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¿Especificidad de las proteínas quinasas en las vías de señalización ...?

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En la mayoría de las vías de señalización, cuando el receptor activado activa la proteína quinasa a través de la acción del mensajero secundario, estas proteínas quinasas casi siempre se fosforilan en los residuos de aminoácidos específicos de serina, treonina o tirosina. cuál es la razón de fosforilar específicamente estos residuos de aminoácidos. ¿Por qué no se eligen otros residuos de aminoácidos para la fosforilación?


La fosforilación requiere un nucleófilo y el oxígeno hidroxilo actúa como tal. La serina, la teronina y la tirosina se fosforilan de forma libre. OH grupo en sus cadenas laterales.

El nitrógeno, en algunos casos, también puede actuar como nucleófilo. En el caso de la histidina, el nitrógeno del imidazol se fosforila durante la señalización de la quimiotaxis bacteriana. Hasta donde yo sé, los eucariotas no tienen una enzima para la fosforilación de histidina.

Los grupos carboxílicos en el glutamato y el aspartato técnicamente pueden fosforilarse como sucede en el caso del fosfoglicerato. El glutamato es fosforilado por la enzima glutamina sintasa durante la síntesis de glutamina. Lo mismo sucede en el caso del aspartato durante la síntesis de aspargina. Sin embargo, este es un intermedio reactivo y la fosforilación no es estable como la de los hidroxilos.

Otros aminoácidos no tienen grupos nucleofílicos como para atacar el átomo de fósforo en el fosfato, por lo que no están fosforilados.


Esto se debe principalmente a la naturaleza de los aminoácidos. Debe tener un grupo hidroxi en la cadena lateral del aminoácido, que es el punto donde se une el fosfogrupo. Dado que este proceso debe ser reversible, esto solo puede suceder aquí. Vea la imagen a continuación (desde aquí) sobre la estructura química:

En eucariotas, no solo estos tres están fosforilados, también ocurre la fosforilación de histidina (y ocurre con más frecuencia que la fosforilación de tirosina, consulte este artículo: "Fosforilación de residuos de aminoácidos básicos en proteínas: importante pero fácil de pasar por alto").


Estos residuos se fosforilan porque tienen un grupo hidroxilo libre disponible para unirse a un fosfato. Se pueden modificar muchos otros residuos, como la acetilación de lisinas, pero solo esos residuos son químicamente compatibles con reversible fosforilación.


aquellos están fosforilados porque están presentes en secuencias de consenso y la enzima son específicos para fosforilar el objetivo específico, por eso otros no están fosforilados y también por el grupo OH de estos aminoácidos.


Identificación de vías de señalización activas mediante la integración de la expresión génica y los datos de interacción de proteínas.

Las vías de señalización son los mecanismos biológicos clave que transducen señales extracelulares para afectar la regulación génica mediada por factores de transcripción dentro de las células. Se han desarrollado varios métodos computacionales para identificar la estructura topológica de una vía de señalización específica utilizando datos de interacción proteína-proteína, pero no están diseñados para identificar vías de señalización activas de una manera no sesgada. Por otro lado, existen métodos estadísticos basados ​​en conjuntos de genes o datos de vías que pueden priorizar las posibles vías de señalización activas, pero no hacen un uso completo de la estructura de la vía activa que enlaza el receptor, las quinasas y los factores de transcripción posteriores.

Resultados

A continuación, presentamos un método para predecir simultáneamente el conjunto de vías de señalización activas, junto con su estructura de vías, mediante la integración de la red de interacción proteína-proteína y los datos de expresión génica. Evaluamos la capacidad de nuestro método para predecir vías de señalización activa para células epiteliales dentales, células epiteliales del cristalino ocular, células epiteliales del cristalino derivadas de células madre pluripotentes humanas y células de fibra del cristalino. Este análisis mostró que nuestro enfoque podría identificar todas las vías activas conocidas que están asociadas con la formación de dientes y el desarrollo del cristalino.

Conclusiones

Los resultados sugieren que SPAGI puede ser un enfoque útil para identificar las posibles vías de señalización activa dado un perfil de expresión génica. Nuestro método se implementa como un paquete R de código abierto, disponible a través de https://github.com/VCCRI/SPAGI/ .


Proteínas G y señalización de MAPK

Mecanismo de transducción de señales mediada por proteínas G

Las acciones de muchas señales sensoriales, hormonas y neurotransmisores están mediadas por receptores de superficie celular, que tienen en común una topología de 7 transmembranas (receptores 7TM o 7TMR). Los receptores de esta clase se conservan en organismos tan diversos como humanos, levaduras y plantas. Representan la familia de genes más grande del genoma humano y son el objetivo de la mayoría de los productos farmacéuticos que se utilizan en la actualidad (Hardman et al., 2001).

En términos generales, los 7TMR transmiten sus señales a través de proteínas G. Tras la unión del agonista a su receptor, la proteína G α La subunidad libera difosfato de guanosina (GDP), se une al trifosfato de guanosina (GTP) y se disocia de la proteína G βγ complejo de subunidades (Sprang, 1997). Dependiendo del sistema, Gα o Gβγ o ambos pueden activar entonces múltiples efectores aguas abajo tales como adenilil ciclasa, canales iónicos y fosfolipasas. En la mayoría de los casos, la activación del efector ocurre en la membrana plasmática, pero la activación da como resultado la producción de segundos mensajeros (p. Ej., CAMP o calcio) que se difunden por toda la célula y desencadenan cambios globales, incluida la fosforilación de proteínas, la transcripción de nuevos genes y alteraciones en la homeostasis o diferenciación celular. (Neves et al., 2002). Otros efectores incluyen cascadas de proteína quinasa que incluyen miembros de la familia de proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). Más recientemente, en células de mamíferos, se ha demostrado que los 7TMR también pueden señalizar independientemente de las proteínas G y, en cambio, pueden activar las MAPK a través de una familia de proteínas adaptadoras llamadas arrestinas (Shenoy y Lefkowitz, 2005).

La activación de MAPK por las proteínas G puede ocurrir a través de la fosfolipasa Cβ, que a su vez activa Ras y / o la proteína quinasa C. Cualquiera de las proteínas puede activar la quinasa Raf, las MAPK quinasas y, en última instancia, una MAPK. Otras rutas implican la activación de los miembros de la familia Ras Rac, Cdc42 y Rap. Una vez activada, la MAPK se transloca al núcleo donde fosforila los factores de transcripción, regulando así la expresión de genes que controlan el crecimiento y la diferenciación celular (Gutkind, 1998 Marinissen y Gutkind, 2001).

Menos estudiados son los sustratos no nucleares para MAPK. Solo se han identificado unos pocos, pero esta lista incluye componentes de señalización de la proteína G, como las quinasas del receptor GRK y β-arrestin, dos clases de proteínas que modulan la intensidad y especificidad de la señalización del receptor acoplado a proteína G (Lin et al., 1999 Pitcher et al., 1999). Los reguladores de la señalización de la proteína G (proteínas RGS, descritas a continuación) también se fosforilan mediante MAPK aguas abajo (Garrison et al., 1999 Ogier-Denis et al., 2000 Parnell et al., 2005). Por tanto, la actividad de los receptores y las proteínas G puede estar coordinada en parte por la capacidad de las MAPK para fosforilar los factores reguladores que actúan a lo largo de la vía de señalización, tanto en los mecanismos de retroalimentación como en los de retroalimentación.

GRAMOα las proteínas eventualmente hidrolizan el GTP a GDP, momento en el cual las subunidades de la proteína G se vuelven a asociar y la señalización se detiene. La actividad de la GTPasa se acelera aún más mediante las proteínas RGS. Entonces, como la especificidad de la señal agonista depende de la capacidad de las proteínas G para acoplarse solo al receptor y efector apropiados, la intensidad de la señal depende de las tasas de unión e hidrólisis de GTP, eventos catalizados por receptores ocupados por agonistas y proteínas RGS. , respectivamente (Neubig y Siderovski, 2002 Chasse y Dohlman, 2003).

Debido al potencial de la nueva farmacología, un área emergente de investigación se centra en cómo se regula la intensidad de la señal. A continuación, describimos ejemplos de mecanismos reguladores clave que actúan sobre la cascada efectora prototípica 7TMR - proteína G - MAPK. Nuestro énfasis está en el modelo de levadura, pero dadas las extensas similitudes estructurales y funcionales entre los sistemas de señalización de la levadura y los mamíferos, los descubrimientos realizados en la levadura son generalmente aplicables también a los seres humanos.

Proteínas G y MAPK como dianas farmacológicas

Así como se sabe que la mayoría de los remedios clínicamente importantes actúan sobre los receptores acoplados a proteína G en la superficie celular (Hardman et al., 2001), las proteínas de señalización intracelular representan dianas farmacológicas potencialmente útiles, particularmente en situaciones en las que un defecto genético conduce a Activación persistente por el receptor. De hecho, el vínculo claro entre las alteraciones genéticas en los componentes de señalización y la fisiopatología humana proporciona una fuerte evidencia de que los inhibidores químicos de la proteína G y la señalización de MAPK podrían ser útiles y efectivos como fármacos (Roberts y Der, este número). Los fármacos que inhiben la función de MAPK podrían funcionar interfiriendo con la activación de la proteína G, la hidrólisis de GTP mediada por RGS, la producción de segundo mensajero, la función catalítica de MAPK, la actividad de la fosfatasa de MAPK o la translocación de MAPK al núcleo.

