos espectros: la absorción de la luz solar por CDOM (luz solar = UV más radiación fotosintéticamente activa (PAR) irradiancia mol fotones m −2 d −1), que depende del flujo de fotones al agua superficie, la fracción de luz solar absorbida por CDOM en la columna de agua (la extinción de la luz multiplicada por la cantidad de luz que absorbe CDOM en relación con la luz total absorbida, aCDOM,λ/at,λ) y el AQY para un producto fotoquímico específico (ϕλ por ejemplo, mol CO2 producidos por mol de fotones absorbidos por CDOM para fotomineralización). El AQY es una medida de la "fotolabilidad" de DOM, o la facilidad de alteración fotoquímica, por ejemplo, un AQY alto para la fotomineralización de DOM a CO2 significa alta fotolabilidad del DOM para convertirlo en CO2 por la luz del sol.

Flujo de fotones (mi0,λ)

Las cantidades de DOM fotodegradadas en la columna de agua generalmente aumentan con el aumento de la luz solar que llega a la superficie del agua (Cory et al. 2015). La luz solar en la superficie del agua, representada como el espectro de fotones directos y difusos (mi0,λ en la Fig.2, en mol fotones m −2 tiempo −1 nm −1 longitud de onda) depende de la latitud, la fecha, la hora del día (es decir, el ángulo cenital solar), la elevación (Leifer 1988) y la cobertura de nubes (Bernhard 2011) . Dependiendo de la ubicación y la composición atmosférica, las distribuciones espectrales de la luz ultravioleta y visible difieren de las condiciones de cielo despejado porque una fracción de la luz descendente es difusa cuando hay nubes o partículas. Pueden existir grandes incertidumbres al evaluar las desviaciones de las condiciones de cielo despejado, especialmente para el espectro UVB (Bernhard 2011), lo cual es importante porque la absorción de luz por CDOM y la eficiencia de la fotodegradación DOM son más altas en el rango de UVB (White et al.2003 Osburn et al. . 2009).

El destino de los fotones en las aguas superficiales

Después de reflejarse en la superficie del agua, el destino de la mayoría de los fotones es ser absorbido por CDOM (Williamson et al. 1996). Las concentraciones de CDOM suelen ser lo suficientemente altas como para absorber toda la luz ultravioleta antes de que llegue al fondo del río o del lago, mientras que en aguas con baja CDOM la luz que llega al fondo se refleja de nuevo en la columna de agua (es decir, radiación ascendente). Las tasas de absorción de luz aumentan con el aumento de las concentraciones de CDOM y con la fracción de luz absorbida por CDOM frente a otros constituyentes acuosos (aCDOM,λ/at,λ en la Fig. 2 Cory et al. 2015). La fracción de luz solar absorbida por CDOM es a menudo ∼ 1.0 para longitudes de onda entre 280 nm y 400 nm (Cory et al. 2014). En aguas que reciben altas cargas de DOM de origen terrestre, CDOM también puede contribuir sustancialmente a la absorción de luz visible (Williamson et al. 1996 Cory et al. 2015). Por el contrario, en aguas turbias o con baja CDOM, la absorción por CDOM puede ser menor que la absorción por material particulado, especialmente en el rango visible (Cory et al. 2013, 2014).

La absorción de luz por CDOM inicia reacciones fotoquímicas y debe cuantificarse para calcular las tasas de fotodegradación y comparar la fotolabilidad de DOM entre diferentes condiciones o sistemas. La fotolabilidad de DOM es la eficiencia dependiente de la longitud de onda de cualquier producto formado por fotón absorbido por CDOM, llamado AQY (ϕλ, Figura 2). Los AQY para la fotomineralización de DOM varían de aproximadamente & lt 1 mmol CO2 mol −1 fotones a & gt 3 mmol CO2 mol −1 fotones a 350 nm (Vähätalo et al.2000 Johannessen y Miller 2001 Osburn et al.2009 White et al.2010 Cory et al.2014 Koehler et al.2014 Vachon et al.2016), una reacción que es & lt 0.1 % de eficiencia por mol de fotones absorbidos.

A pesar de la baja eficiencia de cualquier reacción fotoquímica en particular, el CDOM se consume mediante la absorción de la luz solar, lo que se conoce como "fotoblanqueo". Un error común es que solo CDOM es degradado por la luz, pero la absorción de luz por CDOM promueve la fotodegradación del cromóforo. y reservorios de DOM no cromofóricos a través de una variedad de reacciones fotoquímicas indirectas que probablemente involucren especies reactivas de oxígeno (ROS) e intermedios radicales (Andrews et al. 2000 White et al. 2003, 2010 Cory et al. 2010 Page et al. 2014). La absorción de luz puede degradar tanto la CDOM aromática como la DOM alifática (Gonsior et al.2009 Cory et al.2010 Stubbins et al.2010 Ward et al.2014 Ward y Cory 2016).


Discusión

La importancia del recambio de proteínas se reconoció hace 80 años (Hinkson & Elias, 2011). Los datos generados por los experimentos pSILAC (Pratt et al, 2002 Schwanhausser et al, 2009, 2011) ayudó a descubrir cómo las células ajustan el proceso de proteostasis (Eichelbaum & Krijgsveld, 2014 Jovanovic et al, 2015 Liu et al, 2017a). En un estado estable dentro de un sistema celular, la concentración de proteína estable es el resultado del equilibrio entre la síntesis y degradación de proteínas (Dephoure et al, Batalla de 2014 et al, 2015 Liu et al, 2016). En una comparación relativa entre estados estacionarios, es concebible que el cambio de pliegue del ARNm represente el intento de regulación transcripcional, mientras que la degradación de la proteína sugiere un intento de ajuste postraduccional (Liu et al, 2017a, 2019 Martin-Perez & Villen, 2017). Por lo tanto, nos enfocamos en desentrañar la complejidad de la correlación entre la degradación de proteínas y la abundancia de ARNm en el presente estudio.

Una plantilla de un solo gen puede dar lugar a docenas de isoformas de proteínas, a través de, por ejemplo, la traducción de isoformas de ARNm AS. Se especuló que las isoformas de proteínas podrían exhibir estabilidades drásticamente diferentes que podrían influir en sus modelos de función y regulación (Hinkson & Elias, 2011 Zecha et al, 2018). A la luz de esto, proporcionamos un análisis de correlación con una resolución de isoforma AS. El uso de células HeLa elimina parcialmente los factores de confusión como los SNP y las mutaciones genómicas individuales, que se sabe que afectan la estabilidad de las proteínas (Wang & Moult, 2001 Reumers et al, 2005 Greig et al, 2015 Milenkovic et al, 2018). Debido a que las proteínas llevan a cabo prácticamente la mayoría de las funciones celulares, los análisis futuros serán extremadamente útiles para respaldar el papel celular de las isoformas de AS, al responder cuántas y qué tipo de transcripciones alternativas se traducen y estabilizan en la célula (Floor & Doudna, 2016 Weatheritt et al, 2016 ).

