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¿Qué es la cromatografía de ADN-celulosa?

¿Qué es la cromatografía de ADN-celulosa?



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Estoy revisando un artículo en el que han realizado cromatografía de ADN-celulosa para estudiar la interacción entre proteínas y ADN. Están agregando la proteína a la columna y eluyendo con alta concentración de sal.


La cromatografía de ADN-celulosa se usa para purificar proteínas que se unen al ADN (Potuzak y Dean 1978, Abdullah et al., 1985).

La idea detrás de esto es bastante simple: adhieres ADN a una matriz de celulosa y mantienes las condiciones para que el ADN no se disocie de la celulosa. Esta fase estacionaria se utiliza luego como cebo para las proteínas de unión al ADN de la fase móvil. Las proteínas de unión al ADN purificadas se pueden disociar posteriormente de la columna con altas concentraciones de sal.

El método fue (hasta donde yo sé) descrito por primera vez por Litnam (1968) quien lo utilizó para extraer una polimerasa de ADN de Micrococcus luteus.


Una variedad fascinante de proteínas debe interactuar con el ADN dentro de la célula para hacer posible procesos genéticos básicos como la replicación y reparación del ADN, la recombinación del ADN, la expresión genética selectiva y la transcripción del ARNm. Antes de que la función de los genes pueda definirse con precisión a nivel molecular, muchas de estas proteínas asociadas al ADN deberán aislarse y caracterizarse individualmente. Hemos desarrollado un método general que debería facilitar dichos análisis. Este método, que llamamos "cromatografía de ADN-celulosa", se basa en el hecho de que muchas de las proteínas que funcionan en el ADN dentro de la célula se unen estrechamente al ADN con fuerzas iónicas fisiológicas in vitro. A concentraciones de sal más altas, estas proteínas se liberan de forma reversible del ADN, aparentemente en un estado intacto. Las proteínas previamente caracterizadas con tales propiedades de unión incluyen la E. coli ARN polimerasa (J. R. Richardson, 1966b Pettijohn y Kamiya, 1967) y represores de lactosa y fagos λ (Gilbert y Muller-Hill, 1967.

↵ * Este trabajo se inició mientras uno de nosotros (B. M. A.) tenía una beca posdoctoral de la National Science Foundation (1965-1966) en el Institut de Biologie Moleculaire, Ginebra, Suiza. Se ha publicado un informe preliminar (Alberts, 1968).


Cromatografía de afinidad de ADN de secuencia específica: aplicación de un adsorbente específico de grupo para el aislamiento de endonucleasas de restricción

El uso de adsorbentes de afinidad de ADN específicos de secuencia para el aislamiento de endonucleasas de restricción. EcoRI y SphSe ha informado de casi homogeneidad. Sin embargo, el alto costo de estos adsorbentes es un factor limitante para su aplicación más amplia. Este artículo informa sobre la aplicación de ligandos de afinidad de ADN específicos de secuencia que contienen secuencias de reconocimiento para 34 endonucleasas de restricción como ligandos específicos de grupo en el aislamiento de endonucleasas de restricción. Muestras crudas de seis endonucleasas de restricción, a saber BshFI, BamHOLA, SmaI, SacoII, PvuII y SalSe demostró que I se unía a estos adsorbentes y podía eluirse a diferentes concentraciones de KCl. Se obtuvieron altos factores de purificación y recuperaciones. Endonucleasa de restricción BshFI, un isosquizómero de HaeIII, del microorganismo Bacillus sphaericus se purificó hasta casi la homogeneidad empleando un procedimiento de dos etapas que implica cromatografía de ADN-celulosa y cromatografía de afinidad oligonucleótido-ligando. La enzima existe como un monómero con una masa molecular relativa aparente de 34 000, determinada por electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio y cromatografía de exclusión por tamaño.


