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¿Qué significa Ercc1 - / - / DAT-Cre +?

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Realmente necesito saber que Ercc1 - / - / DAT-Cre + significar. Creo que la primera parte significa que los ratones no tienen el gen Ercc1 (knockout). Pero que pasa DAT-Cre +?

Esta pregunta surgió al leer el siguiente artículo: "La reparación ineficaz del ADN es un modificador de la enfermedad de Parkinson relacionado con el envejecimiento" (Sara Sepe et al).

Ercc1 - / - / DAT-Cre + los ratones se mencionan varias veces, por ejemplo:

Los ratones Ercc1 - / - DAT-Cre + son viables y normales al nacer. A las 26 semanas de edad, la deleción específica de Ercc1 en ratones con neuronas DA provoca la reducción de la inmunorreactividad de la tirosina hidroxilasa (TH) en la SNpc y en el cuerpo estriado (Figuras 1A y 1B). El envejecimiento exacerba profundamente la reducción de neuronas de SNpc DA, como se evidencia en ratones Ercc1 - / - DAT-Cre + de 52 semanas de edad (Figura 1C). El daño es limitado en las neuronas DA y otras poblaciones no se ven afectadas, como lo indica la inmunorreactividad de NeuN sin cambios (Figuras 1A y 1B). En general, estos hallazgos demuestran que la función Ercc1 y la NER son esenciales para preservar la integridad de los circuitos DA a tiempo.


Ercc1 - / - DAT-Cre significa los ratones con knockout condicional de Ercc1 mediado por recombinasa Cre en las neuronas DA. DAT-Cre es la cepa de ratón que expresa Cre recombinasa del promotor del transportador de dopamina.

Cre-recombinasa: se utilizó el sistema loxP (Cre-loxP) para generar mutantes con deleción dirigida en neuronas que expresan el transportador de dopamina (DAT). La especificidad de la actividad de la recombinasa Cre se validó usando un indicador lacZ que confirmó la expresión en neuronas DA del SNpc y no en otros tipos de células, como las neuronas serotoninérgicas del núcleo de Raphe (Figura S1).

De información complementaria:

Los mutantes condicionales se generaron utilizando el sistema Cre-recombinasa: loxP (Cre-loxP) y cruzando una cepa portadora de un alelo Ercc1 flanqueado por sitios loxP (Ercc1fl / fl), con una cepa que expresa la recombinasa Cre bajo el control del transportador de dopamina específico. (DAT) promotor (Zhuang et al., 2005). Validamos la especificidad de la actividad recombinasa de Cre generando el reportero DAT-Cre + ROSA26-lacZ (Soriano, 1999), que confirmó la expresión en neuronas DA del SNpc y no en otros tipos celulares, como las neuronas serotoninérgicas del núcleo de Raphe (Supp. . Figura 1)


Las células y los ratones deficientes en ERCC1 son hipersensibles a la peroxidación de lípidos

Los ratones deficientes en ERCC1 tienen mayor estrés oxidativo y LPO.

El daño inducido por LPO en el ADN y las proteínas causa senescencia y necrosis en Ercc1 −/− células.

HNE induce un desequilibrio promutagénico en BER y TLS en Ercc1 −/− ratones.

Defensa antioxidante diferencial y producción de energía en Ercc1 −/− células.

La LPO contribuye al envejecimiento prematuro y la morbilidad.


ABSTRACTO

Una amplia gama de lesiones del ADN, tanto UV como inducidas químicamente, se tratan mediante la vía de reparación por escisión de nucleótidos (NER). Los defectos en NER dan como resultado síndromes humanos como xeroderma pigmen-tosum (XP), donde hay una incidencia 1000 veces mayor de cáncer de piel. La proteína ERCC1 es esencial para NER, pero los ratones knockout ERCC1 no son un modelo para XP. En ausencia de agentes que dañan el ADN exógeno, estos ratones se corren y mueren antes del destete, con poliploidía hepática acelerada dramáticamente y niveles elevados de p53. Aquí presentamos un estudio morfológico, inmunológico y molecular para comprender el mecanismo de la patología hepática inusual en ratones deficientes en ERCC1. Mostramos que los hepatocitos agrandados deficientes en ERCC1 se detienen en G2 y que tanto la replicación del ADN como el proceso normal de binucleación se reducen. Esto se asocia con un aumento independiente de p53 en la expresión del inhibidor de quinasa dependiente de ciclina p21. La característica más dramática del fenotipo hepático deficiente en ERCC1, la poliploidía acelerada, no es rescatada por la deficiencia de p53, pero mostramos que p53 es responsable de la reducción de la replicación y binucleación del ADN. Consideramos que el fenotipo hepático es una respuesta al daño del ADN endógeno no reparado, que puede reflejar una función adicional no relacionada con NER para la proteína ERCC1. — Núñez, F., Chipchase, MD, Clarke, AR, Melton, DW Escisión de nucleótidos la deficiencia del gen de reparación (ERCC1) causa G2 detención de los hepatocitos y reducción de la binucleación hepática: el papel de p53 y p21. FASEB J. 14, 1073–1082 (2000)

