Información

Recomendaciones para un hemocitómetro (contraste de fases)

Recomendaciones para un hemocitómetro (contraste de fases)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estoy buscando recomendaciones para un hemocitómetro que se pueda utilizar con un microscopio de contraste de fases. Quiero usarlo para cuantificar la fracción vegetativa y de esporas en mis muestras. ¿Puedo utilizar cualquier hemocitómetro o debería reducirse el grosor total de la cámara de recuento?


Recomendaciones para un hemocitómetro (contraste de fases) - Biología

Un amplio espectro de especímenes biológicos vivos son virtualmente transparentes cuando se observan en el microscopio óptico bajo iluminación de campo claro. Para mejorar la visibilidad y el contraste en tales muestras, los microscopistas a menudo reducen el tamaño de la abertura del diafragma de iris del condensador de la subplaca, pero esta maniobra va acompañada de una grave pérdida de resolución y la introducción de artefactos de difracción. El contraste de fase se introdujo en la década de 1930 para probar los espejos de los telescopios y fue adaptado por los laboratorios Zeiss a un microscopio comercial varios años después. Esta técnica proporciona un método excelente para mejorar el contraste en muestras biológicas no teñidas sin una pérdida significativa de resolución, y se utiliza ampliamente para examinar eventos dinámicos en células vivas.

Breve descripción general del contraste de fase: a principios del siglo XX todavía se estaba buscando una manera de utilizar la luz directa y difractada de todos los azimuts para producir imágenes de buen contraste de objetos sin teñir que no absorben la luz. La investigación de Frits Zernike durante este período descubrió diferencias de fase y amplitud entre el orden cero y la luz desviada que se pueden alterar para producir condiciones favorables para la interferencia y la mejora del contraste.

Microscopía de contraste de fase: la microscopía de contraste de fase, descrita por primera vez en 1934 por el físico holandés Frits Zernike, es una técnica óptica que mejora el contraste que se puede utilizar para producir imágenes de alto contraste de muestras transparentes como células vivas, microorganismos, cortes de tejido fino, litografía patrones y partículas subcelulares (como núcleos y otros orgánulos). En efecto, la técnica de contraste de fase emplea un mecanismo óptico para traducir pequeñas variaciones de fase en los correspondientes cambios de amplitud, que pueden visualizarse como diferencias en el contraste de la imagen. Una de las principales ventajas de la microscopía de contraste de fase es que las células vivas pueden examinarse en su estado natural sin ser destruidas, fijadas y teñidas. Como resultado, la dinámica de los procesos biológicos en curso en las células vivas se puede observar y registrar en un alto contraste con una claridad nítida de detalles minuciosos de la muestra.

Contraste de la muestra en microscopía óptica: la luz puede interactuar con una muestra a través de una variedad de mecanismos para generar contraste en la imagen. Estos incluyen la reflexión de la superficie, la absorción, la refracción, la polarización, la fluorescencia y la difracción. El contraste también se puede aumentar mediante la modificación física de los componentes ópticos del microscopio y el modo de iluminación, así como la manipulación de la imagen final mediante técnicas fotográficas o electrónicas digitales. La discusión en esta sección destaca varias interacciones entre la muestra y la luz, y revisa algunas de las técnicas de microscopía óptica que se han desarrollado para mejorar el contraste de la muestra.

Contraste de fase apodizado: un artefacto desafortunado en la microscopía de contraste de fase es el efecto de halo, que da como resultado áreas brillantes falsas alrededor de los objetos de fase o contraste inverso en las imágenes. Este efecto es especialmente frecuente en muestras que inducen grandes cambios de fase. Reducir el artefacto de halo alguna vez se pensó que era un problema teórico difícil, pero los avances recientes en la configuración del anillo de fase objetivo han dado como resultado una nueva técnica denominada contraste de fase apodizado, que permite que las estructuras de los objetos de fase que tienen grandes diferencias de fase se vean y fotografíen con sobresalientes claridad y definición de detalle.

Comparación de microscopía de contraste de fase y DIC: la microscopía de contraste de fase y contraste de interferencia diferencial (DIC) son técnicas complementarias capaces de producir imágenes de alto contraste de fases biológicas transparentes que normalmente no afectan la amplitud de las ondas de luz visibles que pasan a través de la muestra. La distinción más fundamental entre el contraste de interferencia diferencial y la microscopía de contraste de fase es la base óptica sobre la que se forman las imágenes. El contraste de fase produce valores de intensidad de la imagen en función de la magnitud de la longitud de la trayectoria óptica de la muestra, y las regiones muy densas (aquellas que tienen grandes longitudes de trayectoria) aparecen más oscuras que el fondo. La situación es bastante distinta para el contraste de interferencia diferencial, donde los gradientes de longitud del camino óptico (en efecto, la tasa de cambio en la dirección de la cizalladura del frente de onda) son los principales responsables de introducir contraste en las imágenes de las muestras.

Microscopía de combinación de fluorescencia y contraste de fase: para minimizar los efectos del fotoblanqueo, la microscopía de fluorescencia se puede combinar con iluminación de contraste de fase. La idea es ubicar el área específica de interés en una muestra utilizando la técnica de mejora de contraste no destructiva (fase) y luego, sin reubicar la muestra, cambiar el microscopio al modo de fluorescencia.

Configuración del microscopio de contraste de fase: los componentes ópticos de contraste de fase se pueden agregar a prácticamente cualquier microscopio de campo claro, siempre que los objetivos de anillo de fase especializados se ajusten a los parámetros de longitud del tubo y el condensador acepte un anillo de fase anular del tamaño correcto. Todos los principales fabricantes proporcionan accesorios de contraste de fase para sus microscopios de investigación y enseñanza, tanto en configuraciones verticales como invertidas (cultivo de tejidos). Esta sección describe el equipo necesario para observar muestras en iluminación de contraste de fase y analiza los pasos básicos en la alineación del microscopio.

Frits Zernike (1888-1966) - Frits Zernike fue un matemático y físico holandés que descubrió el fenómeno del contraste de fase y fue galardonado con el Premio Nobel en 1953. Fueron los estudios de Zernike en óptica los que finalmente llevaron a su prestigioso premio. Primero recibió evidencia del fenómeno de contraste de fase en un estudio de rejillas de difracción, cuando pudo detectar selectivamente materiales transparentes con diferentes índices de refracción. En 1938, Zernike construyó un microscopio basado en la iluminación de contraste de fase, pero inicialmente recibió poca atención. En ese momento, la falta de contraste de la muestra que se experimentaba con las técnicas microscópicas comunes era una de las principales preocupaciones de la microscopía óptica.

Tutoriales interactivos de Java de Phase Contrast

Alineación de placa / anillo de fase: la alineación concéntrica de las ranuras de la placa de fase del condensador con el anillo de fase, colocado dentro del objetivo, es de suma importancia en la microscopía de contraste de fase. Este tutorial explora el efecto de la alineación de la placa de fase / anillo en el contraste de la muestra utilizando esta importante técnica de microscopía.

Luz difractada en microscopía de contraste de fase: en todas las formas de microscopía óptica, la muestra dispersa la luz a través de procesos que incluyen difracción, refracción, reflexión y absorción. Las muestras transparentes obtenidas mediante técnicas de contraste de fase difractan la luz que se retrasa un cuarto de longitud de onda (90 grados) con respecto a la iluminación incidente no difractada (envolvente), mientras que las muestras opacas, como las rejillas de difracción, difractan la luz que es de 180 grados (uno- media longitud de onda) fuera de fase con la iluminación envolvente. Este tutorial interactivo explora la difracción de la luz mediante una rejilla periódica en un microscopio de contraste de fase.

Alineación del microscopio de contraste de fase: la alineación cuidadosa del microscopio de contraste de fase es esencial para producir el máximo efecto de contraste sin introducir artefactos que degraden la apariencia de la muestra. Este tutorial interactivo de MicroscopyU examina las variaciones en cómo las muestras aparecen a través de los oculares (a diferentes aumentos) cuando el anillo del condensador se desplaza hacia adentro y hacia afuera de la alineación con la placa de fase en el objetivo.

Vías ópticas en el microscopio de contraste de fase: el parámetro más importante en el diseño de un microscopio de contraste de fase es aislar las ondas de luz envolventes y difractadas que emergen de la muestra para que ocupen diferentes ubicaciones en el plano de difracción en la apertura posterior del objetivo. . Este tutorial interactivo explora las vías de luz a través de un microscopio de contraste de fase y disecciona la onda electromagnética incidente en componentes envolventes (S), difractados (D) y resultantes (partícula P).

Efectos de la configuración de la placa de fase en el contraste de la muestra: las propiedades de transmisión y retardo de la luz envolvente (no difractada) que pasa a través del anillo de la placa de fase en la microscopía de contraste de fase pueden afectar significativamente el contraste general de la muestra observado en el microscopio. Este tutorial interactivo explora las variaciones de contraste inducidas por la alteración de las características de retardo y absorción de la placa de fase.

Contraste de fase positivo y negativo: según la configuración y las propiedades del anillo de fase colocado en el plano focal posterior del objetivo, las muestras se pueden observar con contraste de fase positivo o negativo. Este tutorial interactivo explora las relaciones entre las ondas envolventes (S), difractadas (D) y de partículas resultantes (P) en campo claro, así como microscopía de contraste de fase positiva y negativa. Además, también se presentan la geometría de la placa de fase y las imágenes representativas de las muestras.

Variaciones de la longitud de la trayectoria óptica de la muestra: la microscopía de contraste de fase interpreta las diferencias en la longitud de la trayectoria óptica de la muestra como fluctuaciones en la intensidad de la luz, que se observan fácilmente como variaciones en el contraste a través del microscopio. Este tutorial interactivo explora los efectos del índice de refracción y los cambios de espesor en la longitud aparente de la trayectoria óptica general, y demuestra cómo dos muestras pueden tener diferentes combinaciones de estas variables pero aún mostrar la misma longitud de trayectoria.

Interacción de ondas de luz con muestras de fase: al encontrar una muestra de fase, un frente de onda de iluminación incidente se deforma de acuerdo con la geometría, el índice de refracción y el grosor de la muestra. Este tutorial interactivo examina la variedad de deformaciones observadas en la forma del frente de onda a medida que las muestras que tienen características diferentes se iluminan con un haz de luz plano.

Artefactos de contraste de fase de sombreado y halo: dos efectos muy comunes observados en las imágenes de contraste de fase son los patrones de sombreado y halo característicos en los que la intensidad observada no corresponde directamente a la diferencia de trayectoria óptica (índice de refracción y valores de espesor) entre los espécimen y el medio circundante. Este tutorial interactivo demuestra los artefactos de sombreado en microscopía de contraste de fase positiva y negativa.

Contraste de fase apodizado: en la microscopía de contraste de fase apodizado, la atenuación del halo y un aumento en el contraste de la muestra se pueden obtener mediante la utilización de filtros de amplitud selectivos ubicados junto a la película de fase en las placas de fase integradas en el objetivo en el plano focal posterior. Estos filtros de amplitud consisten en películas delgadas de filtro de densidad neutra aplicadas a la placa de fase que rodea la película de fase como se ilustra en la ventana del tutorial.

Placas de fase apodizadas y contraste de muestras: los avances recientes en la configuración del anillo de fase objetivo han dado como resultado una nueva técnica denominada contraste de fase apodizado, que permite ver y fotografiar estructuras de objetos de fase que tienen grandes diferencias de fase con una claridad y definición de detalle excepcionales.

Comparación de microscopía de contraste de fase y DIC: la distinción más fundamental entre el contraste de interferencia diferencial (DIC) y la microscopía de contraste de fase es la base óptica sobre la que se forman las imágenes mediante las técnicas complementarias. Las muestras examinadas con estos métodos de mejora del contraste producen imágenes que a menudo son bastante diferentes en apariencia y carácter cuando se comparan objetivamente. Este tutorial interactivo de MicroscopyU explora muchas de las similitudes y diferencias exhibidas entre las imágenes capturadas con contraste de fase y microscopía DIC.

Seccionamiento óptico con contraste de fase y DIC: una de las principales ventajas de la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) sobre el contraste de fase es la capacidad de utilizar el instrumento a una apertura numérica completa sin sufrir los efectos de enmascaramiento de las placas de fase o los anillos del condensador, que restringen severamente el tamaño del condensador y las aberturas del objetivo. El principal beneficio es la resolución axial mejorada, en particular con respecto a la capacidad del microscopio DIC para producir excelentes imágenes de alta resolución con grandes tamaños de apertura. Este tutorial interactivo explora y compara el corte óptico de muestras gruesas con DIC y contraste de fase, y revela los beneficios de los efectos de apertura sin restricciones para obtener secciones bien definidas.