Una proteína de unión al ADN inducida por el bacteriófago T7

Se ha purificado una proteína de unión al ADN a partir de Escherichia coli infectado con bacteriófago T7 mediante cromatografía de ADN-celulosa. La proteína está ausente en las células no infectadas. La proteína purificada tiene un peso molecular de 31.000 y se une fuerte y preferentemente al ADN monocatenario. In vitro Los estudios muestran que esta proteína puede estimular la velocidad de polimerización catalizada por la ADN polimerasa inducida por T7 de 10 a 15 veces en condiciones en las que la polimerasa no puede utilizar eficazmente una plantilla monocatenaria. El grado de estimulación depende de la relación entre la proteína de unión y la plantilla de ADN y es independiente de la concentración de polimerasa.

La estimulación observada es específica para la ADN polimerasa T7 en la adición de la proteína a las reacciones catalizadas por E. coli Las ADN polimerasas I, II o III o la ADN polimerasa T4 no tienen efecto.


Macromolécula similar al receptor de 1,25-dihidroxivitamina D3 en líneas celulares de sarcoma osteogénico de rata

El metabolito hormonal de la vitamina D3, 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25 (OH) 2D3), ejerce sus efectos biológicos al unirse inicialmente a una proteína receptora citosólica. Se ha demostrado una proteína de este tipo en los órganos diana de la vitamina D3, incluido el hueso. Aunque el papel de la 1,25 (OH) 2D3 en el esqueleto se ha estudiado extensamente en el hueso normal, no se sabe nada acerca de sus efectos, si los hay, en el crecimiento óseo anormal. El sarcoma osteogénico de rata es un modelo útil para la malignidad ósea. Las células tumorales conservan funciones diferenciadas, incluida la capacidad para formar hueso y responder a la hormona paratiroidea, las prostaglandinas y, en menor medida, a la calcitonina con aumentos en los niveles de AMP cíclico. Aquí hemos evaluado líneas celulares de sarcoma osteogénico para determinar la presencia de un receptor para 1,25 (OH) 2D3. Hemos utilizado sedimentación en gradiente de sacarosa, análisis de saturación y cromatografía de ADN-celulosa. Las preparaciones de citosol de estas líneas celulares contienen una macromolécula saturable 3,3 S que se une a 1,25 (OH) 2D3 con especificidad y alta afinidad (Kd = 2 x 10 (-10) M). El complejo esterol-macromolécula se une al ADN-celulosa y su perfil de elución de esta resina de afinidad es similar al del receptor 1,25 (OH) 2D3 de hueso normal de rata. Estas células tumorales deberían servir como un modelo útil para estudiar la acción de la 1,25 (OH) 2D3 en el hueso y el papel de este metabolito en la biología de la malignidad ósea.


A. S. Sadykov, F. I. Ershov y otros, Interferon Inductors [en ruso], Tashkent (1978).

F. I. Ershov y A. S. Novokhatskii, Interferon and Its Inductors [en ruso], Moscú (1981).

V. D. Solov'ev y T. A. Bektemirov, Interferón en la teoría y práctica de la medicina [en ruso], Moscú (1970).

K. Cantell y S. Hirvonen, J. Gen. Virol.,39, 541 (1978).

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R. G. Parsons, P. H. Aldenderfer y R. Kowal, J. Natl. Cancer Inst.,63, N ° 1, 43 (1979).


Dos receptores de progesterona en el oviducto de la tortuga de agua dulce Chrysemys picta: posible homología con los sistemas de receptores de progesterona de mamíferos y aves