Las lesiones no reparadas del ADN pueden dar lugar a mutaciones, inestabilidad del genoma y carcinogénesis o muerte celular. La reparación por escisión de nucleótidos (NER) se ocupa de una amplia gama de lesiones, desde dímeros de timina inducidos por rayos UV y fotoproductos (6–4) hasta lesiones causadas por una variedad de agentes químicos (1, 2). La NER es un proceso de varios pasos que implica el reconocimiento de daños, la incisión doble de la hebra dañada, seguida de la eliminación de la lesión como parte de un oligonucleótido, el llenado de espacios y la ligadura de la hebra (1, 2). Los defectos en las proteínas involucradas en este mecanismo están asociados con tres trastornos humanos: xeroderma pigmentoso (XP), que se caracteriza por una alta incidencia de cáncer de piel en áreas del cuerpo expuestas al sol, síndrome de Cockayne (SC) y tricotiodistrofia (TTD). ERCC1 (gen 1 de complemento cruzado de reparación por escisión) fue el primer gen NER de mamífero que se clonó en virtud de su capacidad para complementar una línea celular de ovario de hámster chino sensible a los rayos UV (3). ERCC1 no corrigió el defecto de reparación en ninguna de las líneas celulares deficientes en NER humanas probadas (4, 5). Sin embargo, se sabe que el producto del gen ERCC1 juega un papel crítico en NER, donde actúa en un complejo con XPF para hacer una incisión 5 'en el sitio del daño (6). Esto llevó a la especulación de que las mutaciones en ERCC1 pueden ser letales para el desarrollo. Alternativamente, la deficiencia de ERCC1 puede estar asociada con un fenotipo humano diferente no representado entre las enfermedades conocidas por deficiencia de NER. Algunas proteínas NER, como XPB y XPD, tienen funciones adicionales no relacionadas con NER, y los defectos en estas se han relacionado con problemas neurológicos y otros problemas obviamente no relacionados con NER, como retraso en el desarrollo físico o sexual y cabello quebradizo, visto en algunos pacientes con XP, CS y TTD (revisado en la referencia 7). Existe evidencia de que ERCC1 también puede tener otras funciones clave. Sobre la base de estudios de homología (8, 9), se ha propuesto que el complejo ERCC1 / XPF desempeña un papel en la recombinación mitótica así como en la NER. Además, muchos mutantes ERCC1 y ERCC4 (XPF) son extremadamente sensibles a agentes, como la mitomicina C, que causan reticulaciones entre cadenas y se reparan mediante un proceso que implica recombinación homóloga (7). ERCC1 también se ha implicado en el procesamiento de intermedios de recombinación heterodúplex en células de mamíferos (10). Sin embargo, experimentos recientes sugieren que en células de ratón ERCC1 no es esencial para la reparación de enlaces cruzados entre cadenas mediada por recombinación, sino que puede tener un papel en el intercambio cromosómico dependiente de la fase S (11).

p53 se ha estudiado ampliamente en relación con la reparación del ADN y su papel en la regulación del ciclo celular. En la detección de daño en el ADN, los niveles de p53 se elevan a través de un aumento en la vida media de la proteína. p53 induce la transcripción de genes posteriores, como el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p21 (12), lo que resulta en la detención del ciclo celular tanto en G1/ S y G2/ M puntos de control en algunos tipos de células también puede conducir a la muerte celular apoptótica (13, 14). p53 y p21 también se han implicado en el envejecimiento celular: los niveles de p53 se acumulan a medida que envejecen los fibroblastos diploides, con un aumento correspondiente en los niveles de p21, que a su vez se correlacionan con una desaceleración del crecimiento celular (15, 16). Los fibroblastos de ratones nulos p21 no pueden detenerse en G1 después del daño del ADN (17, 18), y las células humanas deficientes en p21 muestran características similares (16, 19, 20). A partir de estudios de estas células humanas deficientes en p21, ha surgido otro papel para p21 en G medi-aado con p532 detención y acoplamiento de la síntesis de ADN y la mitosis (19, 20).

Contrariamente a algunas expectativas, la ausencia de ERCC1 no resultó en un fenotipo embrionario letal (21, 22). Sin embargo, a diferencia de los ratones knockout para XPA y XPC (23-25), los animales deficientes en ERCC1 no presentan el fenotipo típico asociado con XP. Nuestros ratones knockout para ERCC1 presentan una severa pérdida de peso al nacer y mueren antes del destete, probablemente debido a una insuficiencia hepática, con niveles elevados de p53 en el hígado, el cerebro y los riñones (21). La patología más llamativa se observó en el hígado, donde hubo un aumento espectacular del tamaño del núcleo de los hepatocitos. El análisis FACS mostró que esto se debía a núcleos con un contenido diploide (2n) superior al normal, con núcleos poliploides (4n, 8n) y aneu-ploides presentes (21). El aumento de la ploidía hepática normalmente solo se observa en ratones mayores (ver más abajo) y se han encontrado niveles aumentados de p53 en fibroblastos senescentes (15), por lo que el fenotipo en nuestros ratones deficientes en ERCC1 recuerda al envejecimiento prematuro. Queríamos entender cómo puede surgir tal fenotipo en ausencia de agentes exógenos que dañan el ADN. Una pista sobre la participación de la detención del ciclo celular en el fenotipo deficiente en ERCC1 provino de un informe de que se produjeron anomalías hepáticas similares en ratones que sobreexpresaban p21 en el hígado (26). También investigamos el papel de p53 en el fenotipo. Si los niveles elevados de p53 son responsables del aumento del contenido de ADN, entonces el fenotipo hepático deficiente en ERCC1 podría rescatarse en ratones deficientes tanto en ERCC1 como en p53. Realizamos estudios en ratones de 3 semanas de edad de los siguientes genotipos: tipo salvaje (wt), deficientes en ERCC1, deficientes en p53 y doble nulo. La edad de los ratones para este estudio fue determinada por el fenotipo severo de los animales deficientes en ERCC1, que no sobreviven más de 3 semanas (21). La incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (como marcador para la síntesis de ADN) y estudios morfológicos (medición del área nuclear y recuento de células binucleadas) de secciones de hígado se utilizaron para investigar el estado del ciclo celular de los hepatocitos. El área nuclear de los hepatocitos está directamente relacionada con el contenido de ADN (27, 28), y el área aumenta con la ploidía creciente a medida que los animales envejecen.