Los esfuerzos de descubrimiento de fármacos dirigidos a los componentes de señalización de la proteína G o MAPK aún están en su infancia, pero se han informado éxitos tempranos. Los laboratorios académicos han identificado inhibidores de moléculas pequeñas de las proteínas RGS (Roman et al., 2006). Más adelante en el "pipeline" de fármacos se encuentran los inhibidores de las proteínas quinasas de moléculas pequeñas. La evidencia sorprendente del potencial de las proteínas quinasas como dianas de fármacos proviene del descubrimiento del mesilato de imatinib (Gleevec), un inhibidor de molécula pequeña competitivo con ATP del producto oncogénico Bcr-Abl. El tratamiento con Gleevec puede inducir remisiones completas en las primeras etapas de la leucemia mielógena crónica (Barnes y Melo, 2003). Sin embargo, un problema importante en cualquier esfuerzo de desarrollo de fármacos es la identificación de objetivos apropiados para la intervención terapéutica. No es suficiente saber que una proteína G o proteína quinasa particular se activa en un estado de enfermedad específico, porque la desregulación puede ser la consecuencia más que la causa subyacente de la patología de la enfermedad. Como mínimo, se necesitan datos genéticos o fisiológicos / biológicos celulares claros para implicar a una proteína quinasa como un objetivo potencial.

Otro problema importante es la selección de qué isoforma (s) de cualquier componente dado se debe apuntar. Por ejemplo, hay aproximadamente 40 isoformas de RGS, cada una con amplias distribuciones tisulares (Gold et al., 1997). Entre las vías de señalización de MAPK, los objetivos candidatos incluyen al menos 11 MAPK, pero también hay otras siete MAPK quinasas (MAPKK) y al menos 20 MAPK quinasas quinasas (MAPKKK). Las MAPK se dividen en cinco subfamilias: estas son (i) quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2, (ii) quinasa N-terminal c-Jun (JNK) 1/2/3, (iii) p38α, β, γ y δ, (iv) ERK5 y (v) ERK7. Las variantes de empalme contribuyen aún más a la complejidad de seleccionar los objetivos adecuados. Finalmente, la amplia expresión de RGS y MAPK, y su función en diversas respuestas biológicas, sugiere que se observarían efectos no deseados y toxicidad potencial con inhibidores. Por tanto, no está claro cuál de las isoformas específicas, si es que hay alguna, puede inhibirse con una respuesta terapéutica útil y sin efectos adversos.

A pesar de estas complicaciones, los inhibidores de procesos relacionados con MAPK se encuentran en ensayos clínicos o en desarrollo preclínico para una variedad de enfermedades cardiovasculares, incluidos síndromes coronarios agudos, accidente cerebrovascular, hipertensión, diabetes y síndrome metabólico (revisado en (Force et al., 2004 Johnson et al., 2005 Sebolt-Leopold e English, 2006). Los inhibidores de p38 son los que han avanzado más en los ensayos clínicos (Kumar et al., 2003). Los inhibidores de las quinasas MAPK MAPK / ERK quinasa (MEK) 1 y MEK2 también son en ensayos clínicos para el tratamiento de una variedad de tumores. Al menos un inhibidor de MAPKKK (CEP-1347) ha avanzado a ensayos clínicos de fase II (Roberts y Der, este número). Aunque lejos de ser exhaustivos, estos ejemplos sugieren la posibilidad de futuros éxito.


Abstracto

Las proteínas quinasas son enzimas que modifican covalentemente proteínas uniendo grupos fosfato (de ATP) a residuos de serina, treonina y / o tirosina. Al hacerlo, se modifican las propiedades funcionales de los sustratos de la proteína quinasa. Las proteínas quinasas transducen señales de la membrana celular al interior de la célula. Dichas señales incluyen no solo las que surgen de las interacciones ligando-receptor, sino también perturbaciones ambientales, como cuando la membrana sufre una deformación mecánica (es decir, estiramiento celular o tensión de cizallamiento). En última instancia, la activación de las vías de señalización que utilizan proteínas quinasas a menudo culmina en la reprogramación de la expresión génica mediante la regulación directa de factores de transcripción o mediante la regulación de la estabilidad del ARNm o la traducción de proteínas. Las proteínas quinasas regulan la mayoría de los aspectos de la función celular normal. La disfunción fisiopatológica de las vías de señalización de la proteína quinasa subyace en la base molecular de muchos cánceres y de varias manifestaciones de enfermedad cardiovascular, como la hipertrofia y otros tipos de remodelado del ventrículo izquierdo, lesión por isquemia / reperfusión, angiogénesis y aterogénesis. Dadas sus funciones en una variedad tan amplia de estados patológicos, las proteínas quinasas se están convirtiendo rápidamente en dianas extremadamente atractivas para el descubrimiento de fármacos, probablemente sólo superadas por los receptores heterotriméricos acoplados a proteína G (p. Ej., Angiotensina II). Aquí, revisaremos las razones de esta explosión de interés en los inhibidores de proteína quinasas y describiremos el proceso de identificación de nuevos fármacos dirigidos contra quinasas. Nos centraremos específicamente en los estados de enfermedad para los que el desarrollo de fármacos ha avanzado hasta el punto de estudios clínicos o preclínicos avanzados.

Está surgiendo un consenso de que los moduladores de proteína quinasa serán tratamientos efectivos para una variedad de enfermedades. 1 Sin embargo, inicialmente se pensó que las proteínas quinasas eran dianas farmacológicas inadecuadas, en gran parte debido a lo que se percibía como un grado desfavorablemente alto de conservación estructural dentro de los dominios clave de todas las proteínas quinasas. Debido a que la unión de ATP a quinasas es esencial para la actividad quinasa y las propiedades del bolsillo de unión de ATP de proteína quinasa eran bien conocidas, los agentes dirigidos al bolsillo de ATP eran la primera opción lógica para el desarrollo de fármacos. Sin embargo, la conservación estructural de los sitios de unión de la proteína quinasa ATP y la presencia de más de 500 proteína quinasas en el genoma humano 2 llevaron a la creencia de que sería difícil generar inhibidores de proteína quinasa de molécula pequeña altamente selectivos que se dirijan al bolsillo de ATP. Como se discutirá más adelante, el desarrollo y caracterización de inhibidores de las proteína quinasas activadas por mitógeno p38 (MAPK) indicó que esta creencia inicial estaba equivocada. Un segundo argumento en contra de la selección de proteínas quinasas para el desarrollo de fármacos fue la observación de que la modulación de una proteína quinasa podría resultar beneficiosa en un sistema, mientras que en otro podría resultar perjudicial. Como ejemplo extremo de esto, la inhibición de una proteína quinasa necesaria para desencadenar la muerte celular programada podría reducir la muerte celular inducida por isquemia en cardiomiocitos diferenciados terminalmente, pero también podría favorecer la promoción de tumores en otros órganos o tipos de células. Finalmente, la toxicidad con el uso a largo plazo fue motivo de preocupación. Por tanto, la inhibición de una proteína quinasa que está desregulada en un órgano en un estado de enfermedad particular puede resultar perjudicial para otros sistemas en los que esa misma proteína quinasa no está desregulada, sino que cumple funciones esenciales. Por ejemplo, la inhibición del receptor de tirosina quinasa HER2 de la superficie celular con el anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin, Genentech) en pacientes con cánceres de mama que sobreexpresan ese receptor ha producido resultados sorprendentemente beneficiosos, pero a expensas de la disfunción cardíaca grave en algunas mujeres. recibir la terapia, lo que sugiere un papel fundamental de este receptor en la supervivencia de los cardiomiocitos. 3

Teniendo en cuenta todas las preocupaciones anteriores, la "prueba de principio" del tremendo potencial terapéutico de los inhibidores de molécula pequeña de las proteína quinasas llegó con el descubrimiento del mesilato de imatinib (Gleevec, STI-571, Novartis), un ATP inhibidor de la molécula de la proteína de fusión tumorigénica Bcr-Abl (revisada por Barnes y Melo 4) (Tabla Figura 1). c-Abl es una proteína tirosina quinasa nuclear cuya función biológica no está clara (aunque puede funcionar para detectar la integridad del genoma y promover la muerte celular programada). Bcr es un polipéptido citosólico multifuncional que puede desempeñar un papel en la regulación de la actividad de la subfamilia Rho de proteínas G pequeñas. La fusión de Bcr y Abl para producir Bcr-Abl surge de la translocación cromosómica que crea el cromosoma Filadelfia. A diferencia de c-Abl, Bcr-Abl es tanto citosólico como nuclear, y debido a que forma homodímeros que se cruzan con fosforilación y se activan entre sí, Bcr-Abl manifiesta actividad tyr quinasa constitutivamente activa y dirigida de manera inapropiada. Bcr-Abl es causal en la leucemia mielógena crónica y el tratamiento con imatinib ha podido inducir remisiones completas, al menos en las primeras etapas de la enfermedad. 4

Inhibidores seleccionados de proteína quinasas en ensayos clínicos

Figura 1. Estructuras químicas de varios inhibidores de proteína quinasa de molécula pequeña a los que se hace referencia en el texto. Estos se pueden dividir en inhibidores que son competitivos con ATP, incluidas fenilamino pirimidinas (p. Ej., STI-571), piridinilimidazoles (SB202190, SB203580 y SB239063), antraprazolonas (SP600125) y maleimidas (SB415286), y los que no son Competitivo con ATP (inhibidores de MEK1 / 2, U0126, PD184352 y PD98059, que mantienen las quinasas en un estado inactivo evitando su fosforilación mediante la activación de quinasas corriente arriba como Raf). BIRB796, una pirazol urea, no es competitiva y es competitiva (ver texto).

De hecho, el campo del cáncer ha liderado el camino al impulsar el desarrollo de fármacos dirigidos tanto a las proteínas quinasas que, como Bcr-Abl, se activan por mutaciones y conducen directamente a la desregulación del crecimiento como a las proteínas quinasas "permisivas" que, aunque por lo demás son normales en sí mismas, sirven como efectores esenciales para productos génicos mutantes desregulados. Las proteína quinasas MAPK ERK quinasa (MEK) 1/2, que activan la familia de MAPK de quinasas reguladas por señal extracelular (ERK) (Figura 2), y la diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) son 2 de estas quinasas permisivas que desempeñan funciones en progresión del ciclo celular. Los inhibidores de estas quinasas (U0126 y PD184352 [Figura 1] y rapamicina / sirolimus, respectivamente) se encuentran en ensayos clínicos para el tratamiento de una variedad de tumores (Tabla). Además, la rapamicina / sirolimus se utiliza actualmente con gran éxito como inmunosupresor e inhibidor de la reestenosis intra-stent. 5 Los primeros éxitos con agentes dirigidos a las proteínas quinasas han llevado a la conclusión lógica de que, en el futuro, los cánceres se definirán no solo por el tipo y estadio del tumor, sino también por el perfil de actividad de las proteínas quinasas (es decir, qué quinasas están desreguladas). 6 Es probable que ocurra lo mismo con las enfermedades complejas del sistema cardiovascular.