Galerías de imágenes digitales de contraste de fase

Galería de imágenes de contraste de fase: empleando técnicas de contraste de fase clásicas y apodizadas, la galería de imágenes digitales de contraste de fase de Molecular Expressions presenta un amplio espectro de muestras iluminadas con esta útil técnica de mejora del contraste. Entre las muestras ilustradas en la galería de contraste de fase se encuentran secciones delgadas de huesos fosilizados, secciones de tejido vegetal teñidas, escamas de alas de mariposa, células en cultivo de tejidos, algas, protozoos y muestras de histología.

Contraste de fase positiva y negativa: las muestras transparentes a menudo aparecen notablemente diferentes cuando se observan comparativamente bajo iluminación de contraste de fase positiva y negativa. En contraste de fase positivo, la intensidad de la muestra se manifiesta por rasgos de gris relativamente medio a oscuro, rodeados por un halo brillante y superpuestos sobre un fondo gris más claro. Alternativamente, en contraste de fase negativo, la muestra a menudo aparece mucho más brillante sobre un fondo gris oscuro y los halos que la acompañan también son oscuros (mucho más oscuros que el fondo). Esta galería de imágenes digitales compara campos de visión idénticos de una amplia variedad de muestras iluminadas con contraste de fase positivo y negativo.

Galería de imágenes de comparación de contraste de fase y DIC: el contraste de fase y el contraste de interferencia diferencial (DIC) deben considerarse como técnicas complementarias (en lugar de competidoras) y emplearse juntas para investigar completamente las propiedades ópticas, la dinámica y la morfología de las muestras. En muchos casos, cada técnica revelará detalles específicos sobre un espécimen en particular que no son evidentes al observar imágenes capturadas por otros métodos. La amplia variedad de imágenes presentadas en esta galería de MicroscopyU se derivan de muestras transparentes gruesas y delgadas, así como de muestras que tienen un contraste inherente que se origina en tintes sintéticos (tinciones) o pigmentos naturales.

Referencias de literatura seleccionada

Referencias de contraste de fase: investigadores líderes en el campo han publicado varios libros excelentes, artículos de revisión e informes de investigación originales sobre microscopía de contraste de fase, que se utilizaron como referencias para preparar las discusiones de contraste de fase incluidas en el sitio web de MicroscopyU. Esta sección contiene información de ubicación periódica sobre estos artículos, además de proporcionar una lista de informes de investigación originales seleccionados y libros que describen el contraste de muestras y las técnicas clásicas de microscopía óptica de contraste de fase.

Mortimer Abramowitz - Olympus America Inc., Two Corporate Center Drive., Melville, Nueva York, 11747.

Douglas B. Murphy - Departamento de Biología Celular y Anatomía e Instalación de Microscopio, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

Ron Oldfield - Departamento de Ciencias Biológicas, División de Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad Macquarie, Nueva Gales del Sur 2109, Australia.

Stanley Schwartz - Departamento de biociencias, Nikon Instruments, Inc., 1300 Walt Whitman Road, Melville, Nueva York 11747.

Greenfield Sluder - Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, 377 Plantation Street, Worcester, Massachusetts 01605.

Tatsuro Otaki - Departamento de diseño óptico, Compañía de instrumentos, Nikon Corporation, 1-6-3 Nishi-Ohi, Shinagawa-ku, Tokio, 140-8601, Japón.

Kenneth R. Spring, consultor científico, Lusby, Maryland, 20657.

Matthew J. Parry-Hill, Robert T. Sutter, Cynthia D. Kelly, Shannon H. Neaves, Omar Alvarado y Michael W. Davidson - Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidad Estatal de Florida, Tallahassee , Florida, 32310.


Recomendaciones para un hemocitómetro (contraste de fases) - Biología

La microscopía de contraste de fase, descrita por primera vez en 1934 por el físico holandés Frits Zernike, es una técnica óptica que mejora el contraste que se puede utilizar para producir imágenes de alto contraste de muestras transparentes, como células vivas (generalmente en cultivo), microorganismos, cortes de tejido fino. , patrones litográficos, fibras, dispersiones de látex, fragmentos de vidrio y partículas subcelulares (incluidos núcleos y otros orgánulos).

Figura 1 - Configuración del microscopio de contraste de fase

En efecto, la técnica de contraste de fase emplea un mecanismo óptico para traducir pequeñas variaciones de fase en los correspondientes cambios de amplitud, que pueden visualizarse como diferencias en el contraste de la imagen. Una de las principales ventajas de la microscopía de contraste de fase es que las células vivas pueden examinarse en su estado natural sin haber sido destruidas, fijadas y teñidas previamente. Como resultado, la dinámica de los procesos biológicos en curso se puede observar y registrar en un alto contraste con una claridad nítida de detalles minuciosos de la muestra.

Presentado en Figura 1 es un diagrama recortado de un microscopio de contraste de fase vertical moderno, que incluye una ilustración esquemática del tren óptico de contraste de fase. La iluminación parcialmente coherente producida por la lámpara halógena de tungsteno se dirige a través de una lente colectora y se enfoca en un anillo especializado (etiquetado anillo del condensador) colocado en el plano focal frontal del condensador de la subestación. Los frentes de onda que atraviesan el anillo iluminan la muestra y pasan sin desviarse o son difractados y retardados en fase por las estructuras y gradientes de fase presentes en la muestra. La luz no desviada y difractada recogida por el objetivo se segrega en el plano focal posterior por un placa de fase y enfocado en el plano de imagen intermedio para formar la imagen de contraste de fase final observada en los oculares.

Antes de la invención de las técnicas de contraste de fase, la iluminación de campo claro transmitida era uno de los modos de observación más comúnmente utilizados en microscopía óptica, especialmente para muestras fijas teñidas u otros tipos de muestras que tienen una alta absorción natural de luz visible. En conjunto, las muestras fácilmente fotografiadas con iluminación de campo claro se denominan objetos de amplitud (o muestras) porque la amplitud o intensidad de los frentes de onda iluminadores se reduce cuando la luz pasa a través de la muestra.

La adición de accesorios ópticos de contraste de fase a un microscopio de campo claro estándar se puede emplear como una técnica para producir un efecto de mejora del contraste en muestras transparentes que recuerda a la tinción óptica (ver Figura 2). Ondas de luz que son difractadas y cambiadas de fase por la muestra (denominadas objeto de fase) se puede transformar mediante contraste de fase en diferencias de amplitud que se pueden observar en los oculares. Las muestras grandes y extendidas también se visualizan fácilmente con óptica de contraste de fase debido a los fenómenos de difracción y dispersión que ocurren en los bordes de estos objetos. El rendimiento de los microscopios de contraste de fase modernos es tan refinado que permite detectar muestras que contienen estructuras internas muy pequeñas, o incluso unas pocas moléculas de proteína, cuando la tecnología se combina con la mejora electrónica y el procesamiento de imágenes posterior a la adquisición.

Presentado en Figura 2 es una comparación de células vivas en cultivo fotografiadas tanto en campo claro como en iluminación de contraste de fase. Las células son tejido cerebral gliano humano desarrollado en cultivo monocapa bañado con un medio nutritivo que contiene aminoácidos, vitaminas, sales minerales y suero de ternero fetal. En iluminación de campo claro (Figura 2 (a)), las células aparecen semitransparentes y solo se ven regiones altamente refractivas, como la membrana, el núcleo y las células sueltas (redondeadas o esféricas). Cuando se observa usando accesorios ópticos de contraste de fase, el mismo campo de visión revela significativamente más detalles estructurales (Figura 2 (b)). Los apegos celulares se vuelven perceptibles, al igual que gran parte de la estructura interna. Además, el rango de contraste se mejora drásticamente.

Figura 2 - Células vivas en campo claro y contraste de fase

El desarrollo de Zernike de la teoría óptica de contraste de fase es un excelente ejemplo de cómo los resultados de la investigación de un campo altamente especializado (en este caso, la física teórica) pueden producir nuevos desarrollos innovadores en disciplinas aparentemente no relacionadas, como la biología y la medicina. Durante la Segunda Guerra Mundial, Zeiss Optical Works en Jena, Alemania, fue el primer fabricante en incorporar ópticas prácticas de contraste de fase en sus microscopios. El impacto inmediato en la investigación biológica fue significativo y la aplicación generalizada de la técnica continúa hasta el día de hoy. Los objetivos de contraste de fase modernos, diseñados y producidos por Nikon y otros fabricantes ópticos, pueden funcionar en combinación con técnicas auxiliares de mejora del contraste, como contraste de interferencia diferencial, fluorescencia y luz polarizada. Estos objetivos están disponibles con placas de fase interna que tienen diferentes niveles de absorción y desplazamiento de fase de la iluminación envolvente (no difractada) para producir un amplio espectro de opciones de contraste de muestra e intensidad de fondo para microscopía de contraste de fase.

Interacción de ondas de luz con muestras de fase

Un frente de onda incidente presente en un haz de luz iluminante se divide en dos componentes al pasar a través de una muestra de fase. El componente principal es un no desviado (o no difractado orden cero) frente de onda planar, comúnmente conocido como el rodear (S) onda, que atraviesa y rodea la muestra, pero no interactúa con ella. Además, una desviación o difractado frente de onda esféricoD-onda), que se dispersa en un amplio arco (en muchas direcciones) que atraviesa la apertura total del objetivo. Después de abandonar el plano de la muestra, las ondas de luz envolventes y difractadas entran en el elemento de la lente frontal del objetivo y posteriormente se enfocan en el plano de imagen intermedio donde se combinan a través de la interferencia para producir una resultante. partícula ola (a menudo denominada PAG-ola). La relación matemática entre las diversas ondas de luz generadas en la microscopía de contraste de fase se puede describir simplemente como:

Fórmula 1 - Relación entre varias ondas de luz generadas en microscopía de contraste de fase

La detección de la imagen de la muestra depende de las diferencias de intensidad relativa y, por lo tanto, de las amplitudes de la partícula y el entorno (PAG y S) ondas. Si las amplitudes de la partícula y las ondas circundantes son significativamente diferentes en el plano de imagen intermedio, entonces la muestra adquiere una cantidad considerable de contraste y se visualiza fácilmente en los oculares del microscopio. De lo contrario, la muestra permanece transparente y aparece como lo haría en condiciones normales de campo claro (en ausencia de contraste de fase u otras técnicas de mejora del contraste).

En términos de variaciones de la trayectoria óptica entre la muestra y su medio circundante, la parte del frente de onda de luz incidente que atraviesa la muestra (D-wave), pero no atraviesa el medio circundante (S-wave), se retrasa ligeramente. Para los argumentos en microscopía de contraste de fase, el papel de la muestra en la alteración de la longitud de la trayectoria óptica (en efecto, el desplazamiento de fase relativo) de las ondas que la atraviesan es de suma importancia. En óptica clásica, la longitud del camino óptico (OPL) a través de un objeto o espacio es el producto del índice de refracción (norte) y el espesor (t) del objeto o medio interviniente según lo descrito por la relación:

Fórmula 2 - Longitud de la ruta óptica

Longitud de la ruta óptica (OPL) = n × t

Cuando la luz pasa de un medio a otro, la velocidad se altera proporcionalmente a las diferencias del índice de refracción entre los dos medios. Por lo tanto, cuando una onda de luz coherente emitida por el filamento del microscopio enfocado pasa a través de una muestra de fase que tiene un espesor específico (t) e índice de refracción (norte), la velocidad de la onda aumenta o disminuye. Si el índice de refracción de la muestra es mayor que el del medio circundante, la onda se reduce en velocidad mientras pasa a través de la muestra y posteriormente se retarda en fase relativa cuando emerge de la muestra. Por el contrario, cuando el índice de refracción del medio circundante excede al de la muestra, la onda avanza en fase al salir de la muestra. La diferencia en la ubicación de un frente de onda emergente entre la muestra y el medio circundante se denomina cambio de fase (δ) y se define en radianes como:

Fórmula 3 - Cambio de fase

En la ecuación anterior, el término D se conoce como el diferencia de trayectoria óptica, que es similar a la longitud del camino óptico:

Fórmula 4 - Diferencia de ruta óptica

Diferencia de trayectoria óptica (OPD) = Δ = (n2 - n1) × t

dónde n (2) es el índice de refracción de la muestra y n (1) es el índice de refracción del medio circundante. La diferencia de trayectoria óptica resulta del producto de dos términos: el grosor de la muestra y su diferencia en el índice de refracción con el medio circundante. En muchos casos, la diferencia de trayectoria óptica puede ser bastante grande aunque el grosor de la muestra sea pequeño. Por otro lado, cuando el índice de refracción de la muestra es igual al del medio circundante, la diferencia de trayectoria óptica es cero independientemente de si el espesor de la muestra es grande o pequeño.

Tutorial interactivo - Variaciones de la longitud de la trayectoria óptica de la muestra

Explore los efectos de los cambios en el índice de refracción y el grosor en la longitud de la trayectoria óptica y descubra cómo dos muestras pueden tener diferentes combinaciones de estas variables pero seguir mostrando la misma longitud de trayectoria.