El nivel actual de sensibilidad, reproducibilidad y principio de funcionamiento de las técnicas ascendentes de EM ampliamente utilizadas (Aebersold y Mann, 2016) parece ser menos eficiente en el análisis de los productos de proteína AS (Smith y Kelleher, 2013 Abascal et al, 2015 árboles et al, 2017b Wang et al, 2018b Chaudhary et al, 2019). Los experimentos proteómicos anteriores a gran escala parecían identificar solo una breve lista de formas AS, que a menudo son poco abundantes, temporales, conservadas y sutiles en la anotación funcional (Zhu et al, 2014 árboles et al, 2017a). En este estudio, primeramente, aplicamos un análisis centrado en péptidos de DIA-MS, que proporciona una consistencia cuantitativa similar a la SRM, pero en una escala analítica mucho más allá de la detección de cientos de péptidos (Gillet et al, 2012 Rost et al, 2015 Blencowe, 2017 Bruderer et al, 2017 Tress et al, 2017b Amon et al, 2019 Mehnert et al, 2019) y proporciona una sensibilidad decente (es decir, 2,5 veces más péptidos detectados en comparación con el informe anterior). En segundo lugar, utilizamos un enfoque dirigido a la abundancia de ARNm para identificar y cuantificar señales de grupos de isoformas. Sin embargo, incluso con las técnicas de MS más reproducibles, como DIA-MS, el mayor obstáculo para analizar la diversidad de isoformas de AS mediante la proteómica sigue siendo el límite de sensibilidad. Por ejemplo, si usamos la máxima rigurosidad y solo aceptamos péptidos proteotípicos únicos que siempre pueden distinguir una única isoforma distintiva (es decir, no se permite ningún grupo de isoformas), solo podemos mapear un total de 30 genes con múltiples eventos de AS mediante datos de DIA. La detección de péptidos AS orientada a la abundancia de transcripciones permite la detección de exones solo con recuentos de lectura apreciables (Lau et al, 2019). Además, la cuantificación de AS orientada a la abundancia de transcripciones permite una anotación funcional más amplia.

Es importante destacar que en este estudio, hemos implementado el avance completo de DIA-MS en el etiquetado de proteómica como el análisis pSILAC. Hemos demostrado anteriormente que la alta reproducibilidad de DIA-MS (ejemplificada por SWATH-MS) aumentó la eficiencia del experimento pSILAC, porque el curso del tiempo de persecución de pulsos involucra rutinariamente múltiples muestras (Rost et al, 2016 Liu et al, 2017a, 2019). En este documento, para establecer aún más el enfoque pSILAC-DIA, hemos desarrollado el flujo de trabajo, que se caracteriza por (i) detectabilidad mejorada de señales isotópicas pesadas en los primeros puntos de tiempo de persecución de pulsos por ISW (ii) generación automática de canales de etiquetado faltantes de ambos DIA y datos de DDA (iii) alinearon elución de H / L sin necesidad de alineación de características posteriores a la identificación. Demostramos que el enfoque directo pSILAC-DIA ofrece una precisión cuantitativa especialmente mejor y características cuantitativas más ricas que los métodos alternativos como pSILAC-MS1 (Schwanhausser et al, 2011 Mathieson et al, 2018) o análisis pSILAC-TMT (McAlister et al, 2014 Welle et al, 2016 Savitski et al, 2018 Zecha et al, 2018), así como una notable flexibilidad y potencial. Esperamos que nuestro enfoque sea ampliamente utilizado en futuros estudios de pSILAC. En términos más generales, sugerimos que habrá una necesidad urgente de aumentar la multiplexidad de la medición de DIA en un futuro próximo (Wu et al, 2014 Di et al, 2017 Liu et al, 2017a, 2019). El ISW ejemplificado y los flujos de trabajo etiquetados serán útiles para satisfacer esta necesidad.

Disecamos la correlación biológica entre el ARNm y kpérdida desde dos ángulos: el absoluto y el relativo (Liu et al, 2016). Descubrimos que la correlación absoluta depende en gran medida de las concentraciones de ARNm y proteína. Por ejemplo, la heterogeneidad de las tasas de degradación básicas en el ribosoma y la matriz mitocondriales puede explicarse en gran medida por el rango de sus niveles de expresión génica. Al perfilar el ARNm relativokpérdida correlación, hemos descubierto GOBP y GOCC con una diferencia sustancial de degradación de proteínas entre las células HeLa CCL2 y Kyoto. Es importante destacar que esperamos que muchos genes involucrados en estos procesos puedan servir como una lista para predecir los eventos de renovación "preferiblemente regulados", especialmente cuando las regulaciones ascendentes o descendentes del ARNm se determinan entre diferentes estados estacionarios. Esto se debe a la conservación de la base molecular de la degradación de proteínas, como la participación en la complejidad de la proteína estable, las redes de chaperones y las vías dependientes de ubiquitina (Cambridge et al, 2011 Bhattacharyya et al, 2014 Liu et al, 2017a Martin-Perez y Villen, 2017).

Nuestro análisis descubrió dos ejemplos que muestran la diversidad de degradación de proteínas en la escala de suborganelos: la degradación amortiguadora de las subunidades del proteasoma 20S (pero no el 19S) y el efecto amortiguador en las subunidades grandes del mitoribosoma (pero no la subunidad pequeña). En particular, estas diferencias significativas de proteostasis se derivan del análisis de correlación relativa y es poco probable que dependan estrechamente de los niveles de expresión génica. Varios informes han indicado una estabilidad diferencial de las dos subunidades del proteasoma (Mathieson et al, 2018). Becher et al (2018) utilizaron una estrategia de perfil de proteoma térmico de MS e informaron que durante el ciclo celular el proteasoma mostró una estabilidad diferente y una variación de abundancia en un subconjunto de proteínas del subcomplejo regulador 19S. Usando un enfoque similar, Volkening et al (2019) informaron que el complejo regulador 19S tiene una temperatura de fusión de proteínas mucho más baja y un mayor grado de flexibilidad de conformación. La estabilidad de las subunidades 19S y 20S puede estar estrechamente ligada a sus funciones: la subunidad del núcleo de la proteína 20S está altamente estructurada, mientras que la base reguladora 19 y la tapa están compuestas por proteínas con diversas funciones, por ejemplo, el reconocimiento de ubiquitina y el transporte de proteínas (Volkening et al, 2019). De manera consistente, nuestro resultado indica que la variación de 20S a través de las células cancerosas está significativamente amortiguada por la degradación de proteínas, lo que refuerza los resultados del perfil de estabilidad térmica. El mitoribosoma realiza la síntesis de proteínas dentro de las mitocondrias (Greber y Ban, 2016). Nuestros datos sugirieron una falta de control de la degradación de proteínas para la subunidad pequeña del mitoribosoma, que tiene un ARNm más bajo.kpérdida correlación, correlación mucho más alta de ARNm-proteína y, en última instancia, mayor variación en la abundancia de proteínas cuando se compara la subunidad grande. De manera similar al proteasoma, esto podría sugerir que las proteínas de mitoribosoma de subunidad grande deben controlarse estrictamente a nivel de proteína para una función potencialmente limitante de la velocidad. Para definir mecánicamente la relación entre la diferencia de degradación de proteínas y la función biológica del suborganelo, será interesante en última instancia seguir la variación ambiental (Romanov et al, 2019), pero va más allá del alcance del estudio actual.