Figura 2. Cascada ERK. Todas las MAPK descritas hasta la fecha forman parte de una cascada de 3 niveles en la que las MAPK, en este caso, las ERK, son activadas por quinasas aguas arriba (MAPKK, en este caso MEK1 / 2), que, a su vez, son activadas por una MAPKKK (en este caso Raf-1). La activación de la vía inducida por el factor de crecimiento a menudo conduce a la progresión del ciclo celular y, en algunos casos, a la activación de las vías de supervivencia. La I / R en el cerebro también conduce a la activación de ERK, pero en este caso es perjudicial y conduce a la muerte neuronal. No está claro si Raf-1 es el MAPKKK involucrado en la activación de ERK inducida por I / R en el cerebro. Se muestran los inhibidores de MEK discutidos en el texto.

Desarrollar un inhibidor

Un tema importante en el desarrollo de fármacos es la identificación de objetivos apropiados para la intervención terapéutica. Para identificar una proteína quinasa como un objetivo terapéutico putativo, no es suficiente simplemente saber si está activada (o inhibida) en un estado de enfermedad específico, porque la desregulación puede ser una consecuencia irrelevante de la enfermedad más que un factor clave que contribuye a la enfermedad. patología. Como mínimo, se necesitan datos genéticos o fisiológicos / biológicos celulares claros que impliquen a una proteína quinasa como un objetivo atractivo.

Una vez que una quinasa se valida como un objetivo potencial para el desarrollo de fármacos, se realiza un cribado de bibliotecas químicas para identificar posibles inhibidores. Muchas grandes empresas farmacéuticas poseen enormes bibliotecas químicas que constan de cientos de miles de compuestos sintéticos. La identificación de uno o más de estos como un inhibidor candidato requiere un proceso llamado cribado de alto rendimiento (HTS). (Para el lector interesado, una descripción más detallada del proceso de HTS está disponible en línea y en la Referencia 7). Se puede usar un ensayo de HTS bueno, robusto y confiable para seleccionar & gt100 000 moléculas pequeñas en un día. Las "tasas de acierto" típicas para una pantalla imparcial pueden ser sólo del 0,1% al 0,3%, por lo tanto, se han ideado varias estrategias para mejorar las tasas de acierto al enfocar la pantalla. El enfoque de la biblioteca de compuestos puede basarse en la estructura cristalina real del bolsillo de unión a ATP de la quinasa o en un miembro de la familia si se conoce (diseño de biblioteca basado en la estructura) o en la estructura de compuestos que ya se sabe que se unen al bolsillo de ATP si está disponible (diseño de biblioteca basado en ligandos). Estos enfoques de cribado virtual o modelado molecular para cribar bibliotecas más específicas no solo pueden mejorar la tasa de aciertos, sino que también pueden reducir la duración y el gasto de los cribados primarios. 7

La unión de ATP a una proteína quinasa es esencial para la actividad fosfotransferasa de la quinasa y, por lo tanto, el bolsillo de unión de ATP es el "objetivo" de la mayoría de las pantallas de inhibidores. Como se señaló anteriormente, esta idea inicialmente parecía contradictoria, dada la conservación estructural de los sitios de unión de ATP de proteína quinasa. 8 Sin embargo, existe, de hecho, suficiente diversidad estructural en estos sitios 8 para predecir que se pueden identificar inhibidores selectivos competitivos de ATP. De hecho, contrariamente a las preocupaciones iniciales, los exámenes de bibliotecas de compuestos no sesgados han identificado varios competidores de ATP que funcionan como inhibidores relativamente selectivos. 9,10

Para que un inhibidor de la proteína quinasa tenga una posibilidad de eficacia clínica, debe unirse a la quinasa diana con una afinidad extremadamente alta: varios órdenes de magnitud más alta que la del ATP, porque el inhibidor estará presente en concentraciones típicamente entre medias y altas. rango nanomolar, mientras que la concentración intracelular de ATP es milimolar. Esto sugiere que cualquier "acierto" inicial de un HTS probablemente se beneficiará de la optimización para mejorar la potencia y la selectividad. La eficiencia del proceso de optimización aumenta en gran medida por la abundante información cristalográfica de rayos X disponible para las familias de quinasas. Por tanto, la relación estructura-actividad de cualquier compuesto puede correlacionarse con interacciones moleculares específicas del compuesto con el sitio activo de la quinasa y, de esta forma, se puede optimizar la estructura del inhibidor. 7 Cuando no existen datos de estructura para una quinasa específica, el conocimiento de la estructura de otro miembro de la familia a menudo se puede utilizar para crear modelos de unión a partir de los cuales se pueden sintetizar compuestos optimizados. 7

La necesidad de una afinidad de unión extremadamente alta de un inhibidor al bolsillo de ATP y las similitudes relativas de los bolsillos de ATP a través de familias de proteína quinasas sugieren que puede ser beneficioso examinar las proteínas quinasas en busca de determinantes además del bolsillo de ATP que podrían conferir especificidad adicional. Aquí, las MAPK proporcionan un excelente ejemplo. La capacidad de diferentes grupos MAPK para interactuar con y luego fosforilar sustratos proteicos intracelulares selectivos es conferida por un sitio de acoplamiento de sustrato específico de las MAPK, el dominio de acoplamiento común (CD), que está bastante distal del sitio de unión de ATP. 11 Los motivos CD de MAPK se unen a sitios complementarios en los sustratos de MAPK correspondientes (y en reguladores de MAPK) (por ejemplo, la unión de MEK1 a ERK-1 [Figura 2] está mediada por el dominio de CD). Aunque existe una conservación de secuencia sustancial entre los dominios CD de MAPK, la divergencia de secuencia es suficiente para permitir una especificidad de MAPK exquisita. Es de destacar que los dominios CD son bastante pequeños (≤18 aminoácidos), contienen residuos ácidos clave y residen en una superficie expuesta en la estructura MAPK, lo que sugiere que estos dominios podrían ser dianas ideales para el diseño de fármacos. 11

El uso de determinantes además del bolsillo de ATP combinado con la optimización basada en la estructura cristalina se utilizó recientemente para optimizar el diseño de un inhibidor de p38-MAPK. La cristalografía demostró que este inhibidor no se dirigió al bolsillo de unión de ATP, sino que se dirigió a un sitio nuevo en el sitio activo de la quinasa que está expuesto después de un gran cambio conformacional que acompaña a la unión del inhibidor. La cristalografía permitió modificar el compuesto para optimizar la unión al sitio nuevo y también para establecer la unión en el bolsillo de ATP. Esto le da al compuesto final, BIRB796 (Figuras 1 y 3), que se encuentra actualmente en ensayos clínicos para varios trastornos inflamatorios (Tabla), un alto grado de potencia y selectividad.

Figura 3. Mecanismos de muerte de cardiomiocitos inducida por p38-MAPK. I / R activa p38-MAPK, lo que lleva a la producción de citocinas (y quimiocinas) y al aumento de las moléculas de adhesión en las células endoteliales. Esto conduce a la infiltración de leucocitos en la región isquémica. Ciertas citocinas (p. Ej., TNF-α) son directamente citotóxicas para los cardiomiocitos. Además, p38-MAPK probablemente también activa directamente las vías de muerte celular en cardiomiocitos isquémicos (es decir, efectos independientes de citocinas y leucocitos sobre la muerte celular). Se muestran los inhibidores de p38-MAPK discutidos en el texto. Es de destacar que las JNK también actúan para estabilizar el ARNm de las citocinas y, además, activan la vía intrínseca de muerte celular al inducir la liberación de citocromo. C de las mitocondrias. 36 Esto sugiere que los inhibidores de JNK también pueden proteger contra la lesión por I / R (ver texto).

Otro enfoque para inhibir la señalización de MAPK que podría reducir la toxicidad sería apuntar a los activadores aguas arriba de las MAPK en lugar de las MAPK. 13 Por ejemplo, la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) es activada por al menos 12 diferentes MAPK quinasas quinasas (MAPKKK) y 2 MAPK quinasas (MAPKK: consulte la leyenda de la Figura 2 para conocer la terminología). Debido a que MAPKKK y MAPKK específicos transducen la activación de JNK en respuesta a estímulos específicos 14 (p. Ej., MAPKK7 pero no MAPKK4 es necesario para la activación de JNK por el factor de necrosis tumoral [TNF] -α), uno podría potencialmente apuntar a MAPKK7 específicamente con un inhibidor en pacientes con trastornos inflamatorios. Esto dejaría la activación de JNK por otros estímulos que actúan a través de MAPKK4, y las funciones celulares esenciales reguladas por JNK, al menos parcialmente intactas.