Para células individuales en cultivo de tejidos, la diferencia de trayectoria óptica es relativamente pequeña. Una célula típica en cultivo en monocapa tiene un grosor de alrededor de 5 micrómetros y un índice de refracción de aproximadamente 1,36. La célula está rodeada por un medio nutritivo que tiene un índice de refracción de 1,335, lo que produce una diferencia de trayectoria óptica de 0,125 micrómetros, o aproximadamente un cuarto de longitud de onda (de luz verde). Las estructuras subcelulares generan retrasos mucho menores. Estas pequeñas diferencias en la trayectoria óptica producen una reducción lineal en la intensidad con el aumento del cambio de fase (la imagen se oscurece progresivamente) hasta un punto (dependiendo de la configuración de la placa de fase), después de lo cual, la imagen de la muestra se vuelve más brillante a través de la inversión del contraste. En la microscopía de contraste de fase, la intensidad de una imagen no tiene una relación lineal simple con la diferencia de trayectoria óptica producida por la muestra para todo el rango de espesor e índice de refracción. En cambio, la intensidad depende de una variedad de factores que incluyen la absorción en la placa de fase, el grado de avance o retraso de fase en la placa de fase y el signo relativo de este cambio de fase.

Interacciones de ondas en microscopía de contraste de fase

Relaciones de fase entre el entorno, la difracción y la partícula (S, D, y PAG) Las ondas en la región de la muestra en el plano de la imagen para microscopía de campo claro (en ausencia de accesorios ópticos de contraste de fase) se presentan en figura 3. Las ondas envolventes y de partículas, cuyas amplitudes relativas determinan la cantidad de contraste de la muestra, se ilustran como líneas rojas y verdes (respectivamente). La onda producida por difracción de la muestra, que nunca se observa directamente, se representa como una onda azul de menor amplitud. Las ondas envolventes y difractadas se recombinan a través de la interferencia para generar la onda de partículas resultante en el plano de la imagen del microscopio. La amplitud de cada onda ilustrada en figura 3 representa la suma de los vectores eléctricos de las ondas componentes individuales.

Figura 3 - Relaciones de fase de onda de microscopía de campo claro

En relación con la onda envolvente, la onda difractada tiene menor amplitud (porque hay menos fotones difractados que envolventes en el punto de la imagen) y está retardada en fase aproximadamente 90 grados (un cuarto de longitud de onda) a través de la interacción con la muestra. El ligero cambio de fase de 1/20 de longitud de onda exhibido por la onda de partículas resultante (que surge de la interferencia entre las ondas difractadas y envolventes) se observa típicamente en detalles diminutos en una celda y está relacionado con la diferencia de longitud de la trayectoria óptica. Debido a que las amplitudes de las ondas envolventes y de partículas son casi las mismas, la muestra transparente carece por completo de contraste y es casi invisible cuando se superpone contra el fondo brillante.

La relación entre los frentes de onda individuales en el campo claro y la microscopía de contraste de fase se puede describir de forma vectorial mediante un sistema de coordenadas polares. En este sistema, la longitud del vector representa la amplitud de una onda en particular, mientras que el ángulo de rotación del vector con respecto a una referencia fija (el desplazamiento de fase angular) significa el grado de desplazamiento de fase (ver Figura 3 (b)). La representación vectorial de las interacciones de onda en la microscopía de contraste de fase fue introducida por Frits Zernike y más tarde desarrollada en detalle por Robert Barer. Aunque esta ayuda descriptiva rara vez se utiliza hoy en día, muchos textos e informes de investigación publicados en los últimos años se basan en discusiones sobre las relaciones de ondas ilustradas por diagramas vectoriales.

En los diagramas vectoriales de contraste de fase, los retardos de fase se ilustran como rotaciones en sentido horario (con referencia a un azimut arbitrario), mientras que los avances de fase se representan como rotaciones en sentido antihorario. En Figura 3 (b), que técnicamente es un diagrama fasorial, la suma vectorial del entorno (S) y difractado (D) frentes de onda produce la partícula resultante (PAG) frente de onda. Este mecanismo de presentar relaciones de ondas es conveniente porque ayuda a visualizar los cambios de fase en la onda difractada y cómo afectan la fase de la onda de partículas resultante (y viceversa). El cambio de fase de la onda difractada en relación con la onda envolvente en el gráfico en Figura 3 (b) se presenta como Φ, donde:

Fórmula 5 - Cambio de fase de la onda difractada en relación con la onda envolvente

En la ecuación, φ es el desplazamiento de fase relativo (una función de la diferencia de trayectoria óptica) entre el entorno (S) y partícula (PAG) vectores de onda. Para muestras que muestran una diferencia de trayectoria óptica insignificante (en efecto, sin desplazamiento de fase), el último término de la ecuación es igual a cero y Φ se convierte en ± 90 grados. Como se presenta en Figura 3 (b), un difractado (D) La onda que tiene una amplitud muy baja y un cambio de fase pequeño (o inexistente) da como resultado una onda de partículas con una amplitud que es casi igual a la de la onda envolvente. Cuando las ondas envolventes y de partículas tienen amplitudes (o intensidades) similares, no se genera contraste y la muestra permanece invisible sobre un fondo brillante.

El microscopio de contraste de fase

El concepto más importante que subyace al diseño de un microscopio de contraste de fase es la segregación de los frentes de onda envolventes y difractados que emergen de la muestra, que se proyectan en diferentes ubicaciones en el plano focal posterior del objetivo (el difracción plano en la apertura trasera del objetivo). Además, la amplitud de la luz envolvente (no desviada) debe reducirse y la fase debe adelantarse o retrasarse (en un cuarto de longitud de onda) para maximizar las diferencias de intensidad entre la muestra y el fondo en el plano de la imagen. El mecanismo para generar un retardo de fase relativo es un proceso de dos pasos, en el que las ondas difractadas se retardan en fase un cuarto de longitud de onda en la muestra, mientras que las ondas envolventes avanzan (o retardan) en fase mediante una placa de fase colocada en o muy cerca del plano focal posterior del objetivo. Solo se requieren dos accesorios especializados para convertir un microscopio de campo claro para la observación de contraste de fase. En el plano focal frontal del condensador se coloca un diafragma anular especialmente diseñado, que se combina en diámetro y se conjuga ópticamente con una placa de fase interna que reside en el plano focal posterior del objetivo.

Figura 4 - Tren óptico de microscopio de contraste de fase

los anillo del condensador (ilustrado en Figura 1 y Figura 4) se construye típicamente como una placa opaca de color negro plano (absorbente de luz) con un anillo anular transparente, que se coloca en el plano focal frontal (apertura) del condensador para que la muestra pueda ser iluminada por frentes de onda de luz paralelos y desenfocados que emanan de la anillo. El condensador del microscopio genera una imagen del diafragma anular en el infinito, mientras que el objetivo produce una imagen en el plano focal posterior (donde se coloca una placa de fase conjugada, como se explica a continuación). Cabe señalar que muchos textos describen la iluminación que emerge del condensador de un microscopio de contraste de fase como un cono hueco de luz con un centro oscuro. Este concepto es útil para describir la configuración, pero no es estrictamente preciso. El anillo del condensador reemplaza o reside cerca del diafragma de iris ajustable en la apertura frontal del condensador. Al realizar experimentos de contraste de fase utilizando un condensador con un anillo de fase y un diafragma de apertura, verifique que el diafragma de iris se abra más que la periferia del anillo de fase. A diferencia del contraste de interferencia diferencial y el contraste de modulación de Hoffman, la geometría circular de la iluminación y detección de contraste de fase permite la observación de la muestra sin artefactos dependientes de la orientación. El contraste de fase también es insensible a los efectos de polarización y birrefringencia, lo cual es una gran ventaja cuando se examinan células vivas que crecen en recipientes de cultivo de tejidos de plástico.

En condiciones de iluminación de Köhler, las ondas de luz envolventes que no interactúan con la muestra se enfocan como un anillo brillante en el plano focal posterior del objetivo (el plano de difracción). En estas condiciones, el plano focal posterior del objetivo se conjuga con el plano de apertura frontal del condensador, por lo que las ondas de luz no difractadas (orden cero) forman una imagen brillante del anillo del condensador en la apertura posterior del objetivo (superpuesta sobre la imagen del placa de fase). El frente de onda esférico difractado por la muestra (el D ondas) pasa a través del plano de difracción en varios lugares a través de toda la apertura posterior del objetivo. La distribución (cantidad y ubicación) de la luz difractada depende del número, tamaño y diferencial del índice de refracción de los objetos que dispersan la luz en la muestra. Para la mayoría de las muestras, solo se difracta una pequeña parte de las ondas de luz incidentes y la mayoría de la luz pasa sin desviarse para finalmente iluminar todo el plano de la imagen.

Por el contrario, el frente de onda plano envolvente ocupa una proporción más pequeña de la apertura posterior del objetivo, que corresponde al conjugado del anillo del condensador. Por lo tanto, los dos frentes de onda no se superponen de manera significativa y ocupan porciones distintas del plano focal posterior del objetivo. Debido a que la luz directa de orden cero y la luz difractada están separadas espacialmente en el plano de difracción, la fase de cualquier componente de onda (envolvente, S o difractado, D) se puede manipular selectivamente sin interferir con el otro.

Tutorial interactivo - Vías ópticas en el microscopio de contraste de fase

Examine las vías de luz a través de un microscopio de contraste de fase y aprenda cómo estos sistemas diseccionan la onda electromagnética incidente en un componente envolvente (S), difractado (D) y partícula resultante (P).

A placa de fase está montado en o cerca del plano focal posterior del objetivo (ver Figuras 4 y 5) para alterar selectivamente la fase y amplitud de la luz envolvente (o no desviada) que atraviesa la muestra. En algunos objetivos de contraste de fase, la placa de fase delgada contiene un anillo grabado en el vidrio que tiene un espesor reducido para avanzar diferencialmente la fase del marco (S) onda por un cuarto de longitud de onda. A menudo, el anillo también se recubre con una película metálica parcialmente absorbente para reducir la amplitud de la luz envolvente en un 60-90 por ciento. Debido a que el plano focal posterior generalmente reside cerca de un elemento de lente interno, algunos objetivos de contraste de fase se producen al grabar realmente en la superficie de una lente. Independientemente de cómo se fabrique el objetivo, el punto más importante a recordar es que cada objetivo de contraste de fase se modifica para incluir la placa de fase, una característica que está ausente en todos los demás objetivos del microscopio.

Debido a que la onda de partículas resultante se produce exclusivamente por la interferencia del entorno y los frentes de onda difractados, la interferencia entre los frentes de onda que llegan al plano de la imagen genera una partícula (PAG) onda que tiene una amplitud que ahora es considerablemente menor que la del entorno cuando se aplica el recubrimiento de densidad neutra. El efecto neto es transformar la diferencia de fase relativa introducida por la muestra en una diferencia de amplitud (intensidad) de la luz que emerge del plano de la imagen. Debido a que el ojo humano interpreta las diferencias de intensidad como contraste, la muestra ahora es visible en los oculares del microscopio y también se puede capturar en una película con un sistema de cámara tradicional, o digitalmente, utilizando un dispositivo CCD o CMOS. Todos positivo Los sistemas de contraste de fase avanzan selectivamente la fase del sonido envolvente lineal (S) frente de onda relativo al del esférico difractado (D) frente de onda. Alternativamente, negativo El contraste de fase retarda el frente de onda envolvente con respecto a las ondas de luz difractadas por la muestra.

En general, los especímenes que tienen un índice de refracción más alto que el medio circundante aparecen oscuros sobre un fondo gris neutro, mientras que los especímenes que tienen un índice de refracción más bajo que el medio de baño aparecen más brillantes que el fondo gris. Sin embargo, este no es siempre el caso, porque los objetivos de contraste de fase especializados que tienen densidades neutrales más altas acopladas a valores de retardo más bajos (un octavo de longitud de onda o menos) pueden producir inversión de contraste en muestras más gruesas. El resultado neto es que las regiones con diferencias de trayectoria óptica muy altas comienzan a aparecer brillantes.

Con el fin de modificar la fase y amplitud de los frentes de onda difractados y envolventes espacialmente separados en sistemas ópticos de contraste de fase, se han introducido varias configuraciones de placa de fase. Debido a que la placa de fase se coloca en o muy cerca del plano focal posterior del objetivo (el plano de difracción), toda la luz que pasa a través del microscopio debe viajar a través de este componente. La parte de la placa de fase sobre la que se enfoca el anillo del condensador se denomina área conjugada, mientras que las regiones restantes se denominan colectivamente zona complementaria. El área conjugada contiene el material responsable de alterar la fase de la luz envolvente (no difractada) en más o menos 90 grados con respecto a la de los frentes de onda difractados. En general, el área conjugada de la placa de fase es más ancha (en aproximadamente un 25 por ciento) que la región definida por la imagen del anillo del condensador para minimizar la cantidad de luz envolvente que se propaga hacia el área complementaria.