MATERIALES Y MÉTODOS

Ercc1ratones deficientes

La producción, mantenimiento y genotipado de Ercc1ratones deficientes (McWhir et al., 1993) yErcc1-Ratones deficientes con un Ercc1 transgén bajo el control del promotor del gen transtiretina (Selfridge et al., 2001), se han descrito previamente. Se extrajeron ARN y proteínas de tejidos de ratón y se analizaron para Ercc1 expresión por transferencia Northern y Western como se describió anteriormente (Selfridge et al., 2001).

Recolección de tejidos para histología

Los testículos y los ovarios se fijaron por inmersión, ya sea en Bouins durante 6 horas (ovarios) o 10 horas (testículos), o en formaldehído tamponado neutro (NBF) al 4% durante la noche a 4 ° C, o en Collidine durante la noche (solo testículos). Los tejidos fijados en Bouins o NBF se procesaron en cera de parafina utilizando un ciclo estándar de 16 horas. Los testículos fijados en Collidine se procesaron manualmente en Araldyte y se tiñeron con azul de toluidina al 1% que contenía bórax al 1% (BDH, Poole, Dorset, Reino Unido) a 60 ° C hasta que se obtuvo una intensidad de tinción adecuada (Kerr et al., 1993). Se tiñeron secciones (5 μm) de testículos fijados con Bouins con hematoxilina y eosina, o usando el método Apotag (Sharpe et al., 1998). Los epidídimos de ratones adultos se trituraron en medio de Biggers, Whitten y Whittingham (BWW) (Biggers et al., 1971) y se dejaron reposar durante 5 minutos antes de recuperar el sobrenadante, evitando los restos de tejido. Las células se resuspendieron a aprox. 3 x 10 6 células / ml en BWW, divididas en alícuotas y congeladas a -20 ° C.

Anticuerpos

El Dr. Hermann Schaegger (Universidad de Frankfurt) suministró amablemente un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína II del núcleo mitocondrial del complejo bovino III. Un anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad generado contra un péptido específico para la proteína de unión al ARN Dazl (Ruggiu et al., 1997Ruggiu et al., 2000) fue un regalo del Dr. Nicola Reynolds (MRC Human Genetics Unit, Edimburgo). El anticuerpo de Ercc1 de ratón se generó en un conejo contra una proteína recombinante marcada con His que contenía un fragmento central (aminoácidos 36-175) de Ercc1 de ratón (K.-T. Hsia y D. Melton, no publicado). El anticuerpo se purificó por afinidad a partir de suero crudo usando antígeno inmovilizado en una membrana de nitrocelulosa (Robinson et al., 1988). Los experimentos piloto con el anticuerpo Ercc1 encontraron que no se obtuvo ninguna señal inmunopositiva cuando se usaron testículos de tipo salvaje fijados con Bouins, por lo que todos los experimentos adicionales se llevaron a cabo utilizando testículos fijados en NBF.

Inmunohistoquímica

Brevemente, las secciones (5 µm) se montaron en portaobjetos recubiertos con 3-aminopropil trietoxisilano (Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, Reino Unido), se secaron durante la noche (50 ° C), se desparafinaron y se rehidrataron. Posteriormente, las secciones se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 30 minutos para bloquear la peroxidasa endógena, se lavaron una vez cada una (5 minutos) en agua destilada y TBS (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaCl al 0,85%) y se bloquearon durante 30 minutos. usando suero de conejo normal diluido en TBS (1: 5, NSS-TBS). Las secciones se incubaron con anticuerpo primario diluido en TBS (anti-Ercc1, 1 en 100 anti-Dazl, 1 en 100) durante la noche a 4ºC. Las secciones se lavaron dos veces en TBS (5 minutos cada una), se incubaron durante 30 minutos con inmunoglobulina de cerdo anti-conejo biotinilada, se diluyeron 1: 500 en NSS-TBS durante 30 minutos, luego se lavaron nuevamente en TBS (2 veces 5 minutos). Los anticuerpos unidos se detectaron de acuerdo con métodos estándar (Saunders et al., 2001). Las imágenes se capturaron usando un microscopio Olympus Provis (Olympus Optical Co., Londres, Reino Unido) equipado con una cámara Kodak DCS330 (Eastman Kodak, Londres, Reino Unido) y se ensamblaron en una computadora Macintosh PowerPC usando Photoshop 6 (Adobe).