Potencia y selectividad

La potencia y la selectividad son cuestiones críticas para la eventual eficacia y seguridad de cualquier fármaco. La potencia se expresa como el IC enzimático50 (concentración de fármaco que inhibe la actividad enzimática en un 50%). Sin embargo, informó IC50s deben interpretarse con precaución, porque el IC50 determinado para un inhibidor competitivo de ATP variará dependiendo de la concentración de ATP utilizada en el ensayo y de la Kmetro (la afinidad de la quinasa por ATP). 10 Esto ha sido una fuente de confusión significativa en la literatura. Por ejemplo, los resultados de los ensayos del inhibidor de antraprazolona JNK ampliamente utilizado SP600125 (Figura 1) con 20 μmol / L de ATP sugirieron inicialmente que SP600125 era un inhibidor muy potente con una CI baja.50. Sin embargo, los resultados de estudios que utilizaron ensayos con concentraciones más "fisiológicas" de ATP (100 μmol / L) demostraron recientemente que SP600125 era, de hecho, un inhibidor relativamente débil (y también no selectivo) con una CI alta.50. 10

La selectividad es una segunda consideración clave en el diseño de inhibidores de quinasas. Los compuestos se "perfilan" por su selectividad frente a paneles de quinasas (a menudo 30 o más) para determinar qué objetivos, además del pretendido, están siendo afectados. Estos paneles se eligen de diversas formas, pero a menudo incluyen quinasas específicas que no se desea que el fármaco inhiba y / o una selección de quinasas con una gran diversidad estructural en el sitio activo (para cribar ampliamente inhibición inespecífica). IC relativo50A continuación, se determinan los valores del fármaco para la quinasa diana frente a los demás en el panel. Nuevamente, la concentración de ATP utilizada en el ensayo es fundamental para permitir una comparación precisa. Un enfoque para permitir la interpretación de la CI relativa50s para un inhibidor entre enzimas es personalizar las condiciones de ensayo para la afinidad de ATP para cada quinasa en el panel de selección (por ejemplo, fijar la concentración de ATP en el Kmetro para cada quinasa). Alternativamente, otros recomiendan usar concentraciones de ATP, ≥100 μmol / L, que están muy por encima de los Kmetro para todas las quinasas del panel. 10

¿Qué es un nivel aceptable de selectividad? No hay consenso, pero en general, el objetivo es un IC50 que es al menos 100 veces menor para la quinasa diana. Sin embargo, esto puede variar según la indicación y, en algunos casos, se pueden tolerar (o incluso preferir) agentes que no sean del todo selectivos. Por ejemplo, en el cáncer, uno podría tolerar la inhibición de quinasas que regulan positivamente el ciclo celular (quinasas dependientes de ciclina, Cdks) o que son antiapoptóticas (por ejemplo, Akt) por un fármaco dirigido a Bcr-Abl, porque la actividad antitumoral podría ser mayor. Sin embargo, debido al aumento de la toxicidad, no se toleraría la inhibición de Cdks o Akt por un fármaco dirigido a p38-MAPK para enfermedades inflamatorias. De manera similar, la falta de selectividad para los medicamentos que se usarán solo a corto plazo podría no ser un problema importante.

Una vez que se determina la selectividad en ensayos de quinasa in vitro, el perfil de selectividad se determina en un sistema celular. Dado que las concentraciones de ATP celular están típicamente en el rango milimolar, un cambio hacia arriba en el CI celular50 versus el IC enzimático50 (realizado a 100 μmol / L o menos) se observa a menudo. La magnitud de este cambio viene dictada por una serie de factores, incluido el ATP Kmetro para la enzima diana, la permeabilidad celular del fármaco y la cantidad de inhibición de la quinasa diana requerida para provocar la respuesta celular que se monitorea (por ejemplo, el 20% de inhibición de una quinasa particular puede ser suficiente para conducir a la inhibición completa de una respuesta). Una estrategia general de contra cribado eficaz es obtener CI enzimático50 valores para un extenso panel de ensayos de quinasas bioquímicas, luego evalúe las consecuencias celulares del patrón de inhibición observado en lecturas celulares sesgadas para responder a la inhibición de las vías de señalización representadas en el panel enzimático. Si un fármaco con selectividad límite en los ensayos enzimáticos tiene excelentes características en los ensayos basados ​​en células (buena inhibición de la vía diana, inhibición limitada de otras vías y sin toxicidad), la selectividad enzimática límite puede considerarse adecuada.

Finalmente, aunque el IC50 y los estudios de selectividad (determinados en ensayos in vitro) suelen predecir la actividad en la célula, pero no siempre es así. Por tanto, un compuesto con una actividad y especificidad aparentemente altas in vitro puede mostrar una actividad in vivo marcadamente diferente e incluso inesperadamente inespecífica. Por ejemplo, los piridinil imidazoles SB203580 y SB202190 (Figura 1), que inhiben p38 MAPK, son notablemente específicos cuando se ensayan in vitro para la inhibición de una variedad de proteína quinasas. 9 La base de esta especificidad se reveló en la estructura cristalina de p38α complejado con SB203580. Para acomodar un resto fluorofenilo presente en la estructura SB203580, el aminoácido en la posición 106 de la quinasa no debe ser mayor que Thr. 15 c-Raf, una proteína quinasa que activa las ERK, está cadena abajo de muchos receptores de factores de crecimiento y juega un papel en la inducción de la progresión del ciclo celular (Figura 2), tiene una Thr (Thr321) en un sitio correspondiente a Thr106 de p38α. Por lo tanto, no es inesperado que c-Raf sea inhibido por SB203580 y SB202092 in vitro, aunque a concentraciones de al menos un orden de magnitud superior a la necesaria para inhibir p38α. 13,14 Sin embargo, en ensayos basados ​​en células, la vía Raf-Mek-ERK no es inhibida por SB203580 o SB202092. Sorprendentemente, SB203580 y SB202092 desencadenan una activación sorprendente de c-Raf in vivo. 16 De manera similar, ZM336372 (Figura 1), un derivado de fenilamido novedoso, es un inhibidor in vitro de Raf (y p38-MAPK) pero es un potente activador de c-Raf en células intactas. Se desconoce la base de estos hallazgos paradójicos, pero son indicativos del hecho de que las afirmaciones sobre la especificidad de un compuesto in vitro requieren pruebas rigurosas y exhaustivas en sistemas celulares y de animales completos.

Al lado de la cama

La tabla es una lista de la mayoría de los inhibidores de la proteína quinasa que se encuentran actualmente en ensayos clínicos y las enfermedades a las que se dirige. Como se puede ver, la mayoría son ensayos de cáncer, pero existe una tendencia a apuntar a las proteínas quinasas para el tratamiento de una serie de afecciones crónicas distintas del cáncer, incluidas las enfermedades inflamatorias y cardiovasculares. De hecho, varios de los agentes enumerados en la Tabla tienen sólidos datos preclínicos que sugieren que pueden ser eficaces en la terapia de pacientes con una variedad de enfermedades cardiovasculares. La lista de posibles dianas de proteína quinasa para terapias cardiovasculares es extensa. Sin embargo, en lugar de un resumen de los estados de enfermedad y las proteínas quinasas posiblemente involucradas (recientemente se publicó una excelente revisión que adopta este enfoque para la insuficiencia cardíaca 17), discutiremos algunos estados de enfermedad para los cuales existen inhibidores que ya se encuentran en las primeras etapas de la enfermedad. ensayos clínicos o se encuentran en las últimas etapas del desarrollo preclínico. Esperamos que estos ejemplos ilustren que lo que antes se percibía como poco práctico ahora parece razonable y alcanzable.

Síndromes coronarios agudos

Dos familias de MAPK activadas por estrés, las JNK y las p38-MAPK, se activan por isquemia / reperfusión (I / R), 14,18 y hay alguna indicación de que la inhibición de las JNK o de la p38 podría resultar beneficiosa para el tratamiento de enfermedades coronarias agudas. síndromes (SCA). Sin embargo, validar estas MAPK como dianas en ACS, es decir, si la activación de las quinasas es beneficiosa o perjudicial, ha sido difícil. 19 Esto se debe a la falta de buenos modelos genéticos (es decir, ratones suprimidos para el gen) y, hasta hace poco, para p38, buenos inhibidores con los que abordar la cuestión in vivo. Dos miembros de la familia p38 MAPK, p38α y p38β, son activados por isquemia. El primer inhibidor eficaz de p38α / β fue descubierto por Lee y colaboradores 20 en SKF en un amplio cribado de "fármacos antiinflamatorios supresores de citocinas" basándose en su capacidad para inhibir la producción de citocinas inducida por endotoxinas por macrófagos en cultivo. Posteriormente se identificó que el objetivo de este fármaco era el p38s. Dado que parece claro que la primera oleada de fármacos que se dirigen a las vías de las quinasas que se utilizarán en pacientes estará dominada por los inhibidores de p38-MAPK, describiremos estas quinasas y los mecanismos por los que actúan los inhibidores con cierto detalle.

La prevención de la liberación de citocinas y quimiocinas inflamatorias representa un enfoque potencialmente prometedor para tratar el SCA (Figura 3) y, posiblemente, el desarrollo y la progresión de placas ateroscleróticas. De hecho, un inhibidor de p38, VX702, se encuentra actualmente en un ensayo clínico de fase II en pacientes que presentan SCA. La vida media del ARNm para muchas citocinas (y factores de crecimiento) es extremadamente corta, lo que permite una rápida regulación a la baja de la expresión cuando se elimina el estímulo provocador. Esta corta vida media es en gran parte el resultado de la presencia de elementos ricos en AU (ARE, que consisten en varias copias de la secuencia AUUUA) en la región 3 'sin traducir del ARNm. 21 proteínas de unión a ARE (ARE-BP) se unen a las ARE, y la mayoría de las ARE-BP se dirigen al ARNm para su degradación. Cuando se activa, p38s fosforila ARE-BP, inhibiendo su actividad. 21 El resultado final es la estabilización dependiente de p38 del ARNm de las citocinas, lo que conduce a una mayor producción de la proteína citocina y a la activación de las células inflamatorias y de las células endoteliales; esta última conduce a la regulación positiva de las moléculas de adhesión. Por lo tanto, los inhibidores de p38 bloquean la fosforilación de los ARE-BP, lo que conduce a la degradación de los ARNm de citocinas, incluidos los que codifican TNF-α, interleucina (IL) -1α / β, IL-6, IL-10, interferón (IFN) - γ, MIP1α / β e IL-8. Aunque la estabilización del ARNm de citocinas ha sido obviamente una respuesta importante a la infección durante millones de años de evolución, la activación inapropiada de respuestas inflamatorias se ha convertido, en los últimos 100 años, en un factor significativo que impulsa la explosión en la prevalencia de una serie de enfermedades crónicas. .