Figura 5 - Aperturas objetivas y óptica de contraste de fase

En Figura 5. Como regla general, cuando se aumenta la apertura numérica del objetivo y el aumento, el ancho y el diámetro de la placa de fase disminuyen. Por el contrario, el tamaño del anillo del condensador aumenta con el aumento del objetivo. También ilustrado en Figura 5 son diagramas de corte que muestran los conceptos básicos detrás de la construcción de placas de fase positiva y negativa. La placa de fase positiva produce un contraste oscuro y contiene una película parcialmente absorbente diseñada para reducir la amplitud del frente de onda envolvente. Además, esta placa contiene material retardador de fase diseñado para cambiar (retardar) la fase de la luz difractada en 90 grados. La placa de fase negativa también contiene materiales retardadores de fase y parcialmente absorbentes. Sin embargo, en este caso, ambos materiales están intercalados dentro de la placa de fase de modo que el frente de onda envolvente no difractado es la única especie afectada (atenuada y retardada en fase en 90 grados).

La mayoría de las placas de fase disponibles de los fabricantes de microscopios modernos se producen mediante la deposición al vacío de películas delgadas dieléctricas y metálicas sobre una placa de vidrio o directamente sobre una de las superficies de la lente dentro del objetivo del microscopio. El papel de la película delgada dieléctrica es cambiar la fase de la luz, mientras que la película metálica atenúa la intensidad de la luz no difractada. Algunos fabricantes utilizan múltiples recubrimientos antirreflejos en combinación con las películas delgadas para reducir la cantidad de deslumbramiento y luz parásita reflejada en el sistema óptico. Si la placa de fase no se forma en la superficie de una lente, generalmente se cementa entre lentes sucesivas que residen cerca del plano focal posterior del objetivo. El espesor y los índices de refracción de las películas dieléctricas, metálicas y antirreflectantes, así como los del cemento óptico, se seleccionan cuidadosamente para producir el desplazamiento de fase necesario entre las áreas complementarias y conjugadas de la placa de fase. En terminología óptica, las placas de fase que alteran la fase de la luz envolvente en relación con la luz difractada en 90 grados (positiva o negativa) se denominan cuarto de longitud de onda placas debido a su efecto sobre la diferencia de trayectoria óptica.

El contraste se modula variando las propiedades de la placa de fase, incluida la absorción de la película metálica (o revestimientos antirreflectantes), el índice de refracción del material retardador de fase y el grosor de la placa de fase. Varios fabricantes de microscopios ofrecen una variedad de objetivos de contraste de fase que tienen grados progresivos de contraste. Por ejemplo, la línea Nikon incluye cinco tipos de objetivos de contraste de fase. los DL (Oscuro Bajo) La serie de objetivos produce un contorno de imagen oscuro sobre un fondo gris claro. Estos objetivos están diseñados para proporcionar un contraste positivo en muestras que tienen una diferencia significativa en el índice de refracción del medio circundante, como las células de cultivo de tejidos. Un objetivo de la versión de contraste ligeramente más bajo, el DLL (Oscuro Bajo Bajo), produce mejores imágenes en iluminación de campo claro que los objetivos DL y se utiliza como un objetivo universal para observaciones combinadas en fluorescencia, campo claro, campo oscuro y contraste de interferencia diferencial.

Nikon también produce apodizado Objetivos de contraste de fase que contienen un anillo secundario de densidad neutra, diseñado para reducir los artefactos de halo, a cada lado del anillo de fase central. Las muestras que tienen diferencias de fase muy pequeñas son candidatas ideales para la obtención de imágenes con Nikon. DM (Medio oscuro) objetivos de contraste de fase positivo, que producen un contorno de imagen oscuro sobre un fondo gris medio. Para el contraste de fase negativo, Nikon ofrece la BM (Medio brillante) objetivo, que es especialmente adecuado para el examen visual de flagelos bacterianos, protozoos, fibras de fibrina, glóbulos diminutos y células sanguíneas. Los objetivos de contraste de fase medio brillante producen imágenes brillantes sobre un fondo gris medio. Nikon ofrece además un módulo de contraste de fase externo para ciertos modelos de microscopio invertido que permite a los usuarios realizar imágenes de contraste de fase con objetivos de alto rendimiento sin contraste de fase. Este módulo permite la inserción de un anillo de fase en un plano conjugado con la apertura trasera del objetivo.

En la mayoría de los casos, el simple avance de la fase relativa del frente de onda envolvente es insuficiente para generar imágenes de alto contraste en el microscopio. Esto ocurre porque la amplitud de las ondas envolventes es significativamente mayor que la de las ondas difractadas y suprime las imágenes resultantes creadas por la interferencia de solo una pequeña parte del número total de ondas. Para reducir la amplitud del frente de onda envolvente a un valor más cercano al de la onda difractada (y hacer cumplir la interferencia en el plano de la imagen), la placa de fase en el objetivo aumenta en opacidad mediante la aplicación de un metal semitransparente (neutral densidad) revestimiento. Las ondas de luz circundantes, que pasan casi exclusivamente a través de la placa de fase por diseño en el microscopio de contraste de fase, se reducen drásticamente en amplitud por la placa de fase opaca a un valor que oscila entre el 10 y el 30 por ciento de la intensidad original.

Las configuraciones de la placa de fase, las relaciones de onda y los diagramas vectoriales asociados con la generación de imágenes de contraste de fase positivo y negativo se presentan en Figura 6. Además, también se ilustran ejemplos de muestras obtenidas mediante estas técnicas. Como se discutió anteriormente, el frente de onda esférico de la luz difractada que emerge del plano de la muestra se retarda un cuarto de longitud de onda con respecto a la fase del frente de onda envolvente plano (o no difractado). En la configuración óptica de contraste de fase positivo (fila superior de imágenes en Figura 6), el entorno (S) el frente de onda avanza en fase un cuarto de longitud de onda al atravesar la placa de fase para producir un cambio de fase neto de 180 grados (media longitud de onda). El frente de onda envolvente avanzado ahora puede participar en una interferencia destructiva con el difractado (D) ondas en el plano de imagen intermedio.

Figura 6 - Sistemas de contraste de fase positivo y negativo

En la parte superior de la página se presenta una descripción general del contraste de fase positivo. Figura 6. Placas de contraste de fase positiva (lado izquierdo de Figura 6) hacen avanzar la onda envolvente en un cuarto de longitud de onda debido al anillo grabado en la placa de vidrio que reduce el camino físico tomado por las ondas a través de la placa de alto índice de refracción. Debido a que los rayos difractados del espécimen (Dondas) se retardan en un cuarto de longitud de onda cuando interactúan con la muestra, la diferencia de trayectoria óptica entre las ondas envolventes y difractadas al emerger de la placa de fase es la mitad de la longitud de onda. El resultado neto es una diferencia de trayectoria óptica de 180 grados entre las ondas envolventes y difractadas, lo que da como resultado una interferencia destructiva para una muestra de alto índice de refracción en el plano de la imagen. Los perfiles de amplitud de las ondas de interferencia destructiva para el contraste de fase positivo se muestran en el gráfico superior de Figura 6. La amplitud de la partícula resultante (PAG) la onda es más baja que la envolvente (S) onda, haciendo que el objeto parezca relativamente más oscuro que el fondo, como lo ilustra la imagen de Zygnema algas verdes en el extremo derecho (etiquetadas POS). Un diagrama vectorial que ilustra el avance de la onda envolvente en un cuarto de longitud de onda, que se muestra como una rotación de 90 grados en sentido antihorario en contraste de fase positivo, aparece entre el gráfico y la imagen en Figura 6.

También es posible producir sistemas ópticos de microscopio que produzcan un contraste de fase negativo, como se ilustra en la parte inferior de Figura 6. En este caso, el sonido envolvente (S) la onda se retarda (en lugar de avanzar) en un cuarto de longitud de onda en relación con la difractada (D) ola. El resultado es que las muestras que tienen índices de refracción altos aparecen brillantes contra un fondo gris más oscuro (vea la imagen etiquetada NEG en la parte inferior de Figura 6). En contraste de fase negativo, la placa de fase objetiva contiene un anillo elevado que retarda la fase (en lugar de avanzar la fase como en el contraste de fase positivo) de la onda envolvente de orden cero en un cuarto de longitud de onda en relación con la fase de la onda difractada. Debido a que la onda difractada ya ha sido retardada en un cuarto de longitud de onda al pasar a través de la muestra, se elimina la diferencia de trayectoria óptica entre las ondas envolvente y difractada, y se produce interferencia constructiva para una muestra de alto índice de refracción en el plano de la imagen. Tenga en cuenta que la partícula resultante (PAG) la onda es más alta en amplitud que la envolvente (S) onda en contraste de fase negativo (ver el gráfico inferior en Figura 6). También se ilustra el diagrama vectorial para el contraste de fase negativo, donde el vector de onda envolvente experimenta una rotación de 90 grados en el sentido de las agujas del reloj.

Tutorial interactivo - Contraste de fase positiva y negativa

Este tutorial interactivo explora las relaciones entre las ondas envolventes (S), difractadas (D) y de partículas resultantes (P) en campo claro, así como microscopía de contraste de fase positiva y negativa.

Es importante señalar que el patrón de difracción formado en el plano focal posterior del objetivo es la transformada de Fourier de todas las frecuencias espaciales desviadas y dispersas por la muestra en contraste de fase y todas las demás formas de microscopía óptica. En consecuencia, la imagen producida en el plano de imagen intermedio y la imagen final observada a través de los oculares (o registrada por un detector) representan transformadas de Fourier inversas de los patrones de difracción formados en el plano focal posterior del objetivo y el punto del ojo (flotando sobre la lente frontal del ocular). ), respectivamente. La microscopía de contraste de fase aprovecha estas propiedades ópticas conjugadas para mejorar el contraste de la imagen modificando la función de apertura del microscopio para introducir filtración espacial de información de imagen específica. La introducción de una placa de fase (filtro) en el plano de difracción posterior del objetivo permite la transformación de las variaciones de fase de la muestra en variaciones de intensidad que se pueden observar en la imagen final.

Interpretación de imágenes de contraste de fase

Las imágenes producidas por microscopía de contraste de fase son relativamente sencillas de interpretar cuando la muestra es delgada y está distribuida uniformemente sobre el sustrato (como es el caso de las células vivas cultivadas en cultivos de tejidos en monocapa). Cuando se examinan muestras delgadas utilizando ópticas de contraste de fase positivo, que es la forma tradicional que producen la mayoría de los fabricantes, aparecen más oscuras que el medio circundante cuando el índice de refracción de la muestra supera al del medio. La óptica de contraste de fase mejora de manera diferencial el contraste cerca de los bordes que rodean las muestras extendidas, como el límite entre una membrana celular y el medio nutritivo de baño, y produce imágenes generales de alto contraste que pueden interpretarse aproximadamente como mapas de densidad. Debido a que la amplitud e intensidad de una imagen de muestra en contraste de fase está relacionada con el índice de refracción y la longitud del camino óptico, la densidad de la imagen se puede utilizar como un indicador para aproximar las relaciones entre varias estructuras. En efecto, una serie de orgánulos celulares internos que tienen una densidad creciente, como las vacuolas, el citoplasma, el núcleo en interfase y el nucleolo (o cromosomas mitóticos), se visualizan típicamente como objetos progresivamente más oscuros en relación con una referencia fija, como el fondo. También debe tenerse en cuenta que existen numerosos artefactos ópticos en todas las imágenes de contraste de fase, y las muestras grandes y extendidas a menudo presentan fluctuaciones significativas en el contraste y la intensidad de la imagen. La simetría también puede ser un factor importante para determinar cómo aparecen tanto las muestras grandes como las pequeñas en el microscopio de contraste de fase.

La interpretación sensata de las imágenes de contraste de fase requiere un escrutinio y examen cuidadosos para garantizar que los artefactos no se asignen incorrectamente a características estructurales importantes. Por ejemplo, algunos orgánulos y componentes celulares internos a menudo tienen un índice de refracción más bajo que el del citoplasma circundante, mientras que otros tienen un índice de refracción más alto. Debido a los índices de refracción variables exhibidos por estas numerosas estructuras intracelulares, el interior de las células vivas, cuando se observa en un microscopio de contraste de fase positivo, puede revelar una variedad de intensidades que van desde muy brillantes a extremadamente oscuras. Por ejemplo, las vesículas pinocitóticas, las gotitas de lípidos y las vacuolas de aire presentes en las plantas y los protozoos unicelulares tienen un índice de refracción más bajo que el citoplasma y, por lo tanto, parecen más brillantes que otros componentes. Por el contrario, como se discutió anteriormente, los orgánulos que tienen índices de refracción altos (núcleos, ribosomas, mitocondrias y nucleolo) aparecen oscuros en el microscopio. Si el retardo de fase introducido por la muestra es lo suficientemente grande (un cambio de fase de la onda difractada en aproximadamente media longitud de onda), la interferencia entre las ondas difractadas y las ondas envolventes se vuelve constructiva, haciendo que estas muestras sean más brillantes que el fondo circundante.