Ensayo de cometas en ADN de esperma

El ensayo de electroforesis en gel de celda única alcalina (Comet) se realizó usando el kit CometAssay ™ de R & ampD Systems (Abingdon, Oxon., Reino Unido), adaptado como sigue. Las células se descongelaron a temperatura ambiente y se mezclaron 5 µl de células a ~ 3 x 10 6 / ml con 25 µl de agarosa de bajo punto de fusión (37 ° C). Esta suspensión celular se dejó caer luego en uno de los pocillos de un CometSlide (R & ampD Systems), se cubrió inmediatamente y se dejó reposar a 4 ° C. Se retiraron los cubreobjetos y se lisaron las células en SDS al 0,75% (p / v) (Sigma, Poole, Dorset, Reino Unido) y DMSO al 1% (v / v) (Sigma) en la solución de lisis suministrada con el kit durante 30 minutos a 37ºC. ° C. La solución de lisis se reemplazó con una solución alcalina [NaOH 0,3 M, EDTA 1 mM (Sigma) y 20 μg / ml de proteinasa K (Amresco-Anachem Ltd., Luton, Bedfordshire, Reino Unido)] durante 30 minutos a 4 ° C para desnaturalizar el ADN. Los portaobjetos se colocaron en un tanque de electroforesis horizontal lleno de tampón de electroforesis alcalino (NaOH 300 mM, EDTA 1 mM, pH 12,3), se dejaron durante 20 minutos, se sometieron a electroforesis durante 10 minutos a 25 V (300 mA) y se deshidrataron en metanol helado ( 100% - 5 minutos), luego etanol (100% - 5 minutos) y se deja secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se tiñeron usando 20 µl por pocillo de bromuro de etidio (15 µg / ml Sigma) y se cubrieron. Los portaobjetos se observaron utilizando un microscopio Leitz DMRB equipado con un bloque de filtro N2.1, que proporciona un filtro de excitación de 515-560 nm a partir de una lámpara de mercurio de 50 W y un filtro de barrera de 580 nm. Las células se analizaron utilizando el software Komet 4 (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, Reino Unido).

Análisis de HPLC de ADN de testículo

La HPLC de ADN de muestras de testículo frescas y congeladas se realizó como se describe (Selfridge et al., 2001).


Estadísticas Estadísticas

Si necesita asesoramiento médico, puede buscar médicos u otros profesionales de la salud que tengan experiencia con esta enfermedad. Puede encontrar estos especialistas a través de organizaciones de defensa, ensayos clínicos o artículos publicados en revistas médicas. También es posible que desee ponerse en contacto con una universidad o centro médico terciario en su área, porque estos centros tienden a ver casos más complejos y cuentan con la última tecnología y tratamientos.

Si no puede encontrar un especialista en su área local, intente comunicarse con especialistas nacionales o internacionales. Es posible que puedan derivarlo a alguien que conozcan a través de conferencias o esfuerzos de investigación. Algunos especialistas pueden estar dispuestos a consultar con usted o con sus médicos locales por teléfono o por correo electrónico si no puede viajar a ellos para recibir atención.

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Recursos de cuidado a la salud

  • Para encontrar un profesional médico que se especialice en genética, puede pedirle a su médico una remisión o puede buscar uno usted mismo. Los directorios en línea son proporcionados por el Colegio Americano de Genética Médica y la Sociedad Nacional de Consejeros Genéticos. Si necesita ayuda adicional, comuníquese con un especialista en información de GARD. También puede obtener más información sobre las consultas genéticas en MedlinePlus Genetics.

4. Discusión

El envejecimiento es un proceso complejo que involucra numerosas vías y componentes tanto genéticos como ambientales [[64], [65], [66], [67], [68], [69]]. Los procesos biológicos que impulsan el proceso de envejecimiento contribuyen a la etiología de la mayoría de las enfermedades crónicas que incluyen: 1) inflamación crónica, & # x0201c estéril & # x0201d 2) cambios macromoleculares en proteínas, carbohidratos, lípidos, mitocondrias y ADN 3) disfunción de células madre y progenitoras y 4) aumento de la senescencia celular [5,70]. Estos procesos están vinculados en el sentido de que las intervenciones que se dirigen a uno parecen atenuar otras. Por ejemplo, las células senescentes se acumulan con la edad y en los sitios de patogénesis en las enfermedades crónicas [5,70]. La reducción de la carga de células senescentes puede conducir a una reducción de la inflamación, una disminución de la disfunción macromolecular y una mejora de la función de las células madre / progenitoras [1, 3, 19]. Las células madre adultas también se vuelven disfuncionales con la edad, mostrando evidencia de senescencia [71]. Anteriormente demostramos que la combinación de dasatinib y quercetina funciona como un senolítico en vivo, aliviando muchas enfermedades relacionadas con la edad [26,30]. Debido a la actividad senoterapéutica de la quercetina, examinamos otros flavonoides naturales en busca de efectos sobre las células senescentes con la esperanza de mejorar la eficacia terapéutica.

Aquí, demostramos que cuando se probó contra un panel de otros flavonoides, la fisetina tuvo los efectos senoterapéuticos más potentes en varios tipos de células. in vitro y mostró fuertes efectos anti-gerónicos en vivo. Demostramos que el tratamiento agudo (oral) o crónico (dietético) de ratones progeroid y WT con fisetina reduce los marcadores de senescencia y el fenotipo secretor asociado a la senescencia en múltiples tejidos (Fig.3 AD, & # x200B AD, 4A, 4 A, & # x200B A, 5F-I). 5 F-I). Estos datos se recopilaron en dos laboratorios utilizando ratones progeroid y WT en dos antecedentes genéticos distintos. Específicamente, p16 Ink4a -expresando CENP-B + madre / progenitora mesenquimatosa, linfocitos T, asesino natural y células endoteliales se eliminaron de la grasa subcutánea de ratones viejos, pero no macrófagos activados de tipo senescente o células dendríticas. El efecto de la fisetina fue mayor en p16 Ink4a -expresando celdas que en p21 CIP1 -células que expresan, al menos en la grasa subcutánea (Fig. 4). Nuestros hallazgos revelan que la fisetina se dirige a múltiples, pero no a todos los tipos de células senescentes en vivo. Además, al reducir el porcentaje de células senescentes, la fisetina reduce la expresión de marcadores de senescencia en múltiples órganos medidos por qPCR. Esto da como resultado una homeostasis tisular mejorada y una reducción de múltiples patologías relacionadas con la edad, de acuerdo con los efectos sobre un proceso fundamental de envejecimiento.