Dos receptores de progesterona en el oviducto de la tortuga de agua dulce Chrysemys picta: posible homología con los sistemas de receptores de mamíferos y aves. Aquí presentamos la caracterización de dos receptores de progesterona específicos en extractos nucleares del oviducto de tortuga. Los receptores difieren en las constantes de disociación (2,8 nM frente a 27 nM) que pueden separarse en DEAE-Sepharose, el primero eluyendo a KCl 0,08 M ​​y el último a KCl 0,20 M. El marcado por fotoafinidad [3H] R5020 SDS-PAGE reveló que el resto 2,8 nM migra con un peso molecular aparente de 80 +/- 5 kDa y el resto 27 nM migra con un peso molecular aparente de 120 +/- 5 kDa. Estos receptores se denominan PR-A y PR-B debido a su masa molecular y perfiles de elución. Los estudios cromatográficos de ADN-celulosa muestran que ambos se unen al ADN-celulosa con el PR-A eluyendo en NaCl 0,09 M y el PR-B eluyendo entre NaCl 0,20-0,21 M. En tortugas reproductivamente inactivas (de los meses de enero y febrero) el estradiol es indetectable y PR-B está ausente según lo determinado por análisis de Scatchard, estudios electroforéticos de etiquetado de fotoafinidad [3H] R5020 y cromatografía de DEAE-Sepharose y ADN-celulosa. En estos animales, el PR-B se puede reponer mediante el tratamiento con estrógenos, lo que sugiere un papel fisiológico tanto para el PR-A como para el PR-B y la dependencia del PR-B del estradiol.


Un receptor de andrógenos de alta abundancia en el cerebro de un pez dorado: características y cambios estacionales

La testosterona (T) ejerce sus acciones en el cerebro directamente a través de los receptores de andrógenos o, después de la aromatización a estradiol, a través de los receptores de estrógenos. La actividad de la aromatasa cerebral en los peces teleósteos es 100-1000 veces mayor que en los mamíferos y se esperaría que redujera significativamente la cantidad de andrógenos disponibles para la unión al receptor. Se llevaron a cabo experimentos en el pez dorado Carassius auratus para determinar si los receptores de andrógenos están presentes en el cerebro de los teleósteos y si sus propiedades fisicoquímicas reflejan una aromatasa elevada. Los extractos citosólicos y nucleares se ensayaron con el uso de [3H] T y cromatografía de carbón, Sephadex LH-20 o ADN-celulosa para separar los esteroides unidos y libres. La actividad de unión era saturable y tenía una afinidad igualmente alta por T y 5 alfa-dihidrotestosterona (Kd, aproximadamente 2,4 X 10 (-9) M). Aunque la mibolerona era un competidor relativamente débil, el andrógeno teleósteo putativo 11-cetotestosterona, metiltrienolona (R1881), estradiol, progesterona y cortisol eran ligandos deficientes. Las características que distinguen a este receptor de una proteína de unión a esteroides en el suero de peces de colores son la presencia de actividad de unión en los extractos nucleares y citosólicos, una baja tasa de disociación ligando-receptor, movilidad electroforética, propiedades de sedimentación en sal baja versus alta y tejido distribución (prosencéfalo mayor o igual a pituitaria mayor que medio / rombencéfalo). Se detectaron formas adheridas y no adheridas a la celulosa del ADN, pero estas no difirieron en otras variables medidas. Aunque los receptores de andrógenos de los peces de colores se parecían a los de los mamíferos en todas las características fisicoquímicas importantes, eran inusualmente abundantes (5-68 pmol / g de tejido) en comparación con los niveles en el cerebro de rata, pero comparables a los niveles en la próstata y otros órganos diana de hormonas sexuales masculinas. Además, hubo variaciones estacionales en los receptores totales, con un pico en el desove (abril) de 4 a 5 veces más alto que los valores en peces inactivos para la reproducción (julio / agosto). Este patrón temporal y la magnitud del cambio correspondieron a cambios previamente informados en la aromatasa cerebral. Por lo tanto, los correlatos filogenéticos y fisiológicos apuntan a una interdependencia funcional entre los receptores de andrógenos y la aromatasa en el cerebro. Estos estudios en peces de colores indican que los receptores de andrógenos cerebrales tienen una larga historia evolutiva y se han conservado en gran medida a través de la serie de vertebrados.