Se observaron niveles de expresión diferencial y tasas de degradación para proteoformas individuales del mismo gen, de acuerdo con comparaciones tanto absolutas como relativas. De acuerdo con informes anteriores (Abascal et al, 2015), muchos de ellos son variantes de empalme altamente expresadas o conservadas, como la subunidad alfa 1 transportadora de ATPasa Na + / K + (ATP1A1), el dominio SNW que contiene 1 (SNW1), la cadena alfa-1 de tropomiosina (TPM1) y cadena alfa-4 (TPM4). Se descubrió que los eventos TPM1 AS son informativos en los predictores de pronóstico para el cáncer de cabeza y cuello (Liang et al, 2019), miocardiopatía dilatada (Pugh et al, 2014 Abascal et al, 2015) y la migración de células cancerosas de esófago (Huang et al, 2017), lo que demuestra la diversidad funcional de las isoformas de TPM1 AS. A diferencia de estudios anteriores, cuantificamos aún más kpérdida diferencia tanto en los niveles básicos como en las proporciones relativas de CCL2 frente a Kyoto entre los grupos de isoformas de TPM1 AS. Por lo tanto, la estabilidad de la expresión de la isoforma TPM1 podría estar asociada a la variabilidad fenotípica del contraste de textura de las estructuras de actina entre las líneas celulares HeLa (Liu et al, 2019 ).

En cuanto a los eventos de cambio de AS significativos, encontramos que la pérdida de retención de intrones aumentó efectivamente la expresión de la proteína correspondiente a lo largo del paso celular a largo plazo. Debido a que el RI puede desencadenar NMD de ARNm o inducir inhibición de la traducción, se ha considerado como un evento de EA anormal asociado con diversas enfermedades o respuesta al estrés (Wong et al, 2016 Morgan et al, 2019 Parenteau et al, 2019). Nuestros resultados no encontraron regulaciones significativas de degradación de proteínas para isoformas de RI a codificación, lo que podría sugerir que el efecto principal del gen RI ocurre durante la transcripción o los niveles de traducción. El claro papel de la proteostasis en la IR puede depender de los tipos de enfermedad (Adusumalli et al, 2019) y queda por explorar.

En conclusión, aplicamos un enfoque proteómico integrador y cuantificamos el control postraduccional y postraduccional específico de isoformas en las líneas celulares de cáncer humano. El nivel de ARNm, la abundancia de proteínas y las tasas de degradación de proteínas se resuelven a niveles de isoformas, lo que proporciona una mejor resolución que el análisis centrado en genes. Especialmente, descubrimos diversidad de recambio de proteínas entre diferentes procesos biológicos, orgánulos, subunidades de orgánulos e isoformas individuales. Los datos abogan por la necesidad de más estudios biológicos de sistemas en el futuro para estudiar el ARNm.kpérdida relaciones a través de condiciones variables tales como estados de salud y enfermedad.


Análisis

1. Describe cómo cambia la frecuencia respiratoria del pez con la temperatura. A medida que disminuye la temperatura, la frecuencia respiratoria también disminuye.

2. Proponga una explicación de por qué la respiración cambió de esta manera. Los peces son ectotérmicos (de sangre fría) y su metabolismo se ve afectado por la temperatura exterior.

3. ¿Qué otros factores (además de la temperatura) pueden haber afectado la tasa? Estrés en el pescado, como mover los vasos, remover el agua

4. ¿El & ldquoaverage & rdquo fue similar a los datos de sus peces? ¿Por qué tomamos un promedio? los promedios dan una visión más amplia, pueden ser más precisos que un solo pez

5. ¿Fue correcta o incorrecta su predicción al comienzo de la práctica de laboratorio? las respuestas varían

6. Diseñe un experimento que pruebe cómo la luz afecta la frecuencia respiratoria de un pez. Explica tu diseño. Es posible que desee hacer un dibujo de su configuración. Incluya cómo cambiará el medio ambiente y qué medirá.

El diseño debe ser lógico, debe incluir el monitoreo de la respiración de los peces en la luz y en la oscuridad para ver si cambia.

7. Suponga que este experimento se repitió usando un animal endotérmico (de sangre caliente) como sujeto de prueba en lugar de un pez. Se monitorea la frecuencia cardíaca y respiratoria de un ratón a medida que se eleva y luego se baja la temperatura. ¿Cambiarán la respiración y la frecuencia cardíaca del mouse & rsquos? ¿Por qué o por qué no?

el ratón no cambia, son endotérmicos

8. Indique en el gráfico qué línea representaría al animal endotérmico y qué línea representaría al animal ectotérmico. Explique cómo sabe esto. La línea superior es el pez, la línea inferior es el mamífero, el cambio de respiración de los mamíferos se mantiene más o menos igual


Contenido

Procesamiento proteolítico postraduccional Editar

La proteólisis limitada de un polipéptido durante o después de la traducción en la síntesis de proteínas a menudo ocurre para muchas proteínas. Esto puede implicar la eliminación de la metionina N-terminal, el péptido señal y / o la conversión de una proteína inactiva o no funcional en una activa. El precursor de la forma funcional final de la proteína se denomina proproteína, y estas proproteínas pueden sintetizarse primero como preproproteína. Por ejemplo, la albúmina se sintetiza primero como preproalbúmina y contiene un péptido señal no escindido. Esto forma la proalbúmina después de que se escinde el péptido señal, y un procesamiento adicional para eliminar el propéptido de 6 residuos N-terminal produce la forma madura de la proteína. [1]

Eliminación de metionina N-terminal Editar

La metionina iniciadora (y, en procariotas, fMet) puede eliminarse durante la traducción de la proteína naciente. Para E. coli, fMet se elimina eficazmente si el segundo residuo es pequeño y no está cargado, pero no si el segundo residuo es voluminoso y está cargado. [2] Tanto en procariotas como en eucariotas, el residuo N-terminal expuesto puede determinar la vida media de la proteína de acuerdo con la regla del extremo N.

Eliminación de la secuencia de señales Editar

Las proteínas que deben dirigirse a un orgánulo particular o para secreción tienen un péptido señal N-terminal que dirige la proteína a su destino final. Este péptido señal se elimina mediante proteólisis después de su transporte a través de una membrana.

Escisión de poliproteínas Editar

Algunas proteínas y la mayoría de las hormonas polipeptídicas eucariotas se sintetizan como un polipéptido precursor grande conocido como poliproteína que requiere escisión proteolítica en cadenas polipeptídicas individuales más pequeñas. La poliproteína proopiomelanocortina (POMC) contiene muchas hormonas polipeptídicas. El patrón de escisión de POMC, sin embargo, puede variar entre diferentes tejidos, produciendo diferentes conjuntos de hormonas polipeptídicas de la misma poliproteína.