Para evitar confusiones con respecto al contraste brillante y oscuro en las imágenes de contraste de fase, se deben considerar cuidadosamente las diferencias de trayectoria óptica que ocurren dentro de la preparación de la muestra. Como se discutió anteriormente, la diferencia de trayectoria óptica se deriva del producto del índice de refracción y el espesor de la muestra (objeto), y está relacionada con el cambio de fase relativo entre la muestra y las ondas de fondo (difractadas y envolventes). Es imposible distinguir entre componentes de índice de refracción alto y bajo en una imagen de contraste de fase sin información perteneciente al grosor relativo de los componentes. Por ejemplo, una muestra pequeña que tiene un índice de refracción alto puede mostrar una diferencia de trayectoria óptica idéntica a una muestra más grande que tiene un índice de refracción más bajo. Las dos muestras tendrán aproximadamente la misma intensidad cuando se vean a través de un sistema óptico de contraste de fase. En muchos experimentos biológicos, las condiciones que producen un encogimiento o hinchazón de células u orgánulos pueden resultar en variaciones de contraste significativas. El medio externo también se puede reemplazar por otro que tenga un índice de refracción mayor o menor para generar cambios en el contraste de la imagen de la muestra. De hecho, el efecto sobre el contraste de la imagen de las variaciones del índice de refracción en el medio circundante forma la base de la técnica conocida como refractometría de inmersión.

Figura 7 - Muestras en Contraste de Fase Positivo y Negativo

Presentado en Figura 7 son varias muestras semitransparentes fotografiadas con sistemas ópticos de contraste de fase positivo y negativo. Las Figuras 7 (a) y 7 (b) ilustran una escama de pez ctenoide en contraste de fase positivo (Figura 7 (a)) y contraste de fase negativo (Figura 7 (b)) con un aumento relativamente alto (200x). Estas escamas se encuentran comúnmente en la mayoría de óseo peces (conocidos como los Teleostei). La parte anterior (o frontal) de cada escala generalmente se coloca detrás de la parte posterior de la escala anterior. A medida que el pez crece, también lo hacen las escamas, lo que da como resultado un patrón de "anillos" concéntricos de crecimiento que aumentan en número con el tamaño de la escala y parecen similares a los que se encuentran en la sección transversal de los troncos de los árboles. En algunos casos, se utilizan patrones de crecimiento de escamas ctenoides para estimar la edad de un pez. Los anillos de crecimiento aparecen oscuros rodeados por regiones de halo gris más claro en contraste de fase positivo (Figura 7 (a)), pero se vuelven mucho más claros y están rodeados de depresiones oscuras con contraste de fase negativo (Figura 7 (b)).

Un cultivo de células de ovario de hámster chino vivo parece transparente en el modo de iluminación de campo claro cuando se baña en medio de crecimiento, y las células tienen un índice de refracción que está muy cerca del tampón salino nutritivo. En contraste de fase positivo (Figura 7 (c)), los detalles celulares internos, incluidos el núcleo y los orgánulos, se pueden visualizar fácilmente. Sin embargo, cuando se examinan con iluminación de contraste de fase negativa, los contornos celulares se vuelven difíciles de distinguir y los detalles internos se oscurecen en gran medida con la excepción de los orgánulos de alto índice de refracción que se vuelven muy brillantes (Figura 7 (d)). Finalmente, los eritrocitos humanos aparecen como elipsoides achatados de color gris oscuro con un contorno de rosquilla y centros brillantes en contraste de fase positivo (Figura 7 (e)), pero las mismas células son brillantes con centros oscuros (Figura 7 (f)) y se destacan claramente del fondo en contraste de fase negativo.

Dos efectos muy comunes en las imágenes de contraste de fase son la característica aureola y sombra patrones de contraste en los que la intensidad observada no se corresponde directamente con la diferencia del camino óptico (índice de refracción y valores de espesor) entre la muestra y el medio circundante. Aunque estos patrones se producen como resultado natural del sistema óptico de contraste de fase, a menudo se denominan artefactos de fase o distorsiones de imagen. En todas las formas de contraste de fase positivo, brillante halos de fase generalmente rodean los límites entre las características de los especímenes grandes y el medio. Los halos idénticos parecen más oscuros que la muestra con sistemas ópticos de contraste de fase negativo. Estos efectos se acentúan aún más por las fluctuaciones de diferencia de trayectoria óptica, que pueden hacer que los halos brillantes se vuelvan oscuros en el contraste de fase positivo y los halos oscuros brillantes en el contraste de fase negativo.

Los halos se producen en la microscopía de contraste de fase porque el anillo de retardo de fase circular (y densidad neutra) ubicado en la placa de fase del objetivo también transmite un pequeño grado de luz difractada de la muestra (no se limita al paso de ondas envolventes solamente). El problema se agrava por el hecho de que la anchura del frente de onda envolvente de orden cero proyectado sobre la placa de fase por el anillo del condensador es menor que la anchura real del anillo de la placa de fase. La diferencia de ancho entre el anillo de la placa de fase y el frente de onda envolvente suele ser de alrededor del 25 al 40 por ciento, pero es necesaria debido a las restricciones y requisitos del diseño óptico. Debido a la ubicación espacial del anillo de alteración de fase circular en el plano de difracción objetivo, solo aquellos frentes de onda correspondientes a frecuencias espaciales bajas difractadas por la muestra pasan a través del anillo de la placa de fase. Por lo tanto, las ondas de la muestra difractada que pasan a través de la placa de fase permanecen 90 grados (un cuarto de longitud de onda) fuera de fase con respecto a la luz de orden cero (no desviada o envolvente). El artefacto de halo de contraste de fase resultante se debe a la atenuación de la información de baja frecuencia espacial difractada por la muestra a través de un ángulo muy poco profundo con respecto a los frentes de onda envolventes de orden cero. En efecto, la ausencia de interferencia destructiva entre los frentes de onda de baja frecuencia espacial difractados por el espécimen y las ondas de luz no desviadas produce una inversión de contraste localizada (manifestada por el halo) que rodea al espécimen. Para crear un borde nítido en la imagen, todas las frecuencias espaciales difractadas por la muestra deben estar representadas en la imagen final.

Tutorial interactivo - Artefactos de contraste de fase de sombreado y halo

Explore los artefactos de sombra y halo, donde la intensidad observada no se corresponde directamente con la diferencia de la trayectoria óptica (índice de refracción y valores de espesor) entre la muestra y el medio circundante.

Los halos de contraste de fase son especialmente prominentes y perceptibles alrededor de objetos grandes de baja frecuencia espacial, como núcleos, diatomeas y células enteras. Otro factor que contribuye al artefacto del halo es la redistribución de la energía luminosa en el plano de la imagen, desde las regiones donde es destructiva hacia las regiones donde es constructiva. Los halos grandes y de alto contraste pueden producir imágenes confusas para muestras que generan grandes diferencias en la trayectoria óptica, como eritrocitos, mohos, protozoos, células de levadura y bacterias. Por otro lado, los efectos de halo a menudo pueden enfatizar las diferencias de contraste entre la muestra y el fondo circundante y pueden aumentar la visibilidad de los bordes delgados y los detalles de los bordes en muchas muestras. Este efecto es particularmente útil en el contraste de fase negativo, que produce un halo oscuro que rodea los detalles de la imagen de baja frecuencia. En muchos casos, es posible reducir el grado de cambio de fase y difracción, lo que resulta en una reducción del tamaño del halo alrededor de la muestra. El remedio más fácil para eliminar o atenuar la intensidad de los halos es modificar el índice de refracción del medio de observación con componentes de índice de refracción más alto, como glicerol, manitol, dextrano o albúmina sérica. En algunos casos, cambiar el índice de refracción del medio puede incluso producir una inversión en el contraste de la imagen, volviendo brillantes las características oscuras de la muestra sin alterar significativamente la intensidad del fondo.

El efecto de halo también se puede reducir significativamente utilizando objetivos de fase especialmente diseñados que contienen un pequeño anillo de material de densidad neutra que rodea el material del anillo de fase central cerca de la apertura trasera del objetivo. Estos objetivos se denominan contraste de fase apodizado objetivos y permiten visualizar y fotografiar estructuras de objetos de fase que tienen grandes diferencias de fase con una claridad y una definición de detalle excepcionales. En la mayoría de los casos, las características subcelulares (como los nucléolos) se pueden distinguir claramente por tener un contraste oscuro con los objetivos apodizados, pero estas mismas características tienen halos brillantes o se visualizan como puntos brillantes utilizando la óptica de contraste de fase convencional. Con la óptica apodizada, el contraste se invierte debido a la gran amplitud de la luz difractada en relación con la de la luz directa que atraviesa la muestra.

En la práctica, la reducción del halo y un aumento en el contraste de la muestra con sistemas ópticos apodizados se pueden lograr mediante la utilización de filtros de amplitud selectivos ubicados adyacentes a la película de fase en las placas de fase integradas en el objetivo en el plano focal posterior. Estos filtros de amplitud consisten en películas delgadas de densidad neutra aplicadas a la placa de fase que rodea la película de fase. La transmitancia del anillo de cambio de fase en la placa de fase clásica es de aproximadamente el 25 por ciento, mientras que el par de anillos adyacentes que rodean el anillo de cambio de fase en la placa apodizada tienen una densidad neutra con una transmitancia del 50 por ciento. El ancho de la película de fase en ambas placas es el mismo. Estos valores son consistentes con los valores de transmitancia de películas delgadas de desplazamiento de fase aplicadas a placas estándar en microscopios de contraste de fase.

Figura 8 - Sombreado en contraste de fase positivo y negativo

El sombreado es otro artefacto óptico muy común en la microscopía de contraste de fase y, a menudo, se observa con mayor facilidad en muestras grandes de fase extendida. Normalmente se esperaría que la imagen de una muestra de fase grande que tiene una longitud de trayectoria óptica constante a lo largo del diámetro parezca uniformemente oscura o clara en el microscopio. Desafortunadamente, la intensidad de las imágenes producidas por un microscopio de contraste de fase no siempre guarda una relación lineal simple con la diferencia de trayectoria óptica producida por la muestra. Otros factores, como la absorción en la placa de fase y la cantidad de retraso o avance de fase, así como el tamaño de solapamiento relativo de la placa de fase y el anillo del condensador también juegan un papel crítico. El perfil de intensidad de una muestra de contraste de fase positiva grande y uniformemente gruesa a menudo aumenta gradualmente desde los bordes hacia el centro, donde la intensidad de la luz en la región central puede acercarse a la del medio circundante (lo contrario es cierto para las muestras de fase negativa). Este efecto se denomina sombreado y se observa con frecuencia cuando se examinan muestras planas extendidas, como placas de material (vidrio o mica), réplicas, células de cultivo de tejidos aplanadas y orgánulos grandes.

Los efectos de los artefactos de halo y sombra en el contraste de fase positivo y negativo se presentan en Figura 8 para una muestra hipotética de fase extendida que tiene geometría rectangular y un índice de refracción más alto que el medio circundante (Figura 8 (a)). El perfil de intensidad registrado en una región central de la muestra se ilustra en Figura 8 (b). En contraste de fase positivo (Figura 8 (c)), la imagen de la muestra exhibe un halo distintivamente brillante y demuestra un efecto de sombra dramático, que se manifiesta por un aumento progresivo de la intensidad al atravesar desde los bordes hasta la región central de la muestra (ver el perfil de intensidad en Figura 8 (d)). Los efectos de halo y sombra han invertido intensidades en el contraste de fase negativo (Figura 8 (e) y 8 (f)). Un halo oscuro rodea la imagen de la muestra cuando se ve con óptica de contraste de fase negativo (Figura 8 (e)), y la transición de sombreado varía de brillante en los bordes a niveles de gris más oscuro en el centro. Además, el perfil de intensidad (Figura 8 (f)) se invierte de la observada con contraste de fase positivo.

El fenómeno de sombra también se denomina comúnmente efecto de zona de acción, porque las zonas centrales que tienen un espesor uniforme en la muestra difractan la luz de manera diferente que las zonas altamente refractivas en los bordes y límites. En las regiones centrales de una muestra, tanto los ángulos relativos como la cantidad de luz difractada se reducen drásticamente en comparación con los bordes. Debido a que los frentes de onda difractados que se originan en las áreas centrales del espécimen tienen solo una desviación espacial marginal de los frentes de onda circundantes no desviados de orden cero (pero aún están retardados en fase por un cuarto de longitud de onda), son capturados por la placa de fase en la parte posterior del objetivo. plano focal, junto con la luz envolvente. Como resultado, la intensidad de la región central de la muestra permanece esencialmente idéntica a la del fondo. La aparición de efectos de sombreado en áreas de muestras planas relativamente planas, junto con el contraste excesivamente alto producido por los bordes y los límites, proporciona una fuerte evidencia de que el mecanismo de contraste de fase está controlado principalmente por los fenómenos combinados de difracción y dispersión.