Varias empresas han desarrollado inhibidores de p38, y algunos de ellos han demostrado eficacia en modelos de enfermedades inflamatorias, incluidas las artritis inflamatorias y la enfermedad inflamatoria intestinal, así como en la endotoxemia. 22,23 Algunos de estos inhibidores se encuentran actualmente en ensayos clínicos para la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn (tabla). Con la justificación de que (1) los SCA, incluido el infarto de miocardio, tenían componentes inflamatorios prominentes y (2) la activación de p38 en el tejido isquémico podría, independientemente de los efectos sobre las respuestas inflamatorias, tener efectos perjudiciales sobre la supervivencia de los cardiomiocitos (ver Referencia 17 y referencias en la misma), La eficacia de estos fármacos se probó en modelos animales de infarto agudo de miocardio.

Los inhibidores de p38 de primera generación, SB203580 y SB242710, redujeron la apoptosis inducida por I / R y preservaron la función cardíaca en un modelo de corazón de conejo perfundido con Langendorff (revisado en la Referencia 20). Debido a que con este modelo, el corazón está perfundido con un tampón y por lo tanto no hay leucocitos en el perfundido, los hallazgos sugieren que la inhibición de p38 tiene efectos beneficiosos directamente sobre el miocardio, además de sus efectos conocidos sobre el reclutamiento y activación de leucocitos (Figura 3). ). Este efecto protector independiente de leucocitos de la inhibición de p38 sobre el miocardio probablemente implica la inhibición de la producción inducida por I / R de citocinas citotóxicas por el corazón y la inhibición de las vías proapoptóticas dependientes de p38 en los cardiomiocitos.Más recientemente, un inhibidor de p38 de nueva generación, SB239063 24 (Figura 1), que puede usarse fácilmente in vivo ha demostrado efectos beneficiosos en el modelo de rata intacta de lesión por I / R. Además de los efectos protectores directos de p38 sobre la supervivencia de los cardiomiocitos, SB239063 produjo una reducción dramática en la respuesta inflamatoria del miocardio, como lo demuestra la reducción de la regulación positiva de la P-selectina y la molécula de adhesión intercelular y la reducción de la acumulación de neutrófilos dentro de la zona isquémica. Otras aplicaciones potenciales relacionadas de los inhibidores de p38 incluyen la preservación de la función mecánica de los corazones almacenados en frío antes del trasplante. 25 Este efecto de la inhibición de p38 puede estar, en parte, relacionado con una mayor contractilidad causada por una mayor capacidad de respuesta de los miofilamentos al calcio. 26

Existen otras aplicaciones potenciales para estos fármacos supresores de citocinas, incluido el tratamiento de pacientes con insuficiencia cardíaca. Aunque los ensayos RENEWAL y ATTACH, 27 dirigidos al TNF-α al "capturarlo" con un anticuerpo monoclonal o un receptor soluble, produjeron resultados negativos y plantearon preocupaciones sobre el empeoramiento de la insuficiencia cardíaca, esto, por supuesto, no significa necesariamente que el concepto de anticitocina Las terapias en la insuficiencia cardíaca no son válidas, y es concebible que una terapia anticitocina de base más amplia, como la que se logra con los inhibidores de p38, pueda ser beneficiosa. Además, podríamos beneficiarnos de las experiencias de los oncólogos que demuestran que es posible que sea necesario definir el fenotipo molecular o el perfil de actividad quinasa del paciente individual, porque al igual que con el cáncer, los pacientes con el diagnóstico clínico de "insuficiencia cardíaca" están obligados a tienen perfiles muy diferentes (como lo demuestra la falta de consenso sobre las anomalías de señalización presentes en el corazón que falla 17). Aunque es difícil, no hacerlo puede llevar a descartar agentes que son efectivos en subgrupos de pacientes. Por ejemplo, trastuzumab, el anticuerpo anti-receptor de tirosina quinasa HER2, que confiere una mejora del 22,5% en la supervivencia general en pacientes con cáncer de mama con tumores que sobreexpresan HER2 (25% a 30% de todos los cánceres de mama), se habría encontrado que no tendría ningún valor si se hubiera probado inicialmente en pacientes con cáncer de mama independientemente del estado de HER2. 6

Otras preocupaciones potenciales con las terapias con anticitocinas incluyen un posible aumento del riesgo de infección, incluida la reactivación de la tuberculosis, y el desarrollo de infecciones oportunistas que se han observado con las terapias anti-TNF y con anakinra, un antagonista del receptor de IL-1. 28 Por supuesto, queda por determinar si estos problemas son específicos de las terapias anti-TNF y anti-IL-1 utilizadas o serán una característica general de todas las terapias anticitocinas.

Carrera

Se ha demostrado que la inhibición de varias rutas de proteína quinasa es beneficiosa en modelos animales de accidente cerebrovascular. Estos incluyen las 3 familias de MAPK, ERK, JNK y p38 MAPK. 14 Además, los estudios de cultivos celulares sugieren que los inhibidores de la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) también pueden ser protectores. 29,30 Los primeros informes de neuroprotección in vivo con un inhibidor de quinasa utilizaron inyección directa en los ventrículos cerebrales de PD98059 (Figuras 1 y 2), un inhibidor de primera generación de la activación de MEK1 / 2 9 (leyenda de la Figura 2), el quinasas que activan las ERK. 31 A esto le siguieron estudios con la administración intravenosa de otro inhibidor de MEK1 / 2, U0126 (actualmente en ensayos clínicos para el cáncer Table), que también fue protector contra el prosencéfalo y la isquemia cerebral focal. 32 Sorprendentemente, se observaron efectos beneficiosos con la administración después de 3 horas de isquemia, antes de la reperfusión. Estos estudios parecían contradictorios, porque en general se pensaba que las ERK eran antiapoptóticas en la mayoría de los entornos (Figura 2), incluida la lesión por I / R en el corazón. 19 El mecanismo de protección puede ser la prevención de la excitotoxicidad, 33 que es la muerte neuronal causada por la liberación de aminoácidos excitadores que activan los receptores metabotrópicos de glutamato. La excitotoxicidad juega un papel crítico en la lesión por I / R en el cerebro y, aunque aún no se han determinado los mecanismos precisos de protección, los inhibidores de MEK1 / 2 pueden estar bloqueando la liberación de glutamato. Además del accidente cerebrovascular, se ha informado que los inhibidores de MEK1 / 2 protegen contra la lesión cerebral traumática. 34 Como advertencia, PD98059 y U0126 también bloquean la activación de MEK5, 9 la quinasa que activa ERK5, el único miembro de la cuarta familia MAPK. Por lo tanto, en este momento no se puede descartar formalmente MEK5 / ERK5 como el objetivo relevante. Sorprendentemente, otro inhibidor de MEK1 / 2, PD184352, ha sido razonablemente bien tolerado cuando se administra por vía oral, dos veces al día, durante 21 días (repitiendo cada 4 semanas) en un ensayo de fase I de rango de dosis en pacientes con cáncer, con solo fatiga, erupción y la diarrea se informa con frecuencia. 6

La inactivación de JNK3 (a través de la deleción del gen en un ratón knockout), que se expresa selectivamente en el sistema nervioso central, y la inhibición de la activación de p38 (por SB239063) también fueron protectoras en los modelos de accidente cerebrovascular. 35,36 En el último caso, SB239063 redujo la expresión inducida por accidente cerebrovascular de TNF-α e IL-1β, citocinas que se cree que aumentan la pérdida neuronal después de I / R. No menos de 8 empresas han informado sobre el desarrollo de inhibidores de JNK, muchas de las cuales se centran en JNK3 y la neuroprotección (accidente cerebrovascular y trastornos neurodegenerativos). 37 Algunos han informado una mayor supervivencia celular en un modelo de accidente cerebrovascular. 37 Los estudios de seguridad con un agente (CC401, Tabla) están en curso en voluntarios sanos. 37

Los inhibidores de GSK-3 se proponen como terapias potenciales para trastornos tan diversos como los trastornos bipolares del estado de ánimo (el litio y el ácido valproico son inhibidores de GSK-3), la enfermedad de Alzheimer (en la que se cree que GSK-3 juega un papel clave en la formación de la ovillos neurofibrilares y placas amiloides, estas últimas reducidas por el litio en un modelo animal de enfermedad de Alzheimer 38) y accidente cerebrovascular. 30 GSK-3 se inhibe cuando se fosforila por la quinasa antiapoptótica Akt, y se cree que al menos parte de los efectos antiapoptóticos de Akt están mediados por la inhibición de GSK-3. La inhibición de GSK-3 también puede mediar parte del fenómeno del preacondicionamiento isquémico. 39 Los datos publicados son limitados, pero en este momento, se ha demostrado que los inhibidores selectivos (SB216763 y SB415286 Figura 1) bloquean la muerte de células neuronales en cultivo inducida por la inhibición farmacológica de la vía PI3-quinasa / Akt o por la toxicidad de la poliglutamina causada por la enfermedad de Huntington. mutación de la enfermedad. 29,40 Aunque prometedora, esta quinasa es un regulador crítico de muchos procesos celulares básicos, incluidos el desarrollo, el crecimiento cardíaco y la hipertrofia y la tumorigénesis. 41,42 Por lo tanto, es probable que en un futuro cercano, los inhibidores de GSK-3 se restrinjan a un uso relativamente a corto plazo en pacientes de alto riesgo.

