2020_Spring_Bis2a_Facciotti_Lecture_20 - Biología

Objetivos de aprendizaje asociados con 2020_Spring_Bis2a_Facciotti_Lecture_20

• Disecciona la reacción química responsable de la síntesis de ADN y cuenta su historia energética.
• Dibuje el proceso de replicación del ADN para la cadena principal, incluidos los sitios clave en el ADN, los reactivos, los productos, las enzimas y la descripción de los requisitos de energía para cada paso.
• Dibuje el proceso de replicación del ADN para la hebra rezagada, incluya el desafío de diseño asociado con la replicación de la plantilla de la hebra rezagada y las soluciones proporcionadas por los fragmentos de Okazaki y la ligasa de ADN.
• Describe los desafíos de replicar los extremos de los cromosomas lineales. Compare estos desafíos con la replicación cromosómica procariota.
• Cree una descripción del mecanismo de alargamiento de los telómeros mediado por telomerasa que describa explícitamente el papel del ARN estructural en el complejo enzimático.
• Explique cómo la replicación del ADN es una fuente de factores genéticos.variación,y describir los mecanismos que pueden cambiar la frecuencia de la mutación y las compensaciones asociadas con la corrección de errores.

La doble hélice del ADN y su replicación

El problema

En este módulo, discutimos la replicación del ADN, uno de los requisitos clave para que un sistema vivo se regenere y cree la próxima generación. Consideremos primero brevemente el problema a través de una analogía literaria.

El genoma humano comprende aproximadamente 6.500 millones de pares de bases de ADN si se considera el genoma diploide completo (es decir, si se cuenta el ADN heredado de ambos padres). Seis coma cinco mil millones se ve así: 6.500.000.000. Eso es un gran número. Para tener una mejor idea de lo que significa ese número, imagine que nuestro ADN es un conjunto de instrucciones escritas para construir uno de nosotros. Por analogía, podemos compararlo con otro documento escrito. Para este ejemplo, comenzamos por considerar a Tolstoi Guerra y paz, una novela con la que mucha gente está familiarizada por su voluminosa naturaleza. Los datos de Wikipedia estiman que Guerra y paz

unas 560.000 palabras. Un segundo trabajo escrito con el que muchos están familiarizados son los siete volúmenes de

's Harry Potter. Este trabajo se registra en ~ 1,080,000 palabras (Estadísticas de referencia en Wikipedia). Si asumimos que la longitud promedio de una palabra en inglés es de cinco caracteres, las dos obras literarias tienen 2,8 millones y 5,4 millones de caracteres, respectivamente. Por lo tanto, incluso los siete volúmenes de "Harry Potter" tienen más de 1000 veces menos caracteres que nuestros propios genomas. El número de personajes de estas novelas.

, sin embargo, mucho más cercano al número de nucleótidos en un genoma bacteriano típico.

Ahora imagine por un momento el desarrollo de una máquina o un proceso mecánico (no un proceso electrónico) que lee y copia estos libros. O imagínese copiando estos textos. ¿Qué tan rápido podrías hacerlo? ¿Cuántos errores es probable que cometa? ¿Espera que haya una compensación entre la velocidad a la que puede copiar y la precisión? ¿Qué tipo de recursos necesita este proceso? ¿Cuánta energía requiere el proceso? ¡Ahora imagina copiar algo 1000 veces más grande! Ah, y solo por si acaso, su dispositivo mecánico imaginario debe hacer su trabajo en un texto de ~ 25Å de ancho (es decir, 0,0000000025 metros de ancho). En comparación, una fuente típica de diez puntos tiene ~ 0,00025 metros de ancho, aproximadamente 100,000 veces más grande que el ancho de un par de bases de ADN.