Los artefactos de halo y sombra dependen de las propiedades geométricas y ópticas de la placa de fase y de la muestra que se examina. En particular, el ancho y la transmitancia del material de la placa de fase juegan un papel crítico en el control de estos efectos (el ancho de la placa de fase es típicamente aproximadamente una décima parte del área de apertura total del objetivo). Las placas de fase más ancha que tienen una transmitancia reducida tienden a producir halos y sombras de mayor intensidad, mientras que el diámetro del anillo tiene una menor influencia sobre estos efectos. Para un objetivo de fase particular (ya sea positivo o negativo), la diferencia de la trayectoria óptica y el tamaño, la forma y la estructura de la muestra tienen una influencia significativa en la gravedad de los efectos de halo y sombreado. Además, estos efectos están fuertemente influenciados por el aumento del objetivo, con aumentos más bajos que producen mejores imágenes.

Conclusiones

El contraste de fase es un método excelente para mejorar el contraste de muestras delgadas y transparentes sin pérdida de resolución, y ha demostrado ser una herramienta valiosa en el estudio de eventos dinámicos en células vivas. Antes de la introducción de los sistemas ópticos de contraste de fase, las células y otras muestras semitransparentes se hicieron visibles en microscopía de campo claro mediante técnicas de tinción artificial. Aunque estas muestras se pueden observar y registrar con iluminación de campo oscuro y oblicua, o desenfocando un microscopio de campo claro, esta metodología ha demostrado ser poco confiable para proporcionar información crítica sobre la estructura y función celular.

La técnica del contraste de fases se aplica ampliamente en la investigación biológica y médica, especialmente en los campos de la citología y la histología. Como tal, la metodología se utiliza para examinar células, tejidos y microorganismos vivos que son transparentes bajo iluminación de campo claro. El contraste de fase permite visualizar fácilmente los componentes celulares internos, como la membrana, los núcleos, las mitocondrias, los husos, el aparato mitótico, los cromosomas, el aparato de Golgi y los gránulos citoplasmáticos de las células y tejidos vegetales y animales. Además, la microscopía de contraste de fase se emplea ampliamente en el diagnóstico de células tumorales y el crecimiento, la dinámica y el comportamiento de una amplia variedad de células vivas en cultivo. Se han desarrollado sistemas ópticos especializados de contraste de fase de larga distancia de trabajo para microscopios invertidos empleados para investigaciones de cultivo de tejidos. Otras áreas en el campo biológico que se benefician de la observación de contraste de fase son la hematología, virología, bacteriología, parasitología, paleontología y biología marina.

Las aplicaciones industriales y químicas para el contraste de fases incluyen investigaciones de mineralogía, cristalografía y morfología de polímeros. Los microcristales, polvos, partículas sólidas y polímeros cristalinos incoloros, que tienen un índice de refracción que difiere solo ligeramente del del líquido de inmersión circundante, a menudo se observan fácilmente usando microscopía de contraste de fase. De hecho, la refractometría cuantitativa se utiliza a menudo para obtener valores de índice de refracción y con fines de identificación. Otros productos comerciales examinados mediante técnicas ópticas de contraste de fase incluyen arcillas, grasas, aceites, jabones, pinturas, pigmentos, alimentos, medicamentos, textiles y otras fibras.

La microscopía de contraste de fase de luz incidente, aunque reemplazada en gran medida por técnicas de contraste de interferencia diferencial, es útil para el examen de superficies, incluidos circuitos integrados, dislocaciones de cristales, defectos y litografía. Un buen ejemplo son las fallas de apilamiento en las obleas epitaxiales de silicio, que son de enorme importancia para la industria de los semiconductores. En los sistemas de contraste de fase de luz reflejada, se proyecta una imagen del anillo de iluminación en el plano focal posterior del objetivo, donde normalmente se encuentra la placa de fase. Además, la placa de fase no se coloca dentro del objetivo, sino que se forma una imagen del plano focal posterior mediante un sistema de lentes auxiliares que evita los reflejos y la dispersión generados por la placa de fase. Cabe señalar que en la microscopía de contraste de fase de luz reflejada, las diferencias de fase surgen del relieve en las superficies de la muestra, en lugar de los gradientes de fase dentro de la muestra.

La reducción del halo y los artefactos de sombreado sigue siendo una preocupación principal en la microscopía de contraste de fase. Las placas de fase apodizada son útiles para reducir la gravedad del halo, y los sistemas especializados de contraste de fase variable se pueden ajustar para controlar estos efectos con el fin de optimizar la calidad de la imagen y la fidelidad de la información obtenida mediante la técnica. También existe un interés considerable en el desarrollo de sistemas avanzados de contraste de fase que proporcionen mediciones precisas de muestras de fase que tienen grandes diferencias de trayectoria óptica, así como observaciones combinadas con otras técnicas de mejora del contraste. En particular, el contraste de fase se utiliza a menudo con imágenes de fluorescencia para determinar la ubicación de los fluoróforos y parece prometedor para mejorar el contraste en la microscopía óptica de barrido.

Autores colaboradores

Douglas B. Murphy - Departamento de Biología Celular y Anatomía y Microscopio, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, 725 N. Wolfe Street, 107 WBSB, Baltimore, Maryland 21205.

Ron Oldfield - Departamento de Ciencias Biológicas, División de Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad Macquarie, Nueva Gales del Sur 2109, Australia.

Stanley Schwartz - Departamento de Biociencia, Nikon Instruments, Inc., 1300 Walt Whitman Road, Melville, Nueva York 11747.

Michael W. Davidson - Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, 1800 East Paul Dirac Dr., Universidad Estatal de Florida, Tallahassee, Florida, 32310.


Resumen de la charla

Esta conferencia describe los principios de la microscopía de contraste de fase y campo oscuro, dos formas de generar contraste en una muestra que puede ser difícil de ver en campo brillante. La conferencia describe cómo funcionan los anillos de fase para generar interferencia entre la luz difractada y no difractada.

Preguntas

  1. Cuando Zernicke bloqueó la luz iluminadora en la apertura trasera del objetivo, vio
    1. Tanto el campo como las partículas (muestra) eran brillantes.
    2. El campo estaba oscuro y las partículas brillantes.
    3. El campo era brillante y las partículas oscuras.
    4. Tanto el campo como las partículas (espécimen) estaban oscuros
    1. Una célula de cultivo de tejidos de mamíferos
    2. Una delgada sección histológica de hígado.
    3. Microtúbulos de 25 nm polimerizados in vitro
    4. Granos de polen
    1. Poca profundidad de campo
    2. Generalmente es una técnica de mayor resolución que la microscopía de fase.
    3. Requiere una fuente de luz muy brillante
    4. Puede utilizar condensadores y objetivos tanto secos como de aceite
    1. Atenuar y producir un retardo de fase de ¼ l de la luz iluminante
    2. Aumenta el brillo relativo y produce un retardo de fase de ¼ l de la luz de iluminación.
    3. Atenuar y producir un avance de fase de ¼ l de la luz iluminante
    4. Atenuar y producir un avance de fase l de la luz iluminante
    1. El anillo de fase retarda o avanza la fase de la luz de iluminación en relación con la luz dispersa en la mitad de una longitud de onda.
    2. El anillo de fase reduce la intensidad de la luz iluminante
    3. Los anillos de fase están integrados en la lente del objetivo.
    4. La microscopía de fase requiere un anillo coincidente en la torreta del condensador.

    Respuestas

    1. B
    2. Cierto
    3. C: El campo oscuro, que recoge la luz difractada y la enfoca sobre un fondo oscuro, produce in vitro imágenes muy bonitas de microtúbulos de alto contraste, que son objetos pequeños pero simples. Los otros objetos son más complejos y gruesos y generan una enorme cantidad de luz dispersa que produce una imagen brillante pero pobre en información de células o tejidos.
    4. B: El campo oscuro tiene una resolución limitada ya que el objetivo NA debe ser menor que el NA del condensador. En la práctica, esto significa usar objetivos con NA por debajo de 1. Un objetivo de fase no tiene tales restricciones y uno puede usar lentes NA más altas.
    5. C: En microscopía de fase, desea que la luz que viaja a través de la muestra transparente interfiera con la luz de iluminación para generar contraste. Una muestra fina produce típicamente un retardo de fase de ¼ l de la luz de iluminación. Si la luz de iluminación avanza ¼ l en fase, entonces la muestra y la luz de iluminación estarán ½ l desfasadas, lo que producirá una interferencia destructiva y una imagen más oscura que el fondo. La luz de iluminación también se atenúa para acercarla en intensidad a la luz difractada más débil de la muestra y así generar un mejor contraste.
    6. Falso: Necesita un anillo específico en el condensador que coincidirá con el anillo de fase en cada objetivo. Entonces, la luz de iluminación se limitará y será modificada por el anillo de fase. Además, el anillo del condensador debe ajustarse (con tornillos de fijación) para que esté alineado con el anillo de fase del objetivo en la trayectoria de la luz.
    7. Luz difractada de la muestra que golpea el anillo del anillo de fase.
    8. De modo que el ángulo del cono de la luz de iluminación (ese ángulo está determinado por el N.A. del condensador) no es capturado por el objetivo. Entonces, el campo aparecerá oscuro porque la luz que ilumina no se está reflejando. Sin embargo, parte de la luz difractada por la muestra será recogida por el objetivo.
    9. Parte de la luz de fluorescencia de la muestra es atenuada por el anillo de fase del objetivo, lo que resulta en una pérdida de fotones valiosos si la imagen es tenue. El anillo de fase también extiende ligeramente el disco de Airy.
    10. A

    Cubreobjetos mejorado con nanofotónica para imágenes de fase en biología

    a El cubreobjetos mejorado con nanofotónica (NEC) agrega la capacidad de obtención de imágenes de fase a un cubreobjetos de microscopio normal, reduciendo así los voluminosos métodos de obtención de imágenes de fase al tamaño de un chip. El diseño de menos de 200 nm de espesor consiste en una rejilla espaciada por sublongitud de onda encima de una película ópticamente delgada, sostenida por un sustrato de vidrio. b Demostración ejemplar de formación de imágenes de fase de células cancerosas humanas (células HeLa) utilizando el NEC. Al colocar la placa de Petri que contiene el cultivo celular directamente encima del NEC, se crean imágenes pseudo 3D de las células. Las imágenes obtenidas son similares a las obtenidas por la técnica de imagen de fase convencional de microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC). En la imagen de referencia, grabada sin el NEC, las células son en su mayoría invisibles. c El uso del dispositivo NEC no solo permitió la visualización de la forma general de la célula, sino también las características del interior del núcleo celular (izquierda). Esto se confirmó mediante la comparación con imágenes obtenidas mediante microscopía DIC convencional (centro) y microscopía de fluorescencia (derecha). Crédito: Lukas Wesemann, Jon Rickett, Jingchao Song, Jieqiong Lou, Elizabeth Hinde, Timothy J. Davis y Ann Roberts

    La capacidad de visualizar objetos transparentes como células biológicas es de fundamental importancia en biología y diagnóstico médico. Los enfoques convencionales para lograr esto incluyen microscopía de contraste de fase y técnicas que se basan en la tinción química de células biológicas. Sin embargo, estas técnicas se basan en componentes ópticos costosos y voluminosos o requieren cambiar, y en algunos casos dañar, la celda mediante la introducción de agentes químicos de contraste. Los importantes avances recientes en la tecnología de nanofabricación permiten estructurar materiales a nanoescala con una precisión sin precedentes. Esto ha dado lugar al revolucionario campo de la metaóptica que tiene como objetivo desarrollar componentes ópticos ultracompactos que reemplacen a sus contrapartes ópticas a granel como, por ejemplo, lentes y filtros ópticos. Estos dispositivos metaópticos exhiben propiedades inusuales por las que recientemente han atraído un interés científico significativo como plataformas novedosas para aplicaciones de imágenes.