Hipertensión

Rho pertenece a una familia de pequeñas proteínas de unión a GTP que median la señalización intracelular inducida por la activación de receptores heterotriméricos acoplados a proteínas G y receptores de factores de crecimiento. En el sistema cardiovascular, Rho regula la contracción del músculo liso vascular modulando la sensibilidad al Ca 2+. Un efector Rho es la quinasa Rho (ROCK), de la cual se han identificado 2 isoformas. Las ROCK fosforilan la subunidad de unión a miosina de la fosfatasa de la cadena ligera de miosina y la quinasa LIM, regulando finalmente la fosforilación de la cadena ligera de miosina y, a través de este mecanismo, la contracción de las células del músculo liso vascular. 43 Por lo tanto, es tentador especular que la inhibición de ROCK podría mejorar la vasodilatación coronaria al cambiar la sensibilidad al Ca 2+ de las células del músculo liso de la arteria coronaria. De hecho, un inhibidor de ROCK, el hidroxifasudil, suprime la fosforilación de las cadenas ligeras de la miosina e inhibe significativamente el espasmo coronario en un modelo de cerdo. Dos ensayos clínicos recientes de fasudil indican que puede ser un agente antianginoso eficaz y bien tolerado 44 y también puede ser beneficioso en pacientes con espasmo microvascular de las arterias coronarias. 45 Aunque la selectividad de fasudil contra ROCK está en duda, estos resultados sugieren un uso potencial de inhibidores de ROCK como agentes novedosos para tratar pacientes sintomáticos con CAD. Otro inhibidor de ROCK relativamente específico, Y-27632 (Figura 1), 9 es eficaz para reducir la presión sanguínea sistólica en ratas espontáneamente hipertensas, ratas con sal DOCA y ratas con hipertensión renal sin afectar la presión sanguínea en ratas normales. 43 En conjunto, los inhibidores selectivos de ROCK probablemente constituirán un enfoque novedoso para el tratamiento de la hipertensión. Sin embargo, también se ha demostrado que Y-27632 afecta la metástasis, el crecimiento de neuritas y la contracción de las células del músculo liso distintas de las células del músculo liso vascular. 43 Por lo tanto, la seguridad del Y-27632 y los agentes relacionados sigue siendo una cuestión y deberá evaluarse cuidadosamente en ensayos clínicos.

Dada la dificultad para controlar la hipertensión en pacientes ancianos y diabéticos, probablemente habrá muchas más dianas contra las que se producirán inhibidores. Estos podrían incluir la familia de quinasas WNK (sin lisina), cuyas mutaciones son responsables de una forma hereditaria rara de hipertensión, el pseudohipoaldosteronismo tipo II. 46 Debido a que el gen WNK4 se encuentra cerca de un locus que muestra el vínculo más fuerte con la variación de la presión arterial en el Framingham Heart Study, las mutaciones y polimorfismos menos graves de los genes WNK pueden desempeñar un papel más general en la hipertensión. Si es así, estas quinasas podrían ser objetivos ideales.

Diabetes y síndrome metabólico

Otra vía abierta para manipular la actividad de las proteína quinasas es identificar fármacos que activen, en lugar de inhibir, una quinasa. Las proteínas quinasas que se activan de manera beneficiosa por mecanismos alostéricos representan dianas atractivas para tales terapias. Uno de ellos es la proteína quinasa activada por 5′-AMP (AMPK). La AMPK existe en la célula como un heterotrímero de las subunidades α, β y γ (la subunidad α que contiene el dominio quinasa). Las mutaciones genéticas en la subunidad γ2 humana de AMPK se han relacionado con la miocardiopatía hipertrófica y con la preexcitación ventricular. 47 Específicamente, estas mutaciones se asocian con un trastorno de almacenamiento metabólico marcado por la acumulación de un exceso de gránulos de glucógeno en el miocardio. Aunque los mecanismos por los cuales estas mutaciones conducen a miocardiopatía y preexcitación no están del todo claros, las mutaciones parecen inhibir la activación de AMPK por AMP. Debido a que AMPK inhibe la glucógeno sintasa, la mutación podría conducir a un aumento de la actividad de la glucógeno sintasa, una mayor producción de glucógeno y la acumulación observada de glucógeno en el corazón.

Sin embargo, la razón por la que la AMPK ha generado un gran interés por parte de las compañías farmacéuticas es que sus activadores podrían ser útiles en el tratamiento de pacientes con síndrome metabólico, diabetes o hiperlipidemia. 48 La AMPK se descubrió inicialmente a principios de la década de 1970 como una quinasa dependiente de AMP que inactivaba la HMG-CoA reductasa y la acetil-CoA carboxilasa (ACC). 49 Desde entonces se ha establecido que AMPK funciona como un “sensor de combustible” celular que se activa en momentos de disponibilidad de energía reducida (cuando [AMP] es relativamente alto) y sirve para inhibir procesos anabólicos (lipogénesis) y mejorar la absorción de glucosa. 49

Varias líneas de evidencia convincentes apuntan al potencial de AMPK como un objetivo farmacológico útil. ACC, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de ácidos grasos, cataliza la formación de malonil-CoA, un potente inhibidor de la oxidación de ácidos grasos. Al inhibir la ACC, AMPK eleva la oxidación de grasas. 49 Además, la activación de AMPK conduce a niveles reducidos de proteína 1 de unión al elemento de respuesta de esteroles hepáticos y, en consecuencia, suprime la expresión de varios genes lipogénicos. Por tanto, los activadores terapéuticos de AMPK podrían reducir los triglicéridos séricos. Como inhibidor de la HMG-CoA reductasa, la enzima que limita la velocidad en la biosíntesis del colesterol, la AMPK también funciona para bloquear la producción de colesterol, 49 y los activadores terapéuticos de la AMPK podrían actuar de manera similar a las estatinas. Además, la AMPK se activa en el ejercicio, lo que desencadena la captación de glucosa del músculo esquelético de manera independiente de la insulina. Es de destacar que la activación farmacológica de AMPK con 5-aminoimidazol-4-carboxamida 1-β-d-ribofuranósido (AICAR) imita el ejercicio y desencadena la captación de glucosa del músculo esquelético independiente de la insulina. Por tanto, los activadores de AMPK también podrían aliviar la intolerancia a la glucosa. En apoyo de esto, la metformina antidiabética biguanida puede ejercer sus efectos en parte activando la AMPK. 48

La capacidad de activar AMPK in vitro con AMP e in vivo con AICAR (que se fosforila en la célula a ZMP, un análogo de AMP) y los efectos antilipogénicos y de transporte de glucosa observados de AICAR indican que los fármacos dirigidos a AMPK deberán ser activadores de AMPK. . Es probable que los compuestos similares a AMP proporcionen la fuente más rica de posibles productos farmacéuticos de AMPK. La identificación de tales compuestos será asistida por la elucidación de las características estructurales del bolsillo de unión a AMPK AMP.

Conclusiones

Es muy probable que los próximos años de investigación cardiovascular traslacional incluyan una serie de ensayos clínicos que utilicen inhibidores de las vías de señalización de las proteínas quinasas para tratar una variedad de trastornos. Hemos abordado algunas de las dianas para las que el desarrollo de inhibidores está más avanzado, pero hay muchas otras con gran potencial, como el receptor quinasa β-adrenérgico (insuficiencia cardíaca) 50 y algunos inhibidores de quinasa que se encuentran actualmente en ensayos clínicos para el cáncer. y están en la fase de descubrimiento para aterosclerosis y reestenosis (p. ej., receptores del factor de crecimiento, incluido el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, reguladores del ciclo celular como Cdk-1 / -2 y proteína quinasa C) y para accidentes cerebrovasculares (p. ej., Cdks ). 51 La toxicidad sigue siendo una preocupación importante, porque muchas de estas quinasas no solo juegan un papel en la patogénesis de enfermedades, sino que también funcionan en las vías que regulan los procesos celulares normales más básicos. Dicho esto, los datos preclínicos han sido tranquilizadores. Los datos de toxicidad de los ensayos clínicos de estos agentes en el cáncer serán ilustrativos, pero muchos de estos estudios se han diseñado para identificar, o han utilizado, la "dosis máxima tolerada", que puede ser significativamente más alta que las dosis que se utilizarán en enfermedades cardiovasculares. enfermedades. El uso de terapia combinada, dirigida a 2 o más quinasas en la misma vía o vías paralelas, puede permitir el uso de dosis más bajas (y por lo tanto menos tóxicas) y ha mostrado ser prometedor en ensayos de cáncer. 6 Sin embargo, la mayoría de los primeros ensayos se centrarán en quinasas individuales y su función en enfermedades para las que solo se necesitará una terapia a corto plazo (p. Ej., SCA o accidente cerebrovascular) o para las que es posible la administración local dirigida. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que estos pueden no ser necesariamente los estados patológicos con mayor probabilidad de beneficiarse de la terapia. Finalmente, como se destacó anteriormente, dado el gran número de proteína quinasas en el genoma humano y su secuencia y similitudes estructurales, sumado a la incapacidad de probar los fármacos contra todas las quinasas, la especificidad seguirá siendo una preocupación con estos agentes. A pesar de estos obstáculos, esta nueva clase de agentes ofrece una gran promesa para expandir nuestras opciones terapéuticas para una amplia variedad de enfermedades cardiovasculares.

Los doctores Namchuck y Kuida son empleados y el Dr. Force recibe apoyo financiero para su laboratorio de Vertex Pharmaceuticals, Inc, que produce inhibidores de proteína quinasas de molécula pequeña, son el tema de este artículo.

Se puede encontrar material adicional en el Suplemento de datos con la versión solo en línea de este artículo en http://www.circulationaha.org.

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Servicio de Salud Pública de los EE. UU. HL-61688 y HL-67371 al Dr. Force, GM-46577 y DK-41513 al Dr. Kyriakis, y una Beca de Ciencias Básicas de la Arthritis Foundation al Dr. Kyriakis. Los autores agradecen a Chris Vlahos por sus invaluables discusiones. Nos disculpamos sinceramente con aquellos cuyo trabajo no pudo ser citado debido a limitaciones de espacio.


¿Especificidad de las proteínas quinasas en las vías de señalización ...? - biología

kinase.com explora las funciones, la evolución y la diversidad de las proteínas quinasas, los controladores clave del comportamiento celular. Nos centramos en el kinoma, el complemento completo de proteína quinasas en cualquier genoma secuenciado. Esto incluye nuestra extensa base de datos KinBase y artículos y material de apoyo para nuestro trabajo de quinasas publicado por Sugen y el Instituto Salk.

6 de diciembre de 2012: ¡Feliz cumpleaños! ¡El papel y el cartel del kinome humano cumplen diez años hoy! El cartel ha tenido varias tiradas, en total más de 100.000 e incluso parte del escenario de una película de Harrison Ford, mientras que el periódico ha alcanzado más de 3400 citas.