Con eso en mente,

una célula humana puede tardar unas 24 horas en dividirse (por tanto, la replicación del ADN debe ser un poco más rápida). Una saludable E. coli La célula puede tardar solo 20 minutos en dividirse (incluida la replicación de su genoma de ~ 4,5 millones de pares de bases). Tanto el ser humano como la bacteria hacen esto mientras que, por lo general, cometen pocos errores suficientes para que la siguiente generación siga siendo viable y reconocible. ¡Eso debería parecer bastante asombroso! Ahora considere que estimamos que el cuerpo humano comprende ~ 10 billones de células (10,000,000,000,000) y que puede tener entre dos y diez veces ese número de residentes microbianos. Esa es

división a considerar.

Desafío de diseño

Si la célula se va a replicar, es

objetivo: una copia del ADN debe

. Así que una pregunta / enunciado claro del problema es "¿cómo puede la celda

copiar su ADN? "Dada la analogía anterior, aquí hay algunas subpreguntas relevantes: ¿Cuáles son las propiedades químicas y físicas que permiten que el ADN

? ¿Con qué fidelidad debe el organismo copiar su genoma? Que velocidad debe

¿a? ¿De dónde proviene la energía para esta tarea y cuánta es necesaria? ¿De dónde proceden las "materias primas"? ¿Cómo combinan las máquinas moleculares involucradas en este proceso el ensamblaje de materias primas y la energía requerida para construir una nueva molécula de ADN? La lista podría

seguir.

En la siguiente discusión y en la conferencia, examinamos cómo el proceso de replicación del ADN

teniendo en cuenta algunas preguntas de conducción. A medida que revisa los materiales de lectura y conferencias, trate de estar constantemente al tanto de estas y otras preguntas asociadas con este proceso. Utilice estas preguntas como guías para organizar sus pensamientos e intente encontrar coincidencias entre los "hechos" que cree que podemos esperar que sepa y las preguntas motivadoras.

La doble hélice del ADN

Para construir un contexto adicional, también necesitamos un poco de conocimiento determinado empíricamente. Quizás una de las características más conocidas y populares de la forma hereditaria de la molécula de ADN es que tiene una estructura terciaria de doble hélice. Nuestra apreciación de la estructura de doble hélice del ADN se remonta a la década de 1950. Para más información sobre esta historia, vea el cortometraje aquí.

Los modelos de la estructura del ADN revelaron que la molécula comprende dos hebras de nucleótidos unidos covalentemente que

uno alrededor del otro para formar una hélice a la derecha. En cada hebra, nucleótidos

a otros dos nucleótidos (excepto en los extremos de una hebra lineal) a través de enlaces fosfodiéster que unen los azúcares a través de los grupos hidroxilo 5 'y 3' (panel

en la Figura 1). Recuerde que las etiquetas 5 'y 3' se refieren a los carbonos de la molécula de azúcar. Estos azúcares y cadenas de fosfato forman un conjunto contiguo de enlaces covalentes que

como la "columna vertebral" de la estructura. En una molécula lineal, cada hebra tiene dos extremos libres. Llamamos a un extremo libre el extremo 5 'porque el grupo funcional desvinculado que

al unir nucleótidos está el fosfato unido al carbono 5 '. Llamamos al otro extremo de la hebra el extremo 3 'porque el grupo funcional desvinculado que

al unir nucleótidos, el grupo hidroxilo está unido al carbono 3 'del azúcar. Dado que los dos extremos de la hebra no son simétricos, esto facilita la designación de una dirección en la hebra; por ejemplo, se puede decir que están leyendo desde el extremo 5 'hasta el extremo 3' para

que están "caminando" a lo largo de la hebra comenzando en el extremo de 5 'y avanzando hacia el extremo de 3'. Esta dirección (5 'a 3') es la convención utilizada por la mayoría de los biólogos. Se puede leer en la dirección opuesta (3 'a 5') siempre que hagamos explícita la dirección. Encontramos que las dos cadenas de nucleótidos unidos covalentemente son antiparalelo el uno al otro en la doble hélice;

La orientación / dirección de una hebra es opuesta a la de la otra hebra (panel

en la Figura 1). La columna vertebral está estructuralmente en el "exterior" de la doble hélice, creando una banda de cargas negativas en la superficie. Las bases nitrogenadas de cada una de las hebras antiparalelas se apilan en el interior de la estructura y se oponen entre sí de una manera que permite que se formen enlaces de hidrógeno entre pares únicos de purina / pirimidina (A emparejamiento con T y G emparejamiento con C). Llamamos a estos emparejamientos de bases específicos complementario pares de bases. Por lo tanto, nos referimos a los hilos emparejados de una doble hélice como hebras complementarias.