Purificación y propiedades de una ADN primasa de Nicotianatabacum

Se aisló una ADN primasa de una fracción nuclear de hojas de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun) y de núcleos purificados preparados a partir de células de cultivo en suspensión de tabaco. La ADN primasa se purificó hasta homogeneidad (i) para preparaciones de hojas, mediante fraccionamiento con sulfato de amonio, seguido de cromatografía en columnas de fosfocelulosa, Q-Sepharose, heparina-Sepharose y celulosa de ADN monocatenario y sedimentación en un gradiente de glicerol, o (ii) para preparaciones de células, por cromatografía en celulosa de ADN monocatenario, seguida de precipitación con sulfato de amonio y cromatografía en columnas de High Q, heparina-Sepharose y Mono Q. En gradientes de glicerol, la ADN primasa sedimentó a una velocidad correspondiente a una masa molecular de aproximadamente 120 kDa. En la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, la primasa se resolvió en dos subunidades polipeptídicas de 63 kDa y 53 kDa, que son similares en tamaño a las subunidades de primasa de los complejos de ADN polimerasa α-primasa de levadura y animal. En moldes de ADN monocatenario de poli (dT) o fago M13, la ADN primasa catalizó la síntesis de oligoribonucleótidos de hasta 20 nucleótidos de longitud, que podrían servir como cebadores para la síntesis de ADN catalizada por Escherichia coli ADN polimerasa. La actividad de la primasa dependía de una plantilla, iones de magnesio y ATP; era resistente a afidicolina y rifampicina, pero estaba fuertemente inhibida por N-etilmaleimida. Este es el primer informe de la purificación hasta homogeneidad de una primasa de ADN vegetal.

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Lupus eritematoso sistémico: clonación molecular y análisis de ADNasa recombinante monoclonal de cadena ligera κ NGK-1

Debido a que los anticuerpos de ADNasa son citotóxicos, ingresan al núcleo y causan la fragmentación del ADN induciendo la muerte celular por apoptosis, pueden jugar un papel importante en la patogénesis de diferentes patologías autoinmunes y especialmente del lupus eritematoso sistémico (LES). El objetivo interesante de la investigación de anticuerpos catalíticos no es solo estudiar un posible papel biológico de dichos anticuerpos, sino también desarrollar en el futuro nuevas terapias humanas y animales que aprovechen las ventajas que ofrecen las abzimas. Se clonó una biblioteca de cadenas ligeras de inmunoglobulina κ de pacientes con LES en un vector fagémido. Las partículas de fagos que muestran cadenas ligeras de anticuerpos monoclonales recombinantes (MLChs) capaces de unirse al ADN se aislaron mediante cromatografía de afinidad en ADN-celulosa. Dieciséis de los 46 MLCh hidrolizados eficazmente ADN. Se expresó una MLCh (aproximadamente 27-28 kDa) en Escherichia coli y se purificó mediante quelación de metales y filtración en gel. MLCh NGK-1 fue electroforéticamente homogéneo y demostró una respuesta positiva con IgG de ratón contra cadenas ligeras de anticuerpos humanos después de la transferencia Western. SDS-PAGE en un gel que contiene ADN demostró que el MLCh hidroliza el ADN y no está contaminado por DNasas canónicas. La DNasa MLCh fue activada por varios iones metálicos. La secuencia de proteínas de la ADNasa MLCh tiene homología con las ADNasas I de mamíferos y comparte con ellas varios residuos de aminoácidos importantes idénticos o similares (con la misma funcionalidad de la cadena lateral), que son necesarios para la hidrólisis del ADN y la unión de Mg (2+) y Ca (2+) iones. La afinidad del ADN por este primer ejemplo de una MLCh (K (M) = 0,3 microM) fue de 150 a 200 veces mayor que la de la ADNasa I humana.

Palabras clave: Homología de la actividad de ADNasa con ADNasa I de lupus eritematoso sistémico de cadena ligera monoclonal recombinante de mamífero.


Zimógeno de colagenasa de renacuajo

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