El hecho de que la fisetina redujera la fracción de células T y NK senescentes podría ayudar a amplificar los efectos beneficiosos de la fisetina, ya que las células inmunitarias sanas son importantes para eliminar las células senescentes [72,73]. De manera similar, la fisetina reduce los marcadores de inflamación y estrés oxidativo (Figs. 3 F-G y & # x200B y 5L-M), 5 L-M), de acuerdo con la literatura anterior [45]. Esto también podría contribuir a la reducción de los marcadores de senescencia. La disminución de estos marcadores se observó en los tejidos recolectados varios días después de completar la administración de fisetina. Dado que las semividas rápida y terminal de la fisetina son 0,09 y 3,1 & # x0202fh respectivamente [74], estas mejoras no dependieron de la presencia continua de fisetina circulante. Esto es más consistente con la fisetina que provoca la eliminación de las células senescentes, que tardan días o semanas en formarse después de una agresión (al menos en cultivo), que con los efectos ejercidos por la ocupación continua de un receptor o los efectos sobre una enzima. Sin embargo, es importante señalar que dadas las múltiples actividades reportadas de flavonoides como la fisetina, también es posible que la extensión de la vida útil se deba a mecanismos además de la reducción de la senescencia, como la alteración del microbioma intestinal [75].

Fisetin extiende la vida útil replicativa de S. cerevisiae en un 55% [76] y la vida útil de D. melanogaster en un 23% [77]. Aquí, mostramos por primera vez un efecto similar en animales vertebrados. La exposición crónica a fisetina mejora la vida útil y extiende la vida media y máxima de los ratones. Es importante destacar que en nuestro estudio se inició la suplementación con fisetina en ratones & # x0003e20 & # x0202f meses de edad. Esto aumenta el potencial traslacional de nuestro estudio, ya que las intervenciones senoterapéuticas se administran de manera más factible en humanos de edad avanzada después de la aparición de enfermedades relacionadas con la edad, en lugar de en sujetos asintomáticos más jóvenes, en los que cualquier efecto secundario sería inaceptable.

La fisetina es un miembro de la familia de los flavonoides, una familia de compuestos polifenólicos naturales. La fisetina, un antioxidante alto equivalente a Trolox, está presente en concentraciones bajas en muchas frutas y verduras como manzanas, caquis, uvas, cebollas y pepinos, y en concentraciones más altas en las fresas [43, 44]. La ingesta dietética promedio de fisetina natural en Japón es de aproximadamente 0.4 & # x0202fmg / día [78,79], aparentemente sin efectos adversos. La fisetina tiene actividad anticancerígena y parece bloquear la vía PI3K / AKT / mTOR [80]. Anteriormente encontramos que la interrupción transitoria de la vía PI3K / AKT por interferencia de ARN conduce a la muerte de las células senescentes [30], al igual que con otros SCAP que defienden las células senescentes de su propia SASP proapoptótica [28, 29]. La fisetina, como algunos otros flavonoides, es un inhibidor de la topoisomerasa, que también puede contribuir a su actividad anticancerosa [81]. Aumenta la actividad catalítica de hSIRT1 al menos in vitro [76]. También in vitro, la fisetina inhibe la actividad de varias citocinas proinflamatorias, incluyendo TNF & # x003b1, IL-6 y el factor de transcripción NF - & # x003baB [82]. La fisetina tiene actividad directa como agente reductor, reaccionando químicamente y neutralizando las especies reactivas de oxígeno [83,84]. La fisetina elimina los radicales libres como resultado de su capacidad de donación de electrones, que se debe a la presencia de dos grupos hidroxilo en un anillo y un tercer grupo hidroxilo en otro anillo. La fisetina también regula al alza la síntesis de glutatión, un antioxidante endógeno [43,82]. Otras actividades biológicas incluyen efectos antihiperlipidémicos [[84], [85], [86]], antiinflamatorios [85] y neurotróficos [87], algunos de los cuales podrían estar mediados por una reducción en la carga de células senescentes, particularmente porque cuando se administra de forma intermitente, la fisetina alivia la disfunción a pesar de su corta vida media de eliminación, más consistente con la eliminación de células senescentes que con la acción sobre un receptor o enzima que requiere la presencia continua del fármaco.

La estructura química de la fisetina es casi la misma que la de la quercetina, excepto por un grupo hidroxilo en la posición 5. Por lo tanto, es muy probable que estos dos compuestos estrechamente relacionados ejerzan muchos efectos similares. Curiosamente, la química médica preliminar de la fisetina ha identificado análogos con una actividad senoterapéutica mejorada, lo que sugiere que se pueden desarrollar flavonoides aún más efectivos para extender la vida útil con alteraciones menores en la estructura de la fisetina.

Dado que la fisetina es un producto natural que se encuentra en los alimentos comunes y está disponible como un suplemento dietético oral y no se han informado efectos secundarios adversos [45], nuestros datos preclínicos sugieren que la fisetina debería ser traducible de manera inminente y podría tener un beneficio significativo para la salud. de pacientes ancianos. Con base en estos estudios con ratones, se están llevando a cabo ensayos clínicos para evaluar los beneficios a corto plazo del tratamiento intermitente con fisetina en ciertos aspectos del envejecimiento, como la fragilidad.


Abstracto

Fondo: El complejo de endonucleasa ERCC1 / XPF de estructura específica que contiene las subunidades ERCC1 y XPF está implicado en la reparación de dos tipos distintos de lesiones en el ADN: reparación por escisión de nucleótidos (NER) para lesiones inducidas por rayos ultravioleta y aductos químicos voluminosos y reparación por recombinación de la enlaces cruzados entre cadenas muy genotóxicos.