Los hilos complementarios llevan información redundante. Debido al estricto emparejamiento químico, si conoce la secuencia de una hebra, debe conocer obligatoriamente la hebra de su complemento. Tomemos, por ejemplo, la secuencia 5′- C A T A T G G G A T G - 3 ′. Note como la secuencia

con la orientación

por etiquetas de 5 'y 3'). El complemento de esta secuencia, escrita de acuerdo con la convención 5 'a 3', es: 5′- C A T C C C A T A T G - 3 ′. Si tu

, escribe estas dos secuencias una frente a la otra en tus notas, escribiéndolas como hebras antiparalelas. Tenga en cuenta que la torsión de las dos hebras complementarias entre sí da como resultado la formación de características estructurales llamadas surcos mayor y menor que se volverán más importantes cuando analicemos la unión de proteínas al ADN (panel

en la Figura 1).

La mayoría de los instructores de BIS2A esperarán que reconozca las características estructurales clave que se muestran en la figura a continuación y que

cree usted mismo una figura básica de la estructura del ADN.

Figura 1. El ADN tiene (a) una estructura de doble hélice y(B) enlaces fosfodiéster. Los surcos (c) mayor y menor son sitios de unión paraUnión al ADNproteínas durante procesos como la transcripción (la creación de ARN a partir de una plantilla de ADN) y la replicación.

Posible discusión NB Punto

Tómese un momento para revisar las bases nitrogenadas en la Figura 1. Identifique los grupos funcionales como se describe en la clase. Para cada grupo funcional identificado, describa qué tipo de química espera que tenga.estar involucradoen. Trate de identificar si el grupo funcional puede actuar como donante, aceptor o ambos de enlaces de hidrógeno.

Aproximadamente al mismo tiempo, se estaban considerando tres hipótesis para los modos de replicación del ADN.

el modelo conservador, el modelo semiconservador y el modelo dispersivo.

1. Conservador: El modelo conservador de replicación postuló que cada molécula de doble hebra completa podría actuar como plantilla para la síntesis de una nueva molécula de doble hebra. Si se pusiera una etiqueta química en la plantilla de la molécula de ADN después de la replicación,

en la nueva copia.
2. Semi-conservador: esta hipótesis estipulaba que cada hebra individual de una molécula de ADN podría servir como plantilla para una nueva hebra a la que ahora se asociaría.

, si

en una molécula de ADN de doble hebra, una hebra en cada una de las copias mantendría la etiqueta.
3. Dispersivo: Este modelo propuso que una doble hélice copiada combinaría por partes segmentos continuos de hebras "antiguas" y "nuevas".

en una molécula de ADN que

utilizando un mecanismo dispersivo, uno encontraría segmentos discretos de la copia resultante que

en ambos hilos separados por

partes sin etiqueta.

Meselson y Stahl resolvieron el problema en 1958 cuando informaron los resultados de un experimento ahora famoso (describir en Wikipedia) que mostró que la replicación del ADN es semiconservativa (Figura 2), donde cada hebra

una plantilla para la creación de la nueva hebra. Para obtener más información sobre este experimento, vea The Meselson-Stahl Experiment.

Figura 2. El ADN tiene una estructura de doble hélice antiparalela, las bases de nucleótidos están unidas por hidrógeno y cada hebra complementa a la otra.El ADN se replicade manera semi-conservadora,cada hebra se usacomo plantilla para la hebra recién hecha.

Replicación de ADN

Habiendo establecido algunas características estructurales básicas y la necesidad de un mecanismo semiconservador, es importante comprender algo de lo que sabemos sobre el proceso y pensar en las preguntas que uno podría querer responder para comprender mejor lo que está sucediendo. .