Muchos virus también producen sus proteínas inicialmente como una sola cadena polipeptídica que se tradujo a partir de un ARNm policistrónico. Este polipéptido se escinde posteriormente en cadenas polipeptídicas individuales. [1] Los nombres comunes de la poliproteína incluyen mordaza (antígeno específico de grupo) en retrovirus y ORF1ab en Nidovirales. El último nombre se refiere al hecho de que una secuencia resbaladiza en el ARNm que codifica el polipéptido provoca un desplazamiento del marco ribosómico, lo que conduce a dos longitudes diferentes de cadenas peptídicas (a y ab) en una proporción aproximadamente fija.

Escisión de proteínas precursoras Editar

Muchas proteínas y hormonas se sintetizan en forma de sus precursores: zimógenos, proenzimas y prehormonas. Estas proteínas se escinden para formar sus estructuras activas finales. La insulina, por ejemplo, se sintetiza como preproinsulina, que produce proinsulina después de que se ha escindido el péptido señal. The proinsulin is then cleaved at two positions to yield two polypeptide chains linked by two disulfide bonds. Removal of two C-terminal residues from the B-chain then yields the mature insulin. Protein folding occurs in the single-chain Proinsulin form which facilitates formation of the ultimately inter-peptide disulfide bonds, and the ultimately intra-peptide disulfide bond, found in the native structure of insulin.

Proteases in particular are synthesized in the inactive form so that they may be safely stored in cells, and ready for release in sufficient quantity when required. This is to ensure that the protease is activated only in the correct location or context, as inappropriate activation of these proteases can be very destructive for an organism. Proteolysis of the zymogen yields an active protein for example, when trypsinogen is cleaved to form trypsin, a slight rearrangement of the protein structure that completes the active site of the protease occurs, thereby activating the protein.

Proteolysis can, therefore, be a method of regulating biological processes by turning inactive proteins into active ones. A good example is the blood clotting cascade whereby an initial event triggers a cascade of sequential proteolytic activation of many specific proteases, resulting in blood coagulation. The complement system of the immune response also involves a complex sequential proteolytic activation and interaction that result in an attack on invading pathogens.

Protein degradation Edit

Protein degradation may take place intracellularly or extracellularly. In digestion of food, digestive enzymes may be released into the environment for extracellular digestion whereby proteolytic cleavage breaks proteins into smaller peptides and amino acids so that they may be absorbed and used. In animals the food may be processed extracellularly in specialized organs or guts, but in many bacteria the food may be internalized via phagocytosis. Microbial degradation of protein in the environment can be regulated by nutrient availability. For example, limitation for major elements in proteins (carbon, nitrogen, and sulfur) induces proteolytic activity in the fungus Neurospora crassa [3] as well as in of soil organism communities. [4]

Proteins in cells are broken into amino acids. This intracellular degradation of protein serves multiple functions: It removes damaged and abnormal protein and prevents their accumulation. It also serves to regulate cellular processes by removing enzymes and regulatory proteins that are no longer needed. The amino acids may then be reused for protein synthesis.

Lysosome and proteasome Edit

The intracellular degradation of protein may be achieved in two ways - proteolysis in lysosome, or a ubiquitin-dependent process that targets unwanted proteins to proteasome. The autophagy-lysosomal pathway is normally a non-selective process, but it may become selective upon starvation whereby proteins with peptide sequence KFERQ or similar are selectively broken down. The lysosome contains a large number of proteases such as cathepsins.

The ubiquitin-mediated process is selective. Proteins marked for degradation are covalently linked to ubiquitin. Many molecules of ubiquitin may be linked in tandem to a protein destined for degradation. The polyubiquinated protein is targeted to an ATP-dependent protease complex, the proteasome. The ubiquitin is released and reused, while the targeted protein is degraded.

Rate of intracellular protein degradation Edit

Different proteins are degraded at different rates. Abnormal proteins are quickly degraded, whereas the rate of degradation of normal proteins may vary widely depending on their functions. Enzymes at important metabolic control points may be degraded much faster than those enzymes whose activity is largely constant under all physiological conditions. One of the most rapidly degraded proteins is ornithine decarboxylase, which has a half-life of 11 minutes. In contrast, other proteins like actin and myosin have a half-life of a month or more, while, in essence, haemoglobin lasts for the entire life-time of an erythrocyte. [5]

The N-end rule may partially determine the half-life of a protein, and proteins with segments rich in proline, glutamic acid, serine, and threonine (the so-called PEST proteins) have short half-life. [6] Other factors suspected to affect degradation rate include the rate deamination of glutamine and asparagine and oxidation of cystein, histidine, and methionine, the absence of stabilizing ligands, the presence of attached carbohydrate or phosphate groups, the presence of free α-amino group, the negative charge of protein, and the flexibility and stability of the protein. [5] Proteins with larger degrees of intrinsic disorder also tend to have short cellular half-life, [7] with disordered segments having been proposed to facilitate efficient initiation of degradation by the proteasome. [8] [9]

The rate of proteolysis may also depend on the physiological state of the organism, such as its hormonal state as well as nutritional status. In time of starvation, the rate of protein degradation increases.

Digestion Edit

In human digestion, proteins in food are broken down into smaller peptide chains by digestive enzymes such as pepsin, trypsin, chymotrypsin, and elastase, and into amino acids by various enzymes such as carboxypeptidase, aminopeptidase, and dipeptidase. It is necessary to break down proteins into small peptides (tripeptides and dipeptides) and amino acids so they can be absorbed by the intestines, and the absorbed tripeptides and dipeptides are also further broken into amino acids intracellularly before they enter the bloodstream. [10] Different enzymes have different specificity for their substrate trypsin, for example, cleaves the peptide bond after a positively charged residue (arginine and lysine) chymotrypsin cleaves the bond after an aromatic residue (phenylalanine, tyrosine, and tryptophan) elastase cleaves the bond after a small non-polar residue such as alanine or glycine.

In order to prevent inappropriate or premature activation of the digestive enzymes (they may, for example, trigger pancreatic self-digestion causing pancreatitis), these enzymes are secreted as inactive zymogen. The precursor of pepsin, pepsinogen, is secreted by the stomach, and is activated only in the acidic environment found in stomach. The pancreas secretes the precursors of a number of proteases such as trypsin and chymotrypsin. The zymogen of trypsin is trypsinogen, which is activated by a very specific protease, enterokinase, secreted by the mucosa of the duodenum. The trypsin, once activated, can also cleave other trypsinogens as well as the precursors of other proteases such as chymotrypsin and carboxypeptidase to activate them.

In bacteria, a similar strategy of employing an inactive zymogen or prezymogen is used. Subtilisin, which is produced by Bacillus subtilis, is produced as preprosubtilisin, and is released only if the signal peptide is cleaved and autocatalytic proteolytic activation has occurred.

Cellular regulation Edit

Proteolysis is also involved in the regulation of many cellular processes by activating or deactivating enzymes, transcription factors, and receptors, for example in the biosynthesis of cholesterol, [11] or the mediation of thrombin signalling through protease-activated receptors. [12]

Some enzymes at important metabolic control points such as ornithine decarboxylase is regulated entirely by its rate of synthesis and its rate of degradation. Other rapidly degraded proteins include the protein products of proto-oncogenes, which play central roles in the regulation of cell growth.