    En un nuevo artículo publicado en Ciencias de la luz y aplicaciones, un equipo de científicos, dirigido por la profesora Ann Roberts del nodo de la Universidad de Melbourne del Centro de Excelencia del Consejo de Investigación Australiano para Sistemas Metaópticos Transformativos, ha desarrollado un cubreobjetos de microscopio nanoestructurado ultracompacto que permite la visualización de células biológicas no teñidas. El dispositivo se conoce como cubreobjetos mejorado nanofotónica (NEC), ya que agrega la capacidad de generación de imágenes de fase a un cubreobjetos de microscopio normal. En su estudio, los investigadores demostraron que simplemente colocando células biológicas encima del NEC, se obtienen imágenes pseudo 3D de alto contraste de células que de otro modo serían invisibles. Los científicos utilizaron el ejemplo de las células cancerosas humanas (células HeLa) para demostrar el potencial de este nuevo método de obtención de imágenes de fase. El método no solo permitió la visualización de la forma general de las células cancerosas, sino que también hizo visibles los detalles del núcleo celular. Esta capacidad es crucial ya que la detección de cambios en la estructura de las células biológicas sustenta la detección de enfermedades como, por ejemplo, en el caso de la malaria.

    La versión del NEC presentada en la publicación difiere de un cubreobjetos normal por la adición de una película óptica delgada y una rejilla espaciada nanómetros. Sin embargo, el equipo de investigación prevé variaciones más complejas de este concepto para ampliar aún más las capacidades del método para operar en diferentes longitudes de onda y la integración en sistemas de microfluidos o de imágenes ópticas altamente especializados. En conclusión, esta investigación ha demostrado un método de obtención de imágenes de fase completamente nuevo que tiene un potencial significativo para ser parte de los futuros sistemas de imágenes biológicas y herramientas de diagnóstico médico móviles.

    Los científicos resumen el potencial de su método de obtención de imágenes de fase: "Diseñamos un cubreobjetos de microscopio nanoestructurado que nos permite visualizar células biológicas transparentes simplemente colocándolas encima del dispositivo e iluminando a través de ellas. Este es un avance emocionante en el campo de la imagen de fase, ya que nuestro método no requiere el uso de componentes ópticos a granel, tinción química o postprocesamiento computacional como es el caso de los métodos convencionales ". El Prof. Roberts explicó.

    "La falta de disponibilidad de herramientas de diagnóstico médico en muchas naciones en desarrollo se considera una razón para que enfermedades infecciosas como la malaria y la tuberculosis sigan siendo una de las principales causas de muerte. Nuestro enfoque tiene un potencial significativo para convertirse en una herramienta de imágenes de fase ultracompacta y económica que podría integrarse en las cámaras de los teléfonos inteligentes y otros dispositivos móviles para que los diagnósticos médicos móviles estén ampliamente disponibles ". Añadió Wesemann.


    4. Discusión

    Aunque se sabe desde hace mucho tiempo que existen dos poblaciones distintas de abejas melíferas en la misma colonia, dicho conocimiento basado en observaciones de la esperanza de vida [12], el conocimiento sobre sus parámetros bioquímicos en general, es limitado. Principalmente, la vitelogenina, como proteína de almacenamiento y antioxidante, está asociada con la longevidad de las abejas melíferas [13,20,26,27,43,44]. Sin embargo, otros parámetros importantes que también pueden caracterizar distintas poblaciones de abejas melíferas han recibido menos atención. En un intento por llenar este vacío y mejorar el conocimiento sobre la longevidad, el objetivo principal del presente estudio fue evaluar todos los parámetros fisiológicos e inmunológicos fundamentales de los trabajadores adultos y correlacionarlos con generaciones de larga y corta vida de abejas melíferas. De acuerdo con la literatura publicada [13], dividimos las poblaciones de abejas melíferas según el desarrollo estacional. Se consideró que las abejas de octubre a marzo pertenecían a la población longeva y las abejas del resto del año a la población de vida corta. Septiembre y abril se consideraron meses de transición entre estaciones y se les prestó menos atención, ya que existía una alta probabilidad de una distribución uniforme de ambas poblaciones de abejas melíferas en la colmena.

    Según observaciones anteriores, un mayor contenido de proteínas y lípidos en la hemolinfa de las abejas de invierno coincidió con una mayor cantidad de estos compuestos en su cuerpo graso [45]. Se espera este aumento porque las abejas melíferas tienen que crear nutrientes de almacenamiento para la temporada de invierno. Todos los organismos, incluidas las abejas, deben mantener concentraciones estables de nutrientes básicos en sus sistemas circulatorios y, en caso de necesidad, estos nutrientes pueden reponerse a partir de los tejidos de almacenamiento. En concordancia, encontramos que los niveles de carbohidratos son muy estables durante el año. Como era de esperar, detectamos un rápido aumento de los carbohidratos en septiembre de 2018, cuando el muestreo se realizó el día después de la administración de la solución de sacarosa a las colmenas como reemplazo de la miel. Como esta práctica podría interferir con la evaluación del desarrollo estacional del nivel de carbohidratos, así como los niveles de otros nutrientes en la hemolinfa, muestra claramente que el muestreo para la evaluación de los parámetros bioquímicos sugeridos de longevidad debe planificarse con precisión con respecto al tratamiento de la colonia. Durante el año, las únicas fuentes de proteínas y carbohidratos para las abejas son el polen y el néctar, respectivamente [46]. Las diferencias entre el verano de 2017 y el verano de 2018 podrían deberse a la variación de las fuentes de alimentos durante la temporada [47].

    Debido a que se observó que la parte celular del sistema inmunológico en generaciones longevas estaba limitada, con fagocitosis alterada y formación de nódulos [27,28], las abejas melíferas tienen que depender de la parte humoral del sistema inmunológico durante el período invernal. Esto se corresponde con la mayor actividad antibacteriana de la hemolinfa en la población de invierno, que puede ser causada por péptidos antibacterianos inducibles como apidaecina, himenoptaecina, abaecina o compuestos antibacterianos constitutivos como la lisozima presente en la hemolinfa [10,48,49,50]. Además, este aumento en la actividad antibacteriana se correlaciona con niveles más altos de proteínas en la generación de abejas de miel de invierno. Por otro lado, algunos autores informaron una expresión reducida de genes inmunes en la generación de larga vida y, por lo tanto, una mayor susceptibilidad a las enfermedades [27, 28, 51]. Otra parte importante del sistema inmunológico humoral, la actividad de la enzima fenoloxidasa [52], no mostró una actividad significativamente mayor durante el invierno. Sin embargo, observamos una pequeña tendencia creciente en la actividad de OP en la generación longeva consistente con Louren & # x000e7o et al. [53], que también mostró un aumento en la actividad de OP en los trabajadores que viven más tiempo. El genoma de la abeja melífera posee solo un gen que codifica la profenoloxidasa precursora de PO, mientras que tres y nueve están presentes en Drosophila y Anofeles, respectivamente [49]. Además, la actividad enzimática de la PO es difícil de determinar debido a la rápida activación y el agotamiento del sistema de la PO [52]. Este proceso dinámico conduce a resultados muy variables y es necesario utilizar muestras de hemolinfa recién recolectadas. Por estas razones, el parámetro no es adecuado para las pruebas ocasionales de la longevidad de las abejas melíferas en la práctica apícola.

    Durante la temporada de invierno, las abejas melíferas dependen del almacenamiento de miel como principal y única fuente de alimento. Esta dieta, compuesta principalmente de carbohidratos, puede influir en la composición y función de los hemocitos en las poblaciones de abejas melíferas de larga vida [28,54], lo que conduce a la supresión de la inmunidad celular. Durante el invierno, los hemocitos participan menos en la lucha contra los patógenos que durante la temporada de verano. Como una de las principales razones, se identificaron los altos costos energéticos del mantenimiento de los hemocitos en varios organismos [55,56,57], lo que requiere muchos recursos que son moderados en invierno. Además, muchos autores describieron que el número de hemocitos en circulación depende de la edad de la abeja melífera, y se observó una fuerte reducción en el número de hemocitos en las abejas viejas [24,25,29,30]. Nuestros resultados mostraron un ligero aumento en el número de hemocitos durante el verano de 2017 y el invierno de 2017/2018 en comparación con la media anual, pero sin significación estadística. Aunque no pudimos confirmar la variabilidad estacional dependiente del número de hemocitos, esto podría deberse en parte al muestreo de abejas de edad inespecífica.

    La vitelogenina es una glicolipoproteína de almacenamiento interno conocida sintetizada en las células del cuerpo graso y liberada en la hemolinfa [58,59]. Estudios anteriores, además del presente, han considerado que un nivel más alto de vitelogenina en la hemolinfa es un marcador de abejas invernales [43,60,61,62,63]. Debido a que cantidades más altas de vitelogenina en la hemolinfa indican la existencia de abejas melíferas de larga vida, se considera que es un componente importante para la hibernación [64]. Para confirmar que la forma más abundante de vitelogenina de 180 kDa está presente en la hemolinfa [58,59], utilizamos una muestra de hemolinfa de drones como control negativo. Como se describió anteriormente, los drones tienen la vitelogenina solo en las primeras etapas de su vida, y desaparece cuando tienen tres o más semanas de vida [40,65,66,67,68]. Nuestros resultados confirmaron estos hallazgos, sin embargo, el uso de una sola medición de parámetro como marcador de longevidad puede no ser suficiente. Según el análisis de componentes principales, el nivel total de proteínas de la hemolinfa se correlacionó en gran medida con los cambios fisiológicos en el cuerpo de la abeja durante la temporada de invierno, así como con la actividad antibacteriana medida contra las bacterias modelo no patógenas. M. luteus. Nuestras conclusiones están respaldadas por estudios previos [12,63,69,70]. Dainat y col. (2012) informaron sobre la regulación positiva de genes inmunes como marcador predictivo al mismo tiempo, mencionaron Varroa la infestación como marcador predictivo del trastorno de colapso de colonias [10].

    Debido a que algunos autores describieron diferencias fisiológicas entre las abejas melíferas criadas en distintas condiciones [71] e incluso variaciones entre colonias [72], empleamos mediciones de dos colonias más en junio de 2018. Todas las colmenas analizadas no difirieron en ningún parámetro fisiológico (Figura S3 ). De manera similar, hay consistencia entre las colonias en las reacciones inmunológicas medidas (Figura S4), excepto por la actividad de PO que fue menor en la colonia 1 que en otras. Sin embargo, la actividad de PO es un parámetro muy variable y no se consideró adecuado para la comparación de las poblaciones de abejas melíferas de verano e invierno.

    Se sabe que el clima puede tener una influencia significativa sobre las abejas melíferas durante la invernada [73], la actividad de forrajeo [74] o las cargas virales [75] en las colmenas. En lugar del impacto directo del clima en los individuos de abejas melíferas, la reducción del flujo de polen y, por lo tanto, la nutrición deficiente pueden causar problemas relacionados con la desnutrición [7,76,77]. Por lo tanto, recopilamos datos sobre el clima, específicamente la temperatura y la humedad en la ubicación del colmenar. Durante el experimento, los cambios de los parámetros climáticos fueron típicos del clima templado, caracterizado especialmente por las bajas temperaturas invernales. Se observaron diferencias menores entre los años 2017 y 2018.Sin embargo, por ejemplo, el cambio de temperatura en abril de 2017 en comparación con abril de 2018, donde la temperatura promedio fue inferior a 10 & # x000b0C en este último, se supone que tiene un impacto en el desarrollo de la colonia. durante el resto del año. De manera similar, casi el doble de temperatura en mayo de 2018 en comparación con mayo de 2017 podría afectar el inicio de la cría [78,79,80] o la fenología [81,82,83] de las abejas en la colonia.

    La ventaja de los métodos seleccionados es la relativa simplicidad, por lo tanto, los apicultores podrían cooperar con un amplio espectro de laboratorios en los que se pueden implementar los análisis. Sin embargo, si se considerara el mayor tiempo de transporte y almacenamiento de las abejas o de la hemolinfa muestreada, se debe considerar la influencia de estos factores en los resultados de los análisis. Con respecto a los resultados de nuestro estudio, la concentración de proteína total y los niveles de vitelogenina y actividad antibacteriana en la hemolinfa podrían usarse como marcadores relativamente simples para determinar la presencia de abejas melíferas longevas en una colonia. Con base en los resultados de los análisis y su comparación con los valores fisiológicos proporcionados en la Figura 5, los apicultores pudieron ajustar el cuidado de sus colonias. Pueden tomar precauciones prácticas para proteger las colmenas. Por ejemplo, la unión de dos o más colonias débiles para crear una fuerte es una posible solución, o se podrían usar varias capas de aislamiento agregadas a una colmena para una mejor protección de las colonias subdesarrolladas [23,35]. Además, el tratamiento de las poblaciones de vida corta contra los patógenos podría reflejarse en la población de vida prolongada dañada. Por lo tanto, las colonias subdesarrolladas podrían eliminarse para ahorrar dinero en alimentación y otros costos. Estas precauciones basadas en los resultados de los análisis podrían reducir las pérdidas invernales de las abejas melíferas.