Resultados: A continuación, presentamos un análisis detallado de dos tipos de ratones con mutaciones en ERCC1, uno en el que el gen está "desactivado" y otro en el que la proteína codificada contiene un truncamiento carboxi-terminal de siete aminoácidos. Además de los síntomas de runting severo, anomalías de los núcleos del hígado y una vida útil muy reducida (que parecía menos grave en el mutante de truncamiento), ambos tipos de ERCC1-El ratón mutante mostró ausencia de grasa subcutánea, inicio temprano de la deposición de ferritina en el bazo, disfunción renal, anomalías graves de ploidía e invaginaciones citoplasmáticas en núcleos de hígado y riñón, y NER comprometida y reparación de enlaces cruzados. También encontramos que la heterocigosidad para ERCC1 las mutaciones no parecieron proporcionar una ventaja selectiva para la tumorigénesis inducida químicamente. Una pista importante sobre la causa de la muy grave ERCC1fenotipos mutantes es nuestro hallazgo de que ERCC1-Las células mutantes experimentan una senescencia replicativa prematura, a diferencia de las células de los ratones con un defecto solo en la NER.

Conclusiones: Nuestros resultados sugieren fuertemente que la acumulación en ERCC1-Ratones mutantes de enlaces cruzados entre cadenas de ADN generados endógenamente, que normalmente se reparan mediante reparación de recombinación dependiente de ERCC1, subyacen tanto al inicio temprano de la detención del ciclo celular como a la poliploidía en el hígado y el riñón. Por lo tanto, nuestro trabajo proporciona una idea de la base molecular del envejecimiento y destaca el papel de ERCC1 y los enlaces cruzados de ADN entre cadenas.

G Weeda, I Donker, J de Wit, R Janssens, D Bootsma y JHJ Hoeijmakers, Departamento de Biología Celular y Genética, Centro de Genética Médica, Universidad Erasmus, Rotterdam P.O. Box 1738, 3000 DR Rotterdam, Países Bajos.

H Morreau, Departamento de Patología, Hospital Universitario de Leiden, Leiden P.O. Box 9600, 2300 RC Leiden, Países Bajos.

CJ Vissers y A Nigg, Departamento de Patología, Universidad Erasmus, 3000 DR Rotterdam, Países Bajos.

H van Steeg, Laboratorio de Investigación de Efectos sobre la Salud, Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente, P.O. Box 1, 3720 BA Bilthoven, Países Bajos.

Dirección de correo electrónico de JHJ Hoeijmakers (autor correspondiente): [email & # 160protected]


¿Qué significa Ercc1 - / - / DAT-Cre +? - biología

Buscamos evaluar el valor pronóstico / predictivo de ERCC1 y XPF en pacientes con carcinoma nasofaríngeo no metastásico (CPN) tratados con intención curativa.

Métodos y materiales

La expresión de las proteínas ERCC1 y XPF se evaluó mediante inmunofluorescencia combinada con análisis cuantitativo automatizado (AQUA) utilizando los anticuerpos FL297 y 3F2, respectivamente. Los niveles de expresión de las proteínas ERCC1 y XPF se correlacionaron con los resultados clínicos.

Resultados

Las características de los pacientes fueron las siguientes: edad media 52 años (rango, 18-85 años), 67% hombres, 72% estado funcional de Karnofsky (KPS) ≥90%, tipo 1/2/3 de la Organización Mundial de la Salud (OMS) = 12% / 28% / 60%, estadio III / IV 65%. Con una mediana de seguimiento de 50 meses (rango, 2,9 a 120 meses), la supervivencia global (SG) a 5 años fue del 70,8%. Las puntuaciones medias de AQUA nucleares estandarizadas se utilizaron como puntos de corte para la expresión de proteínas ERCC1 (n = 138) y XPF (n = 130). La concordancia entre las puntuaciones dicotomizadas de ERCC1 y XPF fue alta en 79,4% (kappa = 0,587, PAG& lt.001). Ninguno de los biomarcadores predijo la recidiva locorregional, la SSE o la SG después del ajuste por edad y KPS, independientemente de la estratificación por estadio, tipo de OMS o tratamiento.

Conclusiones

Ni ERCC1 ni XPF, analizados por inmunohistoquímica cuantitativa utilizando los anticuerpos FL297 y 3F2, fueron pronósticos o predictivos en esta cohorte de pacientes con NPC.


Senescencia prematura inducida por estrés

Síndrome de Werner

El síndrome de Werner (SW) es un síndrome progeroide segmentario con características de envejecimiento acelerado, y la mayoría de los pacientes con SW mueren de cáncer o enfermedad cardíaca a los 40 o 50 años [86,87]. El SW es ​​causado por una mutación genética que conduce a una deficiencia en la proteína conocida como helicasa dependiente de ATP (WRN) del síndrome de Werner [86]. La WRN desempeña un papel clave en los procesos homeostáticos del ADN, incluida la recombinación, la replicación y la reparación [88]. Nyunoya y col. encontraron que los fibroblastos pulmonares extraídos de fumadores y de aquellos con enfisema severo exhiben un fenotipo senescente, acompañado de una expresión reducida de WRN [89]. Más tarde demostró que la exposición a CSE puede regular directamente a la baja la expresión de la proteína WRN en fibroblastos cultivados y células epiteliales. Curiosamente, también mostró que los fibroblastos deficientes en WRN son más susceptibles a la senescencia celular inducida por el humo del cigarrillo, lo que conduce a una migración celular deteriorada. Este fenotipo es rescatado por la sobreexpresión exógena de WRN. Además del humo del cigarrillo, otros componentes del tabaquismo, incluidos los subproductos aldehídicos de las reacciones de oxidación (acroleína) y H2O2 también disminuyen la expresión de la proteína WRN en fibroblastos a las 24 horas de exposición. Juntos, estos datos sugieren que el humo del cigarrillo puede perturbar la reparación pulmonar al alterar la vía relacionada con WRN, haciendo que estas células adquieran el fenotipo de "senescencia".