Cell cycle regulation Edit

Cyclins are a group of proteins that activate kinases involved in cell division. The degradation of cyclins is the key step that governs the exit from mitosis and progress into the next cell cycle. [13] Cyclins accumulate in the course the cell cycle, then abruptly disappear just before the anaphase of mitosis. The cyclins are removed via a ubiquitin-mediated proteolytic pathway.

Apoptosis Edit

Caspases are an important group of proteases involved in apoptosis or programmed cell death. The precursors of caspase, procaspase, may be activated by proteolysis through its association with a protein complex that forms apoptosome, or by granzyme B, or via the death receptor pathways.

Autoproteolysis takes place in some proteins, whereby the peptide bond is cleaved in a self-catalyzed intramolecular reaction. Unlike zymogens, these autoproteolytic proteins participate in a "single turnover" reaction and do not catalyze further reactions post-cleavage. Examples include cleavage of the Asp-Pro bond in a subset of von Willebrand factor type D (VWD) domains [14] [15] and Neisseria meningitidis FrpC self-processing domain, [16] cleavage of the Asn-Pro bond in Salmonela FlhB protein, [17] Yersinia YscU protein, [18] as well as cleavage of the Gly-Ser bond in a subset of sea urchin sperm protein, enterokinase, and agrin (SEA) domains. [19] In some cases, the autoproteolytic cleavage is promoted by conformational strain of the peptide bond. [19]

Abnormal proteolytic activity is associated with many diseases. [20] In pancreatitis, leakage of proteases and their premature activation in the pancreas results in the self-digestion of the pancreas. People with diabetes mellitus may have increased lysosomal activity and the degradation of some proteins can increase significantly. Chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis may involve the release of lysosomal enzymes into extracellular space that break down surrounding tissues. Abnormal proteolysis may result in many age-related neurological diseases such as Alzheimer's due to generation and ineffective removal of peptides that aggregate in cells. [21]

Proteases may be regulated by antiproteases or protease inhibitors, and imbalance between proteases and antiproteases can result in diseases, for example, in the destruction of lung tissues in emphysema brought on by smoking tobacco. Smoking is thought to increase the neutrophils and macrophages in the lung which release excessive amount of proteolytic enzymes such as elastase, such that they can no longer be inhibited by serpins such as α1-antitrypsin, thereby resulting in the breaking down of connective tissues in the lung. Other proteases and their inhibitors may also be involved in this disease, for example matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). [22]

Other diseases linked to aberrant proteolysis include muscular dystrophy, degenerative skin disorders, respiratory and gastrointestinal diseases, and malignancy.

Protein backbones are very stable in water at neutral pH and room temperature, although the rate of hydrolysis of different peptide bonds can vary. The half life of a peptide bond under normal conditions can range from 7 years to 350 years, even higher for peptides protected by modified terminus or within the protein interior. [23] [24] [25] The rate of hydrolysis however can be significantly increased by extremes of pH and heat. Spontaneous cleavage of proteins may also involve catalysis by zinc on serine and threonine. [26]

Strong mineral acids can readily hydrolyse the peptide bonds in a protein (acid hydrolysis). The standard way to hydrolyze a protein or peptide into its constituent amino acids for analysis is to heat it to 105 °C for around 24 hours in 6M hydrochloric acid. [27] However, some proteins are resistant to acid hydrolysis. One well-known example is ribonuclease A, which can be purified by treating crude extracts with hot sulfuric acid so that other proteins become degraded while ribonuclease A is left intact. [28]

Certain chemicals cause proteolysis only after specific residues, and these can be used to selectively break down a protein into smaller polypeptides for laboratory analysis. [29] For example, cyanogen bromide cleaves the peptide bond after a methionine. Similar methods may be used to specifically cleave tryptophanyl, aspartyl, cysteinyl, and asparaginyl peptide bonds. Acids such as trifluoroacetic acid and formic acid may be used for cleavage.

Like other biomolecules, proteins can also be broken down by high heat alone. At 250 °C, the peptide bond may be easily hydrolyzed, with its half-life dropping to about a minute. [27] [30] Protein may also be broken down without hydrolysis through pyrolysis small heterocyclic compounds may start to form upon degradation. Above 500 °C, polycyclic aromatic hydrocarbons may also form, [31] [32] which is of interest in the study of generation of carcinogens in tobacco smoke and cooking at high heat. [33] [34]

Proteolysis is also used in research and diagnostic applications:

  • Cleavage of fusion protein so that the fusion partner and protein tag used in protein expression and purification may be removed. The proteases used have high degree of specificity, such as thrombin, enterokinase, and TEV protease, so that only the targeted sequence may be cleaved.
  • Complete inactivation of undesirable enzymatic activity or removal of unwanted proteins. For example, proteinase K, a broad-spectrum proteinase stable in urea and SDS, is often used in the preparation of nucleic acids to remove unwanted nuclease contaminants that may otherwise degrade the DNA or RNA. [35]
  • Partial inactivation, or changing the functionality, of specific protein. For example, treatment of DNA polymerase I with subtilisin yields the Klenow fragment, which retains its polymerase function but lacks 5'-exonuclease activity. [36]
  • Digestion of proteins in solution for proteome analysis by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). This may also be done by in-gel digestion of proteins after separation by gel electrophoresis for the identification by mass spectrometry.
  • Analysis of the stability of folded domain under a wide range of conditions. [37]
  • Increasing success rate of crystallisation projects [38]
  • Production of digested protein used in growth media to culture bacteria and other organisms, e.g. tryptone in Lysogeny Broth.

Proteases may be classified according to the catalytic group involved in its active site. [39]

Venoms Edit

Certain types of venom, such as those produced by venomous snakes, can also cause proteolysis. These venoms are, in fact, complex digestive fluids that begin their work outside of the body. Proteolytic venoms cause a wide range of toxic effects, [40] including effects that are:


Signaling pathways involved in light dependent modulation of cellulase gene expression

For the presence of cellulose to be sensed in the environment, low molecular weight degradation products liberated from degradable plant material are likely signals that may be sensed by membrane bound receptors. Alternatively, an inducer synthesized outside the cell may be taken up via diffusion or a permease and initiate cellulase formation by an intracellular process. Both hypotheses are likely to describe contributions to the regulation of cellulase gene expression.

The heterotrimeric G-protein pathway

The prime candidate pathway for sensing and transmission of an extracellular cellulose related signals is the heterotrimeric G-protein pathway. Signal transduction via the heterotrimeric G-protein pathway starts with reception of a signaling compound by a G-protein coupled receptor (GPCR). Once such a ligand binds to the GPCR, the heterotrimeric G-protein complex composed of G-protein alpha, beta and gamma subunits, dissociates, GDP is exchanged for GTP on the G-alpha subunit for activation and all subunits then modulate their target pathways [37, 75, 76].