    En el estudio actual se demostró el potencial de los marcadores seleccionados para distinguir entre las poblaciones de abejas melíferas de verano e invierno en el clima templado. Dado que este estudio se realizó en una colmena, los experimentos futuros involucrarían esfuerzos para medir los tres parámetros sugeridos en una gran cantidad de colonias de abejas melíferas para diferenciar el genotipo y las variables ambientales y correlacionar los resultados de los análisis con la tasa de hibernación exitosa. Con base en este estudio, sugerimos dos muestreos preventivos por año en junio y octubre. Cuando se comparan entre sí y con los datos proporcionados en nuestro estudio, los resultados de los muestreos preventivos podrían proporcionar información útil sobre la preparación de las abejas longevas que son indispensables para una hibernación exitosa. La capacidad de distinguir de manera confiable las dos poblaciones de abejas puede proporcionar una herramienta sólida y útil para los apicultores. Podían estimar la proporción de abejas longevas en las colmenas y, basándose en los resultados, predecir posibles problemas de hibernación. Nuestro trabajo proporciona conocimientos básicos sobre los cambios en los parámetros fisiológicos e inmunológicos en colonias de abejas melíferas establecidas durante un período prolongado de casi dos años. Los datos recopilados se pueden utilizar como piedra angular para futuros estudios que estimen las proporciones de abejas melíferas longevas en su colonia.


    Evaluación de riesgos

    La microbiología escolar generalmente será segura, pero antes de emprender cualquier actividad práctica, se deben evaluar los riesgos.

    Cada individuo (estudiantes, técnicos o profesores) que se embarque en una actividad práctica es responsable de su salud y seguridad y de las demás personas afectadas por el trabajo.

    La evaluación de riesgos implicará comparar los pasos involucrados en una actividad prevista con los procedimientos sugeridos en las evaluaciones de riesgos del modelo. Esto identificará las precauciones de seguridad que deben tomarse en el contexto del nivel de trabajo y, posiblemente, la necesidad de modificar el procedimiento para minimizar los riesgos para la salud y la seguridad derivados de cualquier peligro.

    También deben cumplirse las normas locales. Lo más importante en la evaluación de riesgos es la consideración de las habilidades y el comportamiento de los estudiantes que están por abordar una actividad práctica, un procedimiento que es seguro para un grupo de personas puede necesitar ser modificado con una clase diferente.

    También es importante garantizar que un procedimiento sea seguro para los alumnos, pero que tampoco ponga en peligro la salud y la seguridad de los técnicos o profesores durante su preparación o eliminación. Al decidir las precauciones apropiadas a adoptar, es prudente que todos los cultivos sean tratados como potencialmente patógenos (por ejemplo, debido a una posible contaminación).

    También se deben considerar los procedimientos de emergencia, como hacer frente a los derrames.


    Abstracto

    La formación de imágenes de fase cuantitativa y la microscopía holográfica digital han demostrado ser muy prometedoras para visualizar el movimiento, la estructura y la fisiología de los microorganismos y las células de los mamíferos en tres dimensiones. Sin embargo, estas técnicas de formación de imágenes carecen actualmente de agentes de contraste molecular análogos a los tintes fluorescentes y las proteínas que han revolucionado la microscopía de fluorescencia. Aquí presentamos los primeros agentes de contraste de fase genéticamente codificables basados ​​en vesículas de gas. El índice de refracción relativamente bajo del núcleo lleno de aire de las vesículas de gas da como resultado un avance de la fase óptica en relación con los medios acuosos, lo que los convierte en un agente de contraste de fase "positivo" que se distingue fácilmente de los orgánulos, tintes o microminerales. Demostramos esta capacidad identificando y rastreando el movimiento de las vesículas de gas y las bacterias que expresan las vesículas de gas utilizando microscopía holográfica digital y obteniendo imágenes de la captación de vesículas de gas diseñadas por células de mamíferos. Estos resultados dan a las imágenes de fase un agente de contraste biomolecular, ampliando las capacidades de esta poderosa tecnología para imágenes biológicas tridimensionales.


    INTRODUCCIÓN

    La encapsulación celular de patógenos por hemocitos (células sanguíneas) es común a diversos huéspedes invertebrados (Salt, 1963, 1970 Ratner y Vinson, 1983 Gotz, 1986 Lackie, 1988 Gillespie et al. 1997), es importante para la resistencia a patógenos en insectos vectores de enfermedades humanas (Richman y Kafatos, 1996) y es funcionalmente similar a la formación de granulomas en vertebrados (Adams, 1976). En esta respuesta inmune, los patógenos en la hemolinfa (sangre) se reconocen como extraños, lo que activa a los hemocitos para que migren hacia el patógeno, se adhieran y se consoliden alrededor del patógeno, formando una cápsula multicelular de múltiples capas. Se cree que la cápsula forma una barrera física para el escape de patógenos, pero los patógenos también pueden ser eliminados activamente por los radicales libres liberados por el huésped dentro de la cápsula (Nappi et al. 1995, 2000 Nappi y Vass, 1998 Kraaijeveld et al. 2011). En Drosophila melanogaster y algunos otros organismos, la encapsulación se acompaña de melanización, la deposición de melanina alrededor del patógeno dentro de la cápsula, que se cree que fortalece la barrera física para la eclosión de huevos de larvas (Gillespie et al. 1997 Cartón et al. 2008 Nappi et al. 2009). La encapsulación celular suele producirse en respuesta a patógenos que son demasiado grandes o demasiado numerosos para ser fagocitados por hemocitos individuales.

    Drosophila melanogaster los hemocitos se han dividido en cuatro clases: (1) los plasmatocitos son células pequeñas que comprenden

    El 95% de todos los hemocitos en moscas no inducidas, actúan como centinelas de la infección y son responsables de la fagocitosis, además de servir como capas celulares iniciales de las cápsulas en desarrollo (2) las células cristalinas comprenden el 5% restante de los hemocitos en pie y portan precursores para generar melanina, que es importante en la cicatrización de heridas y se deposita alrededor de objetos encapsulados (3) los podocitos son células de tamaño mediano inducidas después de una infección que contienen numerosos filopodios o extensiones citoesqueléticas, y se consideran una forma intermedia entre plasmatocitos y lamelocitos (4) los lamelocitos son grandes células aplanadas que se diferencian después de la infección de los plasmatocitos y de los prohemocitos de las glándulas linfáticas, y son responsables de formar las capas celulares externas de las cápsulas en desarrollo (Rizki, 1957 Rizki y Rizki, 1980 Carton et al. 1986 Russo et al. 1996 Williams, 2007 Honti et al. 2009 Markus et al. 2009 Stofanko et al. 2010). Por tanto, los plasmatocitos y lamelocitos son los principales componentes celulares de D. melanogaster cápsulas. Sin embargo, debido a que la morfología de los hemocitos es muy variable entre los linajes de invertebrados, la organización de un esquema general de clasificación de hemocitos ha sido difícil y muchas clases de hemocitos con nombres diferentes participan en las respuestas de encapsulación de diferentes especies hospedadoras (Wigglesworth, 1959 Jones, 1962 Rizki, 1962 Lackie, 1988 Gupta, 1994 Lavine y Strand, 2002).

    Para estudiar la encapsulación celular y otros mecanismos de inmunidad contra macroparásitos, se debe elegir un parásito adecuado. Las avispas endoparasitoides son ubicuas, actúan como especies clave en los ecosistemas naturales, se utilizan en el control biológico de plagas de insectos y, a menudo, inducen una respuesta de encapsulación celular cuando ponen sus huevos en los hemocele de sus huéspedes (LaSalle y Gauld, 1993). Estas avispas son una seria amenaza para los juveniles de Drosophila, ya que más del 50% de las larvas de mosca están infectadas en poblaciones naturales (Driessen et al. 1990 Janssen et al. 1988 Fleury et al. 2004). Se sabe que cuatro familias de avispas infectan a Drosophila en la naturaleza: los miembros de Braconidae y Figitidae infectan las larvas de Drosophila, mientras que los miembros de Diapriidae y Pteromalidae infectan las pupas de Drosophila (Carton et al. 1986). Las avispas inyectan veneno en las moscas, junto con sus huevos, para suprimir la respuesta de encapsulación de las moscas, pero los venenos de los endoparasitoides de Drosophila solo se caracterizan parcialmente. Se han encontrado partículas similares a virus con propiedades inmunosupresoras en las glándulas venenosas de algunas figitidas, pero presumiblemente la mayoría de las proteínas de virulencia de las avispas se producen de forma independiente en las glándulas venenosas y los ovarios (Cartón et al. 1986, 2008 Colinet et al. 2013 Goecks et al. Mortimer 2013 et al. 2013). Si los huevos de avispa eclosionan con éxito, las larvas de avispa crecen dentro de las larvas de mosca y pupas durante varios días antes de consumir finalmente las pupas de mosca de adentro hacia afuera, eclosionando de los casos de pupas hospedantes. El éxito de la respuesta de encapsulación celular contra avispas en todo el D. melanogaster Se ha encontrado que el subgrupo está fuertemente correlacionado con cargas de hemocitos constitutivas e inducidas (Eslin y Prevost, 1998 Kraaijeveld et al. 2001 Sorrentino et al. 2004 Moreau et al. 2005 Kacsoh y Schlenke, 2012). Sin embargo, se desconoce si esta relación se extiende a todo el género Drosophila o incluso si las especies de Drosophila más distantes utilizan el mismo mecanismo de encapsulación melanótica para matar endoparasitoides de avispa.

    El género Zaprionus comprende más de 50 especies descritas (Chassagnard y Tsacas, 1993) y se sabe que está incrustado filogenéticamente dentro del género Drosophila, aunque su afinidad con subgéneros particulares de Drosophila aún no está clara (Markow y O & # x02019Grady, 2006). Zaprionus se distingue por el hecho de que todas las especies poseen franjas distintas (generalmente longitudinales) de color claro (Fig. 1). Las especies Zaprionus indianus, en particular, es originaria de África, Oriente Medio y el sur de Eurasia, pero recientemente ha ganado atención debido a su propagación a América del Norte y del Sur, donde causa graves daños económicos como una especie plaga de higos (Santos et al. 2003 Stein et al. 2003 van der Linde et al. 2006). Las avispas parásitas se han utilizado con éxito como agentes de control biológico contra una amplia gama de plagas agrícolas (Huffaker, 1971 Debach, 1974 Clausen, 1978 Greathead, 1986 LaSalle y Gauld, 1993), pero aún no se han utilizado contra las Drosophilids. Dado Z. indianus es parte de un subgénero de Drosophilid único y es una amenaza agrícola creciente, decidimos probar su mecanismo (s) de resistencia contra un panel diverso de avispas parásitas de Drosophila (Fig. 2). Este panel incluye representantes de tres de las cuatro familias de avispas que se sabe que infectan a Drosophila, así como múltiples cepas de un total de 15 especies de avispas. Hasta el momento, se sabe muy poco sobre la interacción entre Z. indianus y avispas parásitas en la naturaleza, aparte de que pueden ser infectadas por Figitid Dicerataspis grenadensis (Guimaraes y Zucchi, 2004). Se ha encontrado que otras especies de Zaprionus sirven como hospedadores adecuados para Figitid Heterotoma de leptopilina (Jenni, 1951).


    20 - Una guía de cultivo celular básico y aplicaciones en biomateriales e ingeniería de tejidos

    Este capítulo presenta que muchos de los avances en la comprensión de la biología celular han surgido del aislamiento celular y in vitro estudios. Sin embargo, se debe tener precaución al comparar in vitro modelos al multifactorial y multicelular en vivo medio ambiente. Las células invariablemente se comportan de manera diferente en vivo debido a la presencia de otros tipos de células, numerosos factores de señalización celular y la matriz extracelular y las diferencias fisiológicas en términos de estrés mecánico, flujo sanguíneo y crecimiento 3-D. El tipo de celda también debe seleccionarse cuidadosamente para in vitro experimentos para relacionarse con el en vivo medio ambiente. Por ejemplo, debido a la facilidad de aislamiento, la gran mayoría de los estudios de cultivo celular en células endoteliales se han realizado en células endoteliales aisladas de macrovasos (vasos grandes), en prepucio humano. Sin embargo, ahora se ha demostrado que la expresión fenotípica y el comportamiento de las células endoteliales altera tanto el tipo de vaso (sangre, vena o vaso linfático), el tamaño del vaso (capilar, arteriola o arteria) como también la ubicación de los vasos (piel, cerebro, etc.). No se sabe si estas diferencias en el comportamiento de las células endoteliales son inducidas por factores producidos en el entorno local y / o debido a diferentes linajes de células endoteliales, pero es evidente que la selección del tipo de células endoteliales tiene consecuencias importantes para el éxito de los tejidos y biomateriales modificados por ingeniería de tejidos. investigar.



Comentarios:

  1. Portier

    Cometes un error. Puedo defender la posición.

  2. JoJogrel

    Respuesta rápida, una señal mental :)

  3. Mimuro

    latidos

  4. Verrell

    Qué palabras ...

  5. Maura

    Lo siento, estoy interrupción.



Escribe un mensaje