Dado que la replicación del ADN es un proceso, podemos invocar la rúbrica de la historia de la energía para pensar en ello. Recuerde que la rúbrica de la historia de la energía está ahí para ayudarnos a pensar sistemáticamente sobre los procesos (cómo van las cosas de A a B). En este caso, el proceso en cuestión es el acto de comenzar con una molécula de ADN de doble hebra y terminar con dos moléculas de doble hebra. Entonces, haremos una variedad de preguntas: ¿Cómo se ve el sistema al comienzo (materia y energía) de la replicación? ¿Cómo se transfieren la materia y la energía en el sistema y qué cataliza las transferencias? ¿Cómo se ve el sistema al final del proceso? También podemos hacer preguntas sobre eventos específicos que DEBEN

durante el proceso. Por ejemplo, dado que el ADN es una molécula larga

a veces es circular, podemos hacer preguntas básicas como, ¿dónde comienza el proceso de replicación? ¿Dónde termina? También podemos hacer preguntas prácticas sobre el proceso, como qué sucede cuando una estructura de doble hebra

?

Consideramos algunas de estas preguntas clave en el texto y en clase y le animamos a que haga lo mismo.

Requisitos para la replicación del ADN

Comencemos por enumerar algunos requisitos funcionales básicos para la replicación del ADN que podemos inferir con solo pensar en el proceso que debe suceder y / o

para que suceda la replicación. ¿Entonces, qué necesitamos?

• Sabemos que el ADN

de nucleótidos. Si queremos crear una nueva hebra, necesitaremos una fuente de nucleótidos.
• Podemos inferir que la construcción de una nueva hebra de ADN requerirá una fuente de energía; deberíamos intentar encontrarla.
• Podemos inferir que debe haber un proceso para encontrar un lugar para iniciar la replicación.
• Podemos inferir que habrá una o más enzimas que ayudarán

el proceso de replicación.
• También podemos inferir que al tratarse de un proceso bioquímico, cometerá algunos errores.

Revisión de la estructura de nucleótidos

Recuerde algunas características estructurales básicas de los bloques de construcción de nucleótidos del ADN. Los nucleótidos comienzan como nucleótidos trifosfatos.Los nucleótidos están compuestosde una base nitrogenada, desoxirribosa (azúcar de cinco carbonos) y un grupo fosfato. Nombramos el nucleótido según su base nitrogenada, purinas como adenina (A) y guanina (G), o pirimidinas comocitosina(C) y timina (T). Recuerde las estructuras a continuación. Tenga en cuenta que el nucleótido trifosfato de adenosina (ATP) es un precursor del desoxirribonucleótido (dATP) cualesestá incorporadoen el ADN.

Inicio de la replicación

¿En qué parte del ADN comienza la replicación del ADN la maquinaria de replicación?

Con millones, si no miles de millones, de nucleótidos para copiar, ¿cómo sabe la ADN polimerasa por dónde empezar? Este proceso resulta no ser aleatorio. Hay secuencias de nucleótidos específicas llamadas orígenes de la replicación a lo largo del ADN en el que comienza la replicación. Una vez que este sitio

sin embargo, existe un problema. La doble hélice del ADN

juntos por interacciones de apilamiento de bases y enlaces de hidrógeno. Si cada hebra debe

y copiados individualmente, debe haber algún mecanismo responsable de ayudar a disociar las dos hebras entre sí. Energéticamente, este es un proceso endergónico. ¿De dónde viene la energía y cómo es esta reacción?

? El razonamiento básico debe llevar a la hipótesis de que probablemente esté involucrado un catalizador de proteína, y que esta enzima crea nuevos enlaces que son energéticamente más favorables (exergónico) que los enlaces que rompe Y / O puede acoplar el uso de una fuente de energía externa a Ayuda a disociar las hebras.

Resulta que los detalles de este proceso y las proteínas involucradas difieren según el organismo específico en cuestión, y muchos de los detalles a nivel molecular.