T. reesei has 50 GPCRs, 3 G-alpha subunits (GNA1, GNA2 and GNA3), one G-beta subunit (GNB1) and one G-gamma subunit (GNG1). Additionally, two phosducin like proteins (PhLP1 and PhlP2), which are assumed to act as co-chaperones for G-protein beta and gamma folding are encoded in the genome as well as 7 RGS (regulator of G-protein signaling) domain proteins [37]. The G-protein alpha subunits GNA1 and GNA3 impact cellulase gene expression and this function is dependent on light [77, 78]. Constitutive activation of GNA3 led to a strong increase in cellulase transcripts upon growth on cellulose (around tenfold), but only in light. In darkness, neither constitutive activation nor knock down altered cellulase transcript levels [77]. Interestingly, upregulation of gna3 without constitutive activation caused somewhat increased cellulase levels in light, which however did by far not reach the strong up regulation seen for the constitutive activation of GNA3. It is therefore likely that the rate of inactivation of the alpha subunit by the intrinsic GTPase of GNA3 plays a role. This function is enhanced by RGS (regulator of G-protein signaling) proteins, which are consequently assumed to be involved in cellulase regulation in T. reesei [77]. Of those, rgs1 represents a light independent regulatory target of GNB1, GNG1 and PhLP1 [53].

Lack of GNA1 causes a strong increase of cellulase gene expression in darkness and abolishment in light upon growth on cellulose. Constitutive activation of GNA1 caused—like for GNA3—an increase in cellulase transcript levels in light [78]. For both GNA1 and GNA3, constitutive activation did not enable inducer independent cellulase gene expression. Consequently, the signal for induction of cellulase gene expression is separate from that transmitted by GNA1 and GNA3 and may indeed involve intracellular detection of an inducer.

The G-protein beta and gamma subunits GNB1 and GNG1 as well as the phosducin-like protein PhLP1, which is assumed to act as a chaperone for complex formation of GNB1 and GNG1, influence regulation of several glycoside hydrolases including cbh1 y cbh2 [53]. Cellulase activity increases in all three mutants, while transcript abundance of several genes encoding plant cell wall degrading enzymes decreases, indicating posttranscriptional regulation [53]. However, the light dependent effects of GNB1, GNG1 and PhLP1 are considerably less pronounced than the strongly positive impact of the G-alpha subunits GNA1 and GNA3 [53]. In summary, these findings are in line with a positive effect of phosducin-like proteins on the efficiency of G-protein signaling [79].

Only recently, a new aspect was added to the function of the heterotrimeric G-protein pathway in cellulase regulation. The class XIII of G-protein coupled receptors (GPCRs) was found to have only a minor influence on cellulase transcript levels (up to 50%), but both were required for normal specific cellulase activities on lactose. In the absence of CSG1, representing one of the two class XIII GPCRs of T. reesei, secreted activity levels even decreased to basal levels upon growth on cellulose and lactose [33]. Hence it is assumed that the signal received by CSG1 is responsible for posttranscriptional regulation of cellulase gene expression, a mechanism previously not known to be involved. Based on the light dependent function of GNA1 and GNA3 it can be assumed that these downstream subunits integrate the light dependent relevance with the signal received by CSG1 to a physiological response adapted to the change of day and night.

The cAMP pathway

Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is one of the most important secondary messengers in living organisms. cAMP levels function as coincidence detectors due to their regulation by diverse environmental cues that are integrated to a defined level, which determines the extent of the effect on downstream pathways. Adenylate cyclase synthesizes cAMP and phosphodiestereases, which are activated by the presence of cAMP [80, 81], degrade it [82], forming a feedback cycle for adjustment of levels [80, 81]. Protein kinase A is cAMP dependent and consists of catalytic and regulatory subunits [37]. Light dependent effects on cAMP levels and adenylate cyclase activity have been shown previously for Trichoderma [83,84,85].

The cAMP dependent protein kinase A plays an important role in regulation of light responses in T. atroviride [86]. En T. reesei, the cAMP pathway is one of the targets of the heterotrimeric G-protein pathway and cAMP levels are impacted by both GNA1 and GNA3 [77, 78]. Investigation of the function of adenylate cyclase (ACY1) and the catalytic subunit 1 of protein kinase A (PKAc1) showed a light dependent effect on cellulase gene expression in both cases upon growth on lactose [87]. Supresión de acy1 y pkac1 caused increased light responsiveness of cellulase genes i.e. strongly increased differences between cellulase levels in light and darkness compared to the light dependent regulation in the wild-type. Regulation of the transcript levels of the transcription factors ACE1 and ACE2 that regulate transcription of cellulase genes show a response to light, but do not correlate well with cellulase levels. Modification of transcript levels of the cellulase regulator XYR1 strongly resembles the pattern of regulation seen for cellulase genes. Hence, it is assumed that the cAMP pathway does not directly target phosphorylation of XYR1, but rather causes phosphorylation of a regulator of XYR1, which by modification of XYR1 acts on cellulase transcription [87].

In this respect it is interesting that deletion of acy1 o pkac1 also causes decreased levels of the photoreceptor gene env1 [87], which regulates cellulase levels [42]. Phosphorylation of the photoreceptor complex by protein kinase A was shown in N. crassa [88] and critically impacts the function of the circadian clock by establishing a negative feedback loop. A similar mechanism may be responsible for regulation of env1 niveles en T. reesei. In turn, strains lacking ENV1 show strongly decreased cAMP levels, which is attributed to an impact of ENV1 on the function of phosphodiesterases rather than adenylate cyclase [89]. Such a mechanism would be in agreement with a feedback mechanism for fine-tuning of the integration of light response with nutrient signaling. Only recently we could confirm the involvement of a phosphodiesterase in light dependent cellulase regulation and the connection to ENV1 (E. Stappler et al., manuscript in preparation).

Interconnections between light response machinery and nutrient signaling pathways

The finding that light and its photosensors are involved in regulation of cellulase gene expression, indicated that nutrient utilization is interrelated with light response. The findings of the influence of the light signaling pathway on carbon-compound and carbohydrate metabolism [53] further raised the question as to the interconnections between nutrient signaling and sensing light. More detailed investigation of the heterotrimeric G-protein pathway and the cAMP pathway indicated that the light signal must be integrated with the transmitted nutrient signals.

BLR1 and BLR2 do not have a major impact on the G-protein signaling pathway [49]. ENV1 negatively influences blr1 y blr2 transcript levels, which in turn are required for induction of env1 in light. This mutual regulation causes a steady state level of transcripts for these three genes [49]. ENV1 is required for the positive feedback cycle of GNA1, which increases gna1 transcript levels upon constitutive activation. In turn, GNA1 negatively regulates env1 transcript levels [89]. Concerning the regulation mechanism of GNA3/gna3, ENV1 is not involved in establishing the gna3 feedback cycle, but negatively regulates gna3 transcript levels in light [89]. During investigation of the mutual regulatory effects of BLR1, BLR2 and ENV1 as well as GNA1, GNA3, GNB1, GNG1 and PhLP1, a pair with regulatory interaction at early light response emerged: PhLP1 and ENV1 [49]. With its negative effect on transcript levels of phlp1, gnb1 y gng1, ENV1 dampens G-protein signaling during early light response, presumably to provide resources for protection from light. Thereafter, PhLP1 can exert a positive effect on complex formation of GNB1 and GNG1 and G-protein signaling in general, which is likely to be important for metabolic adaptation to light [49]. The striking overlap in regulatory targets of photoreceptors, G-protein pathway components and ACY1 suggests that this interrelationship constitutes a core function in adaptation beyond transient effects in early light response.