10 de agosto de 2012: Se publicó un artículo en colaboración sobre FAM20C, una nueva quinasa de Golgi que fosforila las proteínas secretadas por los huesos y los dientes. Vea nuestro artículo de Wikikinome sobre esta familia recién descubierta de quinasas GASK.

Febrero de 2012: Nuevo artículo de Wiki sobre SCYL, una de las familias de quinasas más extrañas, presente en todos los eucariotas, pero catalíticamente activa en ninguno. Hasta hace poco, no se conocen funciones, pero ahora están surgiendo funciones conservadas en ER-Golgi y exportación nuclear de ARNt.

Septiembre de 2011: Nuevos artículos sobre Wikinome incluyen perfiles de tres clases de quinasas enigmáticas que son antiguas, pero poco entendidas en cualquier organismo: la subfamilia Erk7 de MAPK y las quinasas CDKL y RCK relacionadas con CDK. RCK tiene dos subfamilias igualmente inusuales, MAK y MOK, ambas asociadas con cilios.

Julio de 2011: Nuestro artículo sobre el kinoma de Giardia y la evolución temprana de las proteínas quinasas publicado en Genome Biology.

Junio ​​de 2011: Actualización de nuestro visor de árboles hiperbólico Hypertree.

Marzo de 2011: Las noticias sobre kinome y quinasa ya están disponibles a través de Twitter: @kinomics.

Febrero de 2011: Los datos de kinoma humano y de ratón en KinBase se han actualizado con nuevas quinasas atípicas, secuencias mejoradas y clasificaciones. Detalles a seguir.

Octubre de 2010: la anotación de dominio de quinasas se actualiza con perfiles para 21 nuevos dominios y subdominios, y una reconstrucción de todos los perfiles específicos de la clase de quinasas.

Agosto de 2010: ahora tenemos logotipos de secuencia de HMM para mostrar patrones de conservación para cada grupo, familia y subfamilia de quinasas. Actualización: estamos trabajando para restaurar la herramienta de comparación de logotipos que permite la definición de patrones de conservación específicos de la clase.

Agosto de 2010: El kinoma de la esponja proporciona una imagen notable de la aparición de una complejidad de quinasas masiva en el desarrollo animal temprano, incluida la primera aparición de tirosina quinasas de estilo humano y muchas otras vías de control clave.

Junio ​​de 2010: una búsqueda detallada de kinomas del hongo (Coprinopsis cinerea) muestra una expansión masiva en nuevas familias de quinasas y proporciona un comparador fúngico distante para las quinasas de levadura.

KinBase

KinBase contiene información sobre más de 3.000 genes de proteína quinasa que se encuentran en los genomas humanos y en muchos otros genomas secuenciados. Puede buscar en la base de datos por una variedad de diferentes nombres de genes y accesiones, o de acuerdo con la clasificación basada en la secuencia. Blast también puede buscar en KinBase.

Kinomas de vertebrados

Organismos modelo y evolución de las quinasas

También hemos completado recientemente un análisis exhaustivo de una amplia variedad de quinasas microbianas relacionadas con la familia de las proteínas quinasas eucariotas, utilizando secuencias genómicas y metagenómicas.

Instrumentos

Los logotipos de secuencia muestran los perfiles HMM como logotipos gráficos y permiten la alineación, el cálculo y la manipulación de estos logotipos.


Resultados

Variabilidad de la abundancia de proteínas a través de líneas celulares cancerosas y tejidos sanos

Para estimar la abundancia media y la variabilidad de la abundancia de proteínas humanas, procesamos un estudio proteómico reciente que cuantifica los niveles de expresión de proteínas en 11 líneas celulares humanas [11]. Debido a las limitaciones técnicas del enfoque de espectrometría de masas, las proteínas poco abundantes se asocian con desviaciones estándar más altas (Figura S1A). Para corregir esto, calculamos F valores para estimar la variabilidad biológica entre líneas celulares. F Los valores se calcularon dividiendo la variación entre celdas por la variación dentro de las celdas. De ese modo, eliminamos con éxito cualquier dependencia entre la abundancia de proteínas y la variabilidad causada por sesgos técnicos (ver Figura S1B).

En este estudio, usamos el F valores calculados en líneas de células cancerosas para distinguir proteínas que se expresan de manera estable en diferentes tipos de células de aquellas que muestran perfiles de abundancia más diversos. Validamos la suposición subyacente de que podemos generalizar nuestras observaciones realizadas en los datos de la línea celular del cáncer a los tejidos sanos al contrastar los datos calculados F valores con mediciones de ARN (16 tejidos humanos) [12] y proteínas (28 tejidos de ratón) [13] (ver Métodos). En ambos casos, existe en general un buen acuerdo entre la variabilidad de las proteínas a través de las líneas celulares y los tejidos sanos (Figura S2A-B). Esto apoya la idea de que podemos generalizar desde líneas de células cancerosas hasta tejidos humanos sanos con respecto a la variabilidad de la abundancia de proteínas.

Relación entre abundancia de proteínas y conservación filogenética

Para analizar cómo la conservación de proteínas se relaciona con la abundancia de expresión de proteínas y la diversidad de proteínas involucradas en las vías humanas, analizamos la conservación de todas las proteínas en la base de datos Reactome curada por expertos [14] en especies seleccionadas de plantas, levaduras, gusanos, insectos, peces, Aves y Mamíferos. Transformamos la información en qué especie se conserva una proteína humana, como lo indica HomoloGene [15], en una puntuación de conservación basada en árboles filogenéticos (ver Métodos y Figura S3), que aumenta linealmente con la cantidad de especies en las que se encuentran proteínas homólogas. encontrado y estimaciones de la distancia evolutiva que separa a estas especies entre sí. Observamos una correlación positiva significativa entre la conservación evolutiva de las proteínas humanas y su abundancia media (ver Figura 1A) o una correlación negativa en su variabilidad en las diferentes líneas celulares analizadas (ver Figura 1B y un ejemplo en la vía EGFR / MAPK que contiene tanto variable / proteínas poco conservadas y expresadas / conservadas de forma estable en la Figura 1C).

(A) La conservación se correlaciona con la abundancia de proteínas (correlación = 0,42, PAG& lt0.0001) y (B) inversamente relacionada con la variabilidad de la abundancia de proteínas (correlación = −0,11, PAG& lt0.0001). Los valores de conservación se han agrupado en cuantiles del 20% (Q). (C) Las vías de señalización humana están compuestas por proteínas conservadas con baja variabilidad de abundancia y proteínas variables con baja conservación. La figura muestra el grupo más grande de proteínas que interactúan de la vía EGFR humana (proteínas participantes según lo indicado por Reactome, PPI tomados de HIPPIE). El tamaño del nodo es proporcional a la variabilidad de la abundancia y la conservación está codificada por un gradiente de color que va del azul (no conservado) al amarillo (conservado).

Abundancia de proteínas, variación y conservación de procesos celulares.

Para identificar los procesos celulares que difieren en su conservación filogenética y variabilidad entre células, seleccionamos todas las vías de Reactome que se espera sean generales y no restringidas solo a algunos tipos de células (diez vías): ciclo celular, replicación del ADN y mantenimiento de cromosomas [ DR], Organización de matriz extracelular [MO], Expresión génica y procesamiento de ARN [GE], Tráfico de membranas [MT], Metabolismo [MB], Transducción de señales [ST], Apoptosis [AP], Biología del desarrollo [DB], Transporte transmembrana de moléculas pequeñas [TM] y comunicación célula-célula [CO]. Varias otras vías de Reactome están restringidas a tipos de células corporales muy específicas (p. Ej., Sistema neuronal y contracción muscular), o son de baja cobertura (p. Ej., Proteínas del reloj circadiano) y se descuidaron para un análisis posterior (para obtener detalles sobre la selección, consulte Materiales y Métodos y Tabla S1). Asociamos a todos los miembros de las diez vías con la abundancia media de proteínas, la variabilidad de la abundancia y los valores de conservación filogenética.

Una fracción de las proteínas (18,7% de las proteínas del Reactome 4069 que podríamos asociar con al menos una de las características investigadas) participa en más de una vía. Comparamos las distribuciones de abundancia media, variabilidad de abundancia y conservación filogenética entre proteínas exclusivas asociadas solo con una vía con las distribuciones asociadas con proteínas implicadas en varias vías. Observamos que las proteínas exclusivas están significativamente menos conservadas (PAG& lte −16 Wilcoxon-Mann-Whitney), más variable (PAG& lte −12 Wilcoxon-Mann-Whitney) y menos abundante (PAG& lte −8 Wilcoxon-Mann-Whitney) (consulte la Figura S4A-C).

A continuación, para dilucidar los elementos comunes y variables en 11 tipos de células con respecto a las diez vías de Reactome, consideramos solo proteínas que se encuentran exclusivamente en una vía. Observamos grandes diferencias con respecto a las tres características investigadas entre las clases de vías funcionales humanas (Figura 2A). En general, encontramos dos grupos de comportamiento opuestos. Las vías de mantenimiento (GE, MB, MT y DR) están enriquecidas en proteínas conservadas (Figura 2B), tienen una variabilidad de baja a media (siendo la GE la única clase de vía con un agotamiento significativo en la variabilidad Figura 2C) y (excepto DR) mayor abundancia (GE y MB están significativamente enriquecidos en proteínas muy abundantes Figura 2D). Las vías específicas (ST, MO, CO, DB) tienden a tener proteínas menos conservadas (ST y MO muestran un agotamiento significativo Figura 2B), tienen una mayor variabilidad (Figura 2C) y menos abundancia (ST y DB están significativamente asociados con una menor abundancia Figura 2D). Las dos vías restantes (AP y TM) mostraron un comportamiento bastante promedio, con la excepción de la abundancia significativamente menor de proteínas TM. La transducción de señales (ST) muestra en las tres categorías (abundancia media, variabilidad de abundancia y conservación) una desviación significativa de la expectativa aleatoria y tiene una extensión mayor que la media de la distribución de los valores de variabilidad (cuarto rango intercuartil más alto entre las diez distribuciones de variabilidad ). Esto indica que si bien la variabilidad promedio de las proteínas de señalización es alta, también encontraremos una gran proporción de proteínas con baja variabilidad en las vías de señalización. Por lo tanto, estudiamos las partes variables y constantes de las vías de señalización.