DISCUSIÓN

Aquí presentamos una caracterización detallada de la endonucleasa XPF-ERCC1 humana utilizando un sustrato de tallo-bucle modelo que permitió definir los requisitos mínimos de sustrato para una incisión de un solo sitio y la unión del complejo XPF-ERCC1 a una estructura de unión de ADN. Usamos estos datos para desarrollar el primer ensayo basado en fluorescencia en tiempo real para la actividad de XPF-ERCC1 humana, con el potencial de facilitar un cribado de alto rendimiento para moduladores de moléculas pequeñas de XPF-ERCC1. La utilidad de tales inhibidores químicos de XPF-ERCC1 sería mejorar la eficacia de los regímenes de tratamiento con fármacos basados ​​en cisplatino (37, 38).

Huella XPF-ERCC1 en el dúplex de la estructura de vástago-bucle

Gran parte de nuestra comprensión de la interacción del sustrato por los XPF proviene de estudios estructurales y bioquímicos de homodímeros de arqueas que reconocen y escinden las estructuras de ADN con un dúplex aguas abajo, como las aletas 3 'y las uniones de Holliday melladas. Los modelos derivados de estos estudios predicen que el (HhH)2 Los dominios de ambos protómeros XPF unen ~ 5 pb de ADN dúplex corriente arriba y corriente abajo de la unión, y se requieren 5 pb adicionales para extenderse hacia la hendidura catalítica (16, 17). Esto explica el requisito observado de un dúplex de 10 pares de bases para realizar una incisión. Sin embargo, la segunda horquilla del XPF humano (HhH)2 El dominio está degenerado y no se ha demostrado unión al ADN. En contraste, el ERCC1 altamente conservado (HhH)2 El dominio es capaz de unirse al ADN de tallo-bucle (18), y es probable que haya retenido el modo de unión dúplex ascendente predicho por el A. pernix estructura cristalina (16). Además, recientemente hemos encontrado un modo similar de compromiso de ADN de doble cadena para el complejo homólogo FancM-Faap24 (Coulthard et al., manuscrito enviado). Anticipamos que la huella de 10 pb en el dúplex que se ve aquí comprendería el ERCC1 (HhH)2 domain binding the upstream 5 bp combined with sufficient DNA to enter the catalytic site of XPF ( Figure 5) as described in Tripsianes et al. ( 26).

Proposed model for stem–loop substrate recognition by XPF–ERCC1. The XPF protomer has a red outline, and ERCC1, grey outline. The domain colouring is as Figure 1: (HhH)2 domains green, nuclease or nuclease-like domains mauve and HLD blue. (A) The XPF–HLD binds to the junction containing single-strand stretches greater than six bases and the hairpins of ERCC1 occupy five bases of the duplex. (B) A domain movement occurs resulting in bending of the DNA, and the nuclease domain of XPF engages the duplex downstream from the ERCC1 (HhH)2 dominio. A pocket in the catalytic centre of XPF becomes occupied by the base 5′ to the scissile phosphate, and cleavage occurs. (C) After incision the complex is released from the substrate. (D) Failure of cleavage due to lack of entry of an appropriate base into the binding pocket, results in the complex remaining bound and slow dissociation from the substrate.

Proposed model for stem–loop substrate recognition by XPF–ERCC1. The XPF protomer has a red outline, and ERCC1, grey outline. The domain colouring is as Figure 1: (HhH)2 domains green, nuclease or nuclease-like domains mauve and HLD blue. (A) The XPF–HLD binds to the junction containing single-strand stretches greater than six bases and the hairpins of ERCC1 occupy five bases of the duplex. (B) A domain movement occurs resulting in bending of the DNA, and the nuclease domain of XPF engages the duplex downstream from the ERCC1 (HhH)2 dominio. A pocket in the catalytic centre of XPF becomes occupied by the base 5′ to the scissile phosphate, and cleavage occurs. (C) After incision the complex is released from the substrate. (D) Failure of cleavage due to lack of entry of an appropriate base into the binding pocket, results in the complex remaining bound and slow dissociation from the substrate.

Role for XPF–HLD in catalytic activity and substrate binding

In our study, highly pure preparations of recombinant Δ640 XPF–full lengthERCC1 complex lacking the HLD were found to be catalytically inactive. However, a previous study concluded that a shorter recombinant Δ666 XPF–Δ95ERCC1 complex (lacking the HLD and a connecting linker to the catalytic domain) exhibited some structure-specific nucleolytic activity in a gel-based assay, despite the absence of a control for non-specific nuclease activity ( 19). The discrepancy between our results and those of Tsodikov et al. ( 19) might be explained by the differences in the XPF truncation mutants used. One explanation could be that the acidic linker spanning residues (641–666) present in our Δ640 XPF–ERCC1 complex may inhibit activity by binding DNA or blocking the catalytic site. Alternatively, we cannot rule out the possibility that a contaminating bacterial nuclease in Δ666 XPF–Δ95ERCC1 complex preparations was responsible for the observed nucleolytic activity given the long incubation periods (30 min to 11 h).