Surprisingly, these interconnection studies revealed that it is not the photoreceptor complex comprising the two BLR proteins, but rather ENV1 that acts in a central position as a checkpoint, which is in line with its strong effect on gene regulation in light [46]. The more prominent role of ENV1 in comparison to BLR1 and BLR2 is also obvious in the role of ENV1 in the regulation of other physiological processes such as sexual development or stress response [41].

The strikingly low cAMP levels in mutants lacking ENV1 indicated that ENV1 could exert at least part of its function via the cAMP pathway adding another link between light response and nutrient signaling (see also above). El ∆acy1 strain showed a striking overlap of regulated genes in light, but not in darkness [49]. These genes have in common their regulation in the presence of strongly decreased or abolished cAMP levels. Among these cAMP targets there are numerous glycoside hydrolases, auxiliary proteins of cellulose degradation as well as the cellulase and hemicellulase regulator gene xyr1 [49]. Functional category analysis of these genes showed a strong enrichment in C-compound and carbohydrate metabolism. Consequently, the regulatory function of ENV1 in targeting regulation of enzyme expression is to a considerable extent mediated by its effect on cAMP levels [49]. Interestingly, many of the genes down-regulated in ∆env1 and ∆acy1 in the light are also down-regulated on soluble carbon sources compared to the insoluble carbon source cellulose [33]. Consequently, the cAMP dependent output of the regulatory cascade triggered by ENV1 could be targeted at sensing and/or reaction to a surface of specifically to cellulose, but not to a soluble carbon source [33].

In summary, ENV1 emerged as a major checkpoint between nutrient and light signaling [41]. However, it still remains to be shown whether this interrelationship is established directly by protein–protein interaction and an influence on activity of the targeted regulators or if the influence is indirect by an impact on regulation of abundance and/or activity of signaling factors, for example kinases, which in turn target regulatory factors. The considerable impact of deletion of env1 on the transcriptome in light [46] makes the latter hypothesis more likely.


Discusión

When the liver is placed in hydrogen peroxide in theory it will dissociate into water and oxygen gas.[15] One way to prove that oxygen gas is in fact present is to conduct a glowing splint test this involves lighting a splint and then extinguishing the flame only to the point where the end is glowing. This splint is then placed where the oxygen is believed to be present, if there is in fact oxygen the splint will reignite. This is because oxygen readily promotes combustion.

The enzyme which catalyzed the reaction that created the oxygen appeared to work the most effectively at a concentration of 4% (Figure 1) and least effectively at 6%. This is because the 4% solution was the closest to the optimal concentration of substrate for the catalase enzyme. At 2% there was less substrate than the enzyme was capable of disassociating therefore the reaction was not completed to its full potential. At 6% and 8% there was too much substrate and the enzyme was bombarded and unable to keep up with the necessary reactions.

Having the 8% solution create more foam volume than 6% was an unexpected result and the errors listed below are most likely accountable for this anomaly. The enzyme catalase, which is found in the beef liver, is responsible for the breakdown of hydrogen peroxide. When hydrogen peroxide breaks down it forms water and oxygen gas. The oxygen and water reacted with the detergent that was added to the solution to produce the foam. The more effective and active the enzyme is the more decompositions of hydrogen peroxide it catalyzes and more oxygen is produced increasing the volume of foam.

If the liver had been boiled before the experiment it would have been effectively denatured and the catalase would no longer have been able to carry out its metabolic function. When the liver was added to the hydrogen peroxide and detergent solution a reaction would not occur because it would be unable to breakdown the compound to water and oxygen and therefore foam would not form. Although this lab is effective in determining the efficiency of catalase under different substrate concentrations it does have several possible sources of error. First, the detergent is added by means of a medicine dropper.

This poses an error because the volume of each drop is not constant. If some of the drops were larger than others this creates more detergent for the oxygen to react with and in turn, more foam creating the illusion that the enzyme is more effective at that specific substrate concentration than others. Also if there is less volume of detergent emitted the oxygen cannot for as much foam and the enzyme appears less effective. The second source of error is that the hydrogen peroxide was measured in a 10mL graduated cylinder and then transferred to a 100mL graduated cylinder, there is no way to ensure that all of the solutions were transferred from one cylinder to another.

It is inevitable that some of the hydrogen peroxide would have clung to the side of, and remained in the original cylinder the amount that remained in each trial would have been different. Not having all of the hydrogen peroxide be transferred would result in less substrate for the enzyme to breakdown and a lower foam volume for the first two concentrations (2% and 4%) and a slightly higher foam volume for the second two concentrations (6% and 8%).

The third source of error is that some pieces of the liver may have had areas of fat inside them that were not visible and therefore there was less catalase in that piece of liver. This is very likely and if it were the case there would have been fewer enzymes to catalyze the reaction and this would have resulted in a smaller volume of foam causing an inaccurate result.

The second part of the lab showed that temperature had quite an effect on the permeability of beet cells. These cells contain a red dye called betacyanin. When the cell membrane works effectively the dye will not leak out of the cell. The lab showed that at room temperature the membrane remains effective but as the temperature traveled further away from 23°C ( both warmer and colder) the dye began to leak as the membrane failed.

Increased or decreased temperatures will begin to denature the transport and carrier proteins in the cell membrane allowing the betacyanin to travel into the surrounding water. Freezing is a technique used in the preservation of food. By freezing food the function of enzymes is slowed considerably, freezing is also used for several other purposes. One example is the freezing of living tissue this is done for several reasons including organ transplants.

This is done to preserve tissues in the state they are in so that they are viable for the recipients.[16] Another example of freezing for preservation is the freezing of soil. This is done by construction companies to solidify the ground and eliminate any leakages.[17] A third example of freezing is that human reproductive cells can be frozen so that they may be used at a later date. This process has been used to create sperm and egg “banks” so people who may not have otherwise been able to can have children.[18]

Freezing is very common in the food industry and although it may preserve some aspects it does not maintain others. For example, freezing preserves the taste, shape, and texture of the food but it will not preserve the proteins. In fact, as was learned in this lab, freezing temperatures actually denature proteins.[19] Also freezing does not preserve the fat in meat and over time it may go rancid and have a sour smell and taste.[20]

Another problem with freezing food is that ice crystals can form in the food from the liquid that escaped through the denatured cell membrane. These ice crystals may be large and solid enough to damage the cell structures around them.[21] Temperature plays a key role in the efficiency of proteins.

The pH of the solution that the beetroot is placed in has a large effect on the permeability of the cell membrane. The cell leaked a considerable amount of betacyanin when placed in highly acidic solutions. The intensity of the color decreased as the pH approached neutral (Figure 3). This is because like changes in temperature, pH values that are not optimal for the protein will denature it causing it to not function and, in this case, allow betacyanin to leak through.

One source of error is that the color of intensity was judged on a scale of 0-10, the problem with this scale is that it is subjective and was not related back to a fixed sample. Each person sees the color intensity differently and therefore the results are not consistent or as reliable as they would be with a fixed source. A way to fix this error is to use a colorimeter.[22]

The second source of error is in the ripeness of the beetroot. If the beetroot used in this lab was not ripe enough yet or too ripe the proteins may not have been as fully developed or beginning to die and the acid would have been able to denature them with ease therefore the color intensity would have been greater than it should have.