Investigamos las propiedades de las proteínas involucradas en diez vías de nivel superior de Reactome (A): Ciclo celular, replicación del ADN y mantenimiento de los cromosomas [DR], organización de la matriz extracelular [MO], expresión génica y procesamiento del ARN [GE], tráfico de membranas [MT], metabolismo [MB], transducción de señales [ST], apoptosis [ AP], Biología del Desarrollo [DB], Transporte transmembrana de moléculas pequeñas [TM] y Comunicación Célula-Célula [CO]. Varias rutas se conservaron significativamente más (letras amarillas) o mostraron una conservación significativamente más baja (letras azules). De manera similar, varias vías mostraron una variabilidad de abundancia de proteínas significativamente mayor (tamaño de fuente grande) o una variabilidad significativamente menor (tamaño de fuente pequeño). (BD) muestra las distribuciones precisas para las diferentes características proteicas investigadas. Los recuadros de colores indican una abundancia / variabilidad / conservación significativamente (p & lt0.01 Mann-Whitney-Wilcoxon) más baja (púrpura) o más alta (roja) de las proteínas dentro de la clase en comparación con las proteínas que no están en la clase. La línea roja horizontal marca el valor mediano de todas las proteínas en Reactome.

Abundancia, variación y conservación de proteínas en vías relacionadas con la señalización

Para dilucidar con más profundidad la variabilidad de la abundancia de proteínas en las vías de transducción de señales, investigamos si podemos relacionar la función molecular de las proteínas en las vías de señalización con su abundancia, variabilidad y conservación. Para ello, elegimos dos estrategias complementarias de clasificación de proteínas y recursos de señalización. (a) Asignamos, cuando no fue posible de manera ambigua, proteínas de señalización en Reactome a una de las siguientes categorías de Ontología genética y UniprotKB: receptor unido a membrana, fosfatasa, quinasa, factor de transcripción, adaptadores y unión a GTPasa (consulte Métodos para obtener más detalles). . (b) Recuperamos el conjunto completo de proteínas y su clasificación en secciones relacionadas con la señalización (ligando, receptor, mediador, cofactor, factor de transcripción) de la base de datos de vías de señalización SignaLink [16], que es otro recurso curado manualmente que clasifica las proteínas en vías. secciones basadas en su papel en la transmisión de señales y propiedades topológicas. Por ejemplo, SignaLink distingue entre mediadores y cofactores de la transducción de señales, donde los mediadores son miembros de la vía central y los cofactores simplemente modulan la función de las proteínas de señalización. Solo consideramos las proteínas de señalización en SignaLink que están asignadas de forma única a una clase. Debido a las diferentes estrategias de curación (discutidas en [16]), los conjuntos de proteínas asociadas con las vías difieren en gran medida entre Reactome y SignaLink: podríamos asignar automáticamente funciones de vía a 802 proteínas de Reactome mientras que la base de datos SignaLink contiene 667 proteínas con funciones únicas en la señalización. . La superposición entre los dos conjuntos consta de solo 80 proteínas. Las diferencias en la composición de las proteínas y en la forma en que las proteínas se asocian con las funciones de la vía nos permiten estudiar la evolución y expresión de las proteínas de señalización en dos conjuntos de datos en gran parte independientes.

Observamos grandes diferencias en conservación, abundancia media y variación de abundancia para diferentes clases dentro de ambos conjuntos de proteínas de señalización anotadas (ver Figura S5). A continuación, agrupamos todas las clases funcionales y topológicas en tres capas: entrada (receptores), transmisión (SignaLink: mediadores y cofactores Reactoma: quinasas, fosfatasas, adaptadores y proteínas de unión a GTPasa) y salida (factores de transcripción). Comparamos las distribuciones de funciones resultantes. Con respecto a la variabilidad de la abundancia de proteínas, observamos para las proteínas Reactome y SignaLink valores significativamente más altos asociados con la capa de entrada que con la capa de transmisión (PAG& lt0.01, Wilcoxon-Mann-Whitney). La diferencia entre la transmisión y la capa de salida fue para ambas fuentes de datos no (Reactome) o solo marginalmente (PAG = 0,03 Wilcoxon-Mann-Whitney SignaLink) significativo. La conservación de las proteínas de la capa de transmisión fue significativamente mayor que la de las proteínas tanto de la capa de entrada como de la de salida (para todas las comparaciones: PAG& lt0.00001 Wilcoxon-Mann-Whitney). En resumen, adoptando una visión mecanicista de las vías de señalización donde una capa de entrada recibe señales del entorno, una capa de transmisión integra y procesa la señal y una capa de salida orquesta la respuesta transcripcional, surgen dos patrones: (i) En términos de conservación, ver una curva en forma de campana con una alta conservación de la capa de transmisión y una menor conservación de la capa de entrada y salida (Figura 3A y S5). (ii) Con respecto a la variabilidad de la abundancia de proteínas, las vías de señalización muestran un gradiente con variabilidad decreciente desde la capa de entrada a la de salida (Figura 3B). Hay una fuerte caída en la variabilidad entre la capa de entrada y la de transmisión, mientras que la capa de transmisión y la de salida son bastante similares en términos de variabilidad (Figura 3B). Estos resultados se esquematizan en la Figura 3C. La diferencia en términos de abundancia de proteínas entre diferentes clases funcionales fue menos pronunciada. Curiosamente, la variabilidad y conservación de mediadores y cofactores de señalización es casi la misma (la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney no arroja PAG& lt0.05). Esto sugiere que los moduladores en la capa de transmisión contribuyen menos a las diferencias específicas del tipo de célula.

Los diferentes componentes de las vías de señalización muestran diferencias significativas con respecto a la conservación (A) y variabilidad de la abundancia de proteínas (B). Las capas se generan agrupando diferentes clases de vías funcionales. Aquí, mostramos los valores de las proteínas de señalización y sus anotaciones de la base de datos de Signalink. Asignamos receptores a la capa de entrada, factores de transcripción a la salida y mediadores y cofactores (que no son ni receptores ni factores de transcripción) a la capa de transmisión. Las tendencias están esquematizadas en (C).

También comparamos las características investigadas asociadas con proteínas que son miembros exclusivos de una vía de señalización (1253 proteínas) con aquellas asociadas con proteínas reutilizadas en varias vías de señalización (235 proteínas) (ver Figura S4D-F). Observamos una conservación significativamente mayor de proteínas que son miembros de varias vías de señalización (PAG& lte −16 Wilcoxon-Mann-Whitney), mientras que la abundancia media y la variabilidad de la abundancia no mostraron diferencias significativas entre los conjuntos de proteínas. Esto está de acuerdo con el mayor número de proteínas de la capa de transmisión entre las proteínas asociadas con múltiples vías (por ejemplo, 14 adaptadores y 49 quinasas, que exceden la expectativa aleatoria 3 y 1,5 veces, respectivamente).

Interacciones de proteínas entre la entrada y la capa de transmisión.

Para investigar cómo nuestra observación de una capa de transmisión muy variable y fuertemente conservada podría ayudar a comprender los principios generales mediante los cuales las vías de señalización se modulan de una manera específica de tejido, superpusimos nuestros conjuntos de proteínas de señalización (fusionadas de Reactome y SignaLink) con la red PPI. datos de la base de datos HIPPIE [17], [18]. Como observamos la mayor variabilidad de abundancia de proteínas en la capa de entrada (Figura 3B), planteamos la hipótesis de que esta variabilidad afecta la dinámica de las interacciones físicas entre la entrada y la capa de transmisión (eliminando enlaces de señalización en ciertos tejidos o modulando la competencia por la unión en otros ).

Probamos la hipótesis de que los PPI entre la capa de entrada y la de transmisión tienden a ocurrir entre proteínas con una mayor diferencia en la variabilidad que para los PPI entre la capa de transmisión y la de salida, dentro de una capa, o PPI elegidos al azar (Figura 4A). Para probar esto, muestreamos al azar pares de proteínas que interactúan entre y dentro de la capa especificada (cada distribución de diferencias en la variabilidad de la abundancia de proteínas consistió en 1000 pares de proteínas que interactúan muestreados al azar). Encontramos la mayor diferencia entre la variabilidad de las proteínas que interactúan para los PPI entre la entrada y la capa de transmisión (Figura 4B). La distribución de las diferencias en la variabilidad fue significativamente mayor que todas las demás distribuciones (PAG& lt10 -16 Wilcoxon-Mann-Whitney). Como la diferencia en la variabilidad es mayor entre la entrada y la capa de transmisión, los resultados cumplieron con nuestras expectativas.

Consideramos los PPI donde una proteína es de la capa de entrada y la otra de la capa de transmisión (PPI-IT), proteínas que interactúan donde una es de la capa de transmisión y la otra de la capa de salida (PPI-TO), proteínas que interactúan. donde ambas proteínas son de la misma capa (PPI-W) y PPI aleatorios (PPI-Rand) (A). La distribución de diferencias entre la entrada y la capa de transmisión contiene valores significativamente mayores que todas las demás distribuciones (B). Para excluir que esta observación solo es causada por la mayor variabilidad entre las proteínas en la capa de entrada en comparación con las proteínas en la capa de transmisión, comparamos la distribución de la diferencia en la variabilidad asociada con PPI-IT con pares de proteínas que no interactúan, muestreados al azar, donde una proteína está en la capa de entrada y la otra está en la capa de transmisión (Rand-IT) (C). Nuevamente, la distribución PPI-IT es significativamente mayor.

Para probar si la diferencia observada en la variabilidad entre las proteínas que interactúan entre la entrada y la capa de transmisión se puede atribuir únicamente a la pertenencia de las proteínas participantes en diferentes capas, comparamos la distribución de las diferencias de variabilidad para las proteínas que interactúan con las de muestras aleatorias, no pares de proteínas que interactúan donde