. Sin embargo, existen algunas características comunes en la replicación de eucariotas, bacterias y arqueas, y una de estas características es que el proceso involucra múltiples

proteínas en la replicación del ADN. Primero, las proteínas llamadas "iniciadores" pueden unirse al ADN en los orígenes de replicación o muy cerca de ellos. La interacción de las proteínas iniciadoras con el ADN ayuda a desestabilizar la doble hélice y también ayuda a reclutar otras proteínas, incluida una enzima llamada ADN.helicasa al ADN. Aquí, la energía necesaria para desestabilizar la doble hélice del ADN parece provenir de la formación de nuevas asociaciones entre el ADN y las proteínas iniciadoras y las proteínas mismas. La ADN helicasa es una proteína de múltiples subunidades importante en el proceso de replicación porque acopla la hidrólisis exergónica del ATP al desenrollamiento de la doble hélice del ADN. Las proteínas adicionales deben

al complejo de iniciación (la colección de proteínas involucradas en

transcripción). Estos incluyen, pero

a, enzimas adicionales llamadas primasey ADN polimerasa. Mientras que los iniciadores parten poco después del inicio de la replicación, el resto de las proteínas trabajan en conjunto para ejecutar el proceso de replicación del ADN. Este complejo de enzimas funciona en estructuras en forma de Y en el ADN llamadas horquillas de replicación (Figura 4). Para cualquier evento de replicación, se pueden formar dos bifurcaciones de replicación en cada origen de replicación, extendiéndose en ambas direcciones.

en cromosomas eucariotas y algunas arqueas, mientras que el genoma de la bacteria, E. coli, parece codificar un origen de replicación.

Alargamiento de la replicación

La fusión de la doble hélice del ADN y el ensamblaje del complejo de replicación del ADN es solo el primer paso en el proceso de replicación. Ahorael proceso dela creación de una nueva hebra en realidad necesita comenzar. Aquí, nos encontramos con desafíos adicionales. La primera cuestión obvia es la de determinar cuál de las dos hebras debe copiarse en cualquier bifurcación de replicación (es decir, ¿qué hebra servirá como plantilla para la síntesis semiconservadora? ¿Son ambas hebras alternativas igualmente viables?). También existe el problema de iniciar el proceso de síntesis de la nueva hebra. ¿Puede la ADN polimerasa iniciar la nueva hebra por sí sola? Más adelante discutiremos la respuesta a la última pregunta y algunos fundamentos y consecuencias. La idea clave a tener en cuenta en este punto es que tieneha sido determinado experimentalmenteque la ADN polimerasa NO puede iniciar la síntesis de cadenas por sí sola. Más bien, la ADN polimerasa requiere un tramo corto de estructura bicatenaria seguido de una plantilla monocatenaria. La enzima primase crea un polímero oligonucleotídico corto de ARN (no ADN) llamado cebador (estasSe representanpor líneas verdes cortas en las figuras de arriba y abajo). La ADN polimerasa usa el cebador para nuclear y hacer crecer una nueva hebra.

Durante el proceso de elongación de la hebra, el ADN polimerasa polimeriza una nueva cadena de nucleótidos de ADN unida covalentemente (en las bacterias, esta enzima específica puede

ADN polimerasa III; En eucariotas, la nomenclatura de la polimerasa es más compleja y las funciones de varias proteínas polimerasas

). Resulta que una hebra

sobre el otro para que sirva de plantilla. La ADN polimerasa "leerá" la hebra molde de 3 'a 5' y sintetizará una nueva hebra en la dirección 5 'a 3'. Las hipótesis para explicar esta observación universal generalmente se centran en la energía asociada con la adición de un nuevo nucleótido y los argumentos asociados con la reparación del ADN que describiremos en breve. Por tanto, consideremos brevemente la reacción que implica la adición de un solo nucleótido. La imprimación proporciona un importante hidroxilo 3 'en el que comenzar la síntesis. El siguiente desoxirribonucleótido trifosfato ingresa al sitio de unión de la ADN polimerasa y, como se muestra en la Figura 5 a continuación,

por la polimerasa de modo que pueda producirse una hidrólisis del trifosfato 5 '. Esta reacción libera pirofosfato y acopla la hidrólisis exergónica del fosfoanhídrido a la síntesis de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5 'del nucleótido entrante y el grupo hidroxilo 3' del cebador. Este proceso se repite hasta que se agotan los desoxirribonucleótidos trifosfatos o el complejo de replicación se desprende del ADN. En efecto, la ADN polimerasa agrega el grupo fosfato (5 ') del nucleótido entrante al grupo hidroxilo existente (3') del nucleótido previamente agregado.