The third source of error is that the betacyanin was more concentrated in some parts of the beetroot. This could be seen by just looking at the beetroot because some sections were darker than others. It is impossible to ensure that all of the beet discs have the same concentration of dye. Depending on how much betacyanin was in the cell it would be able to emit more or less, changing the color intensity that the results were based on. pH also has a large impact on the function of proteins.

In summary, the purpose of this investigation was to examine the realistic effects of increased substrate concentration, changes in temperature, and pH levels on the function of the complex protein structures. The first section proved that an enzyme is more effective in lower concentrations of substrate.

The second part showed that temperature has a large effect on the efficiency of proteins and the permeability of a cell membrane. The last section proved that a decrease in pH also denatures proteins and limits the effect of the membrane. In conclusion, these three factors as well as many others have large effects on how proteins function.

[1] Imgrund, Ryan “Factors Involving Proteins”, 2009.

[2] Di Giuseppe, et al Maurice. Nelson Biology 12. South Melbourne: Nelson Thomson Learning, 2003.

[3] Di Giuseppe, et al Maurice. Nelson Biology 12. South Melbourne: Nelson Thomson Learning, 2003.

[4] Di Giuseppe, et all Maurice. Nelson Biology 12. South Melbourne: Nelson Thomson Learning, 2003.

[5] Di Giuseppe, et alMaurice. Nelson Biology 12. South Melbourne: Nelson Thomson Learning, 2003.

[6] Di Giuseppe, et al Maurice. Nelson Biology 12. South Melbourne: Nelson Thomson Learning, 2003.

[7] Arumugam, Karthik. “Enzymatic Treatment Of Fibers For Nonwovens.” (2005): 30. Web. 2 Oct 2009. <http://www.lib.ncsu.edu/theses/available/etd-08092005-123659/unrestricted/etd.pdf>.

[8] Arumugam, Karthik. “Enzymatic Treatment Of Fibers For Nonwovens.” (2005): 30. Web. 2 Oct 2009. <http://www.lib.ncsu.edu/theses/available/etd-08092005-123659/unrestricted/etd.pdf>.

[9] Imgrund, Ryan “Factors Involving Proteins”, 2009.

[10] Imgrund, Ryan “Factors Involving Proteins”, 2009.

[11] Gamper, Denice. “Investigating Factors That Affect Cell Membrane Permeability.” Programa de investigación de verano para profesores de ciencias. 08 Aug 2009. Web. 3 Oct 2009. <http://www.scienceteacherprogram.org/biology/DGamper09.html>.

[12] Smithson Adair, Gilbert. “The Determination Of Membrane Potentials Of potentials Of Protein Solutions and the Valance of Protien Ions.” Low Temperature Research Station and the Biochemical Laboratory, (1934): n. pag. Web. 3 Oct 2009. <http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=1253174&blobtype=pdf>.

[13] Kundrotas, Petras. “Optimum pH for protein-protein complexes..” (2006): n. pag. Web. 3 Oct 2009.

[14] Imgrund, Ryan “Factors Involving Proteins”, 2009

[15] Jones, Peter. “The Catalase-Hydrogen Peroxide System.” (1968): n. pag. Web. 6 Oct 2009.

[16] Fisher, Robyn. “Cold and cryo-preservation methods for human tissue slices.” Patent Storm (1994): n. pag. Web. 7 Oct 2009. <http://www.patentstorm.us/patents/5328821/fulltext.html>.

[17] Linde Group, The. “Freezing Soil.” Linde Industrial Gases. 2005. Web. 7 Oct 2009. <http://www.lindegas.com/international/web/lg/com/likelgcom30.nsf/DocByAlias/ind_soil>.

[18] Tucker, Michael J. “The Freezing of Human Oocytes (Eggs).” Georgia Reproductive Specialists (2007): n. pag. Web. 7 Oct 2009. <http://www.ivf.com/freezing.html>.

[19] Da-Wen, Sun. Handbook of Frozen Food Processing and Packaging. 1er. Boca Raton, FL: Taylor and Feancis Group, 2006. Print.

[20] Zotti, Ed. “Why is refreezing food bad? What exactly is freezer burn?.” (2005): n. pag. Web. 7 Oct 2009.

[21] Fellows, P.J. Food Processing Technology. 2do. Boca Raton, FL: Wppdhead Publishing Limited, 2000. Print.

[22] “Colorimeter.” The Lab Depot. 2007. Red Clay Interactive, Web. 7 Oct 2009. <http://www.labdepotinc.com/c-454-colorimeter.php>.

Trabajos citados

Arumugam, Karthik. “Enzymatic Treatment Of Fibers For Nonwovens.” (2005): 30. Web. 2 Oct

“Colorimeter.” The Lab Depot. 2007. Red Clay Interactive, Web. 7 Oct 2009.

Da-Wen, Sun. Handbook of Frozen Food Processing and Packaging. 1er. Boca Raton, FL:

Taylor and Feancis Group, 2006. Print.

Di Giuseppe, et al Maurice. Nelson Biology 12. South Melbourne: Nelson Thomson Learning,

Fellows, P.J. Food Processing Technology. 2do. Boca Raton, FL: Wppdhead Publishing Limited,

Fisher, Robyn. “Cold and cryo-preservation methods for human tissue slices.” Patent Storm

(1994): n. pag. Web. 7 Oct 2009. <http://www.patentstorm.us/patents/5328821/fulltext.html>.

Gamper, Denice. “Investigating Factors That Affect Cell Membrane Permeability.” Verano

Research Program for Science Teachers. 08 Aug 2009. Web. 3 Oct 2009.

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Jones, Peter. “The Catalase-Hydrogen Peroxide System.” (1968): n. pag. Web. 6 Oct 2009.

Kundrotas, Petras. “Optimum pH for protein-protein complexes..” (2006): n. pag. Web. 3 Oct 2009.

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Smithson Adair, Gilbert. “The Determination Of Membrane Potentials Of potentials Of Protein

Solutions and the Valance of Protien Ions.” Low Temperature Research Station and the Biochemical Laboratory, (1934): n. pag. Web. 3 Oct 2009. <http://www.pubmedcentral.

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(2007): n. pag. Web. 7 Oct 2009. <http://www.ivf.com/freezing.html>.

Zotti, Ed. “Why is refreezing food bad? What exactly is freezer burn?.” (2005): n. pag. Web. 7 Oct 2009

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Autor: William Anderson (Equipo editorial de Schoolworkhelper)

Tutor y escritor autónomo. Profesora de Ciencias y Amante de los Ensayos. Artículo revisado por última vez: 2020 | Institución St. Rosemary © 2010-2021 | Creative Commons 4.0


Ver el vídeo: TestLab: Qué es la desnaturalización de las proteínas? (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Mazutaur

    En él algo es. Gracias por la ayuda en esta pregunta. Todo ingenioso es simple.

  2. Nickolas

    Me gusta esta idea, estoy completamente contigo de acuerdo.



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