Our findings suggest a model where the stem loop is bound and possibly distorted by the XPF–HLD into a more favourable conformation for engagement of the ERCC1 (HhH)2 and XPF nuclease domains with the upstream duplex and the junction, respectively ( Figure 5). Although XPF–HLD binds both single-strand and duplex DNA weakly, a 4-fold increased binding was observed on the stem–loop substrate and consequently there may be two binding sites each accommodating duplex or single-strand DNA which co-operate to bind and possibly distort the DNA around the junction. The tighter binding displayed by the full-length complex (KD 2 nM) could be due to co-operativity between the XPF–HLD (KD 60–70 nM, Figure 5) and the C-terminal complex, which have previously been shown bind a stem–loop in an electromobility-shift assay with an apparent KD of 39 ± 13 µM ( 18).

There are no structures available for the nuclease domain of XPF bound to DNA and little is known about how the DNA is led into the active site. This may be because substrate binding within the catalytic centre requires remodelling of the substrate or stabilization of the core endonuclease domains on the DNA by the XPF–HLD. A remodelling role has been described for crenarchael PCNA which is required to interact with XPF for activity, and co-operates with XPF to bind and kink the DNA ( 39). The structure of the A. pernix XPF bound to duplex DNA suggests that the duplex downstream from a nick would need to bend by 90° in order to make contact with the HhH2 domains of both protomers ( 16). A similar mechanism of DNA discontinuity recognition was demonstrated in the structures of Fen1 and its homologue Exo1 bound to their substrates. These proteins recognized a distortion caused by a nick in duplex DNA and this enabled binding to both upstream and downstream regions via domains conserved in this superfamily, resulting in a bend angle of 100° ( 40, 41). The ATPase activity of the N-terminal helicase domain of Hef is stimulated by fork DNA, and its presence increases the incision activity of the core nuclease and (HhH)2 domains ( 42). Since human XPF–HLD does not require ATP for incision activity, alterations to the DNA structure could result from DNA binding and subsequent protein domain movements. Stable binding and distortion of the DNA structure would allow limited movement of the core domains on the duplex so that the catalytic domain is positioned at an optimal sequence and would explain why multiple incisions are made in longer duplexes. Re-incision of the same substrate is unlikely to be responsible for incisions further upstream from the junction because the same pattern of cleavage is maintained on 3′-labelled stem–loops ( 2, 32).

Substrate interactions at the XPF active site

It is not known whether the DNA enters the XPF catalytic site as a duplex or is separated into single strands. Single-strand DNA-binding regions have been identified in both the XPF nuclease and ERCC1 nuclease-like domains, which could interact with the nucleotides downstream from the scissile phosphate ( 26, 27). A hydrophobic patch was described in the A. pernix model, which could accommodate single-strand DNA ( 16). These regions may stabilize an intermediate resulting from opening of the duplex from the junction so that the DNA enters the catalytic site as a single strand. The (HhH)2 domains of both protomers of the Hef homodimer were shown to mediate opening of the duplex in a potassium permanganate footprinting study containing tracts of TA base pairs at the junction of the structure ( 17). The structures of the Fen1 and Exo1 5′-flap nucleases with their substrates revealed that a terminal T in the incised strand of the 5′-flap is unpaired by superfamily conserved domains in order to engage the scissile phosphodiester bonds with the two metal ion catalytic site and seven highly conserved carboxylates ( 40, 41). The Fen1 homologues cleave 1 nt into the duplex, in contrast to XPF, which incises the phosphodiester bond between the second and the third nucleotide suggesting XPF would need to separate the terminal 2 bp. The duplex terminus of the substrates used for the Fen1 structures contained a TA pair in contrast to the stem–loop exploited for XPF–ERCC1 which has a more stable GC pair. Opening of the duplex by the XPF–HLD might occur as a result of DNA bending, or by pushing a wedge or pin into the duplex terminus. However, we were unable to demonstrate opening at the junction by potassium permanganate footprinting or 2-aminopurine fluorescence studies (data not shown). Therefore, it cannot be ruled out that the duplex remains intact at the DNA junction and the scissile base is flipped out. In a previous study in which the duplex at the junction was crosslinked by a psoralen interstrand crosslink, incisions by XPF–ERCC1 showed that they occurred at the same position as uncrosslinked duplex supporting an intact duplex model ( 33). In this case, the duplex may enter the active site intact and become distorted in such a way as to flip a base into a binding pocket in the XPF nuclease domain. This would explain the apparent reliance of incision rate on the stability of the base pair at X. The bases at X/Xc may be separated by a component of the XPF catalytic domain entering the duplex to flip out the base. A candidate for this is the R689 of XPF, which is absolutely required for activity ( 25). The equivalent R26 in A. pernix was part of a functionally important region of the catalytic site and not directly involved in catalysis or protein folding ( 16). It was postulated to bind to assist in anchoring the backbone of the DNA at the junction but it may be important for intercalating into the duplex and distortion of the duplex or base flipping.

Implications for cellular XPF–ERCC1 substrates

It is unclear what role sequence preferences displayed here by XPF–ERCC1 might play in NER as filling in of the excised patch replaces lost bases, but it may be significant for other processes that XPF–ERCC1 is involved with in the cell. For instance, it may serve to regulate the activity of XPF–ERCC1 on GC rich regions of the genome, or have a role in directing incisions of the TTAGGG 3′-telomere overhangs. In a cellular context, structures that XPF–ERCC1 cleaves includes bubbles, flaps, splayed arm and overhangs and possibly more complex structures depending on the process. The local cellular conditions will affect the activity of XPF–ERCC1 en vivo and evidently it co-operates with many other protein partners in carrying out its endonucleolytic function in NER, ICL repair and other genome maintenance processes. The accepted model stem–loop substrate used in our present studies has enabled us to examine the conditions under which one incision was made and appears to be a good surrogate for the distorted physiological junction substrates presented to XPF–ERCC1 within a cell nucleus.