Emparejamiento de bases correcto o selección del nucleótido correcto para agregar en cada paso,

por las limitaciones estructurales que siente la ADN polimerasa y los enlaces de hidrógeno energéticamente favorables que se forman entre los nucleótidos complementarios. El proceso

por la hidrólisis del trifosfato 5 'entrante y las interacciones energéticamente favorables formadas por las interacciones entre nucleótidos en la doble hélice en crecimiento (apilamiento de bases y enlaces de hidrógeno de apareamiento de bases complementarios). Tenga en cuenta que la energía de la adición de nucleótidos no evita técnicamente que una hebra crezca en la dirección 3 'a 5'. La diferencia clave en este esquema de síntesis "al revés" es que la "fuente" de energía para la síntesis debería provenir de un nucleótido ya incorporado en la hebra en crecimiento en lugar del nuevo nucleótido entrante (lo que podría ser una desventaja selectiva importante

brevemente). Después de que el alargamiento ha comenzado, una ADN polimerasa diferente (en las bacterias generalmente llamamos a esta enzima ADN polimerasa I) entra para eliminar el cebador de ARN y sintetizar el fragmento restante de ADN faltante.

Como se discutió con más detalle en clase, el movimiento de la horquilla de replicación induce el enrollamiento del ADN en ambas direcciones de replicación. Otra enzima que consume ATP llamada topoisomerasa ayuda a aliviar este estrés.

Figura 5. La ADN polimerasa cataliza la adición del grupo fosfato 5 'de un nucleótido entrante al grupo hidroxilo 3' del nucleótido anterior. Este proceso crea un enlace fosfodiéster entre los nucleótidos mientras hidroliza el enlace fosfoanhídrido en el nucleótido.
Fuente: http://bio1151.nicerweb.com/Locked/m ...h16 /alargar.html

Hebra líder y rezagada

La discusión anterior sobre el alargamiento de la hebra describe el proceso denuevosíntesis de hebra si esa hebrase sintetizaen la misma dirección que la horquilla de replicación se mueve o parece moverse a lo largo del ADN. Esta hebra puedeser sintetizadocontinuamente yse llamalos filamento principal. Sin embargo, ambas hebras de la doble hélice de ADN original debenser copiado. Dado que la ADN polimerasa solo puede sintetizar ADN en una dirección de 5 'a 3', la polimerización de la hebra opuesta a la hebra principal debe ocurrir en la dirección opuesta a la que viaja la helicasa, o la parte delantera de la horquilla de replicación. Esta hebrase llamalos hebra rezagada, ydebido arestricciones geométricas, deben sintetizarse a través de una serie de eventos de síntesis de ADN y cebado de ARN en segmentos cortos llamados Fragmentos de Okazaki. Como se señaló, el inicio de la síntesis de cada fragmento de Okazaki requiere una primasa para sintetizar un cebador de ARN, y cada uno de estos cebadores de ARN debeSer eliminadoy reemplazado con nucleótidos de ADN por una ADN polimerasa diferente. Los enlaces covalentes entre cada uno de los fragmentos de Okazaki no puedenhacersepor la ADN polimerasa y, por lo tanto, debeSer formadopor otra enzima llamada ADNligasa. La geometría de la síntesis de hebras rezagadas es difícil de visualizar yEstar cubiertoen la clase.

Figura 6. Se crea la hebra rezagadaen múltiples segmentos. Una bifurcación de replicación muestra la hebra anterior y posterior. Una burbuja de replicación muestra las hebras anteriores y posteriores.
Imagen original del equipo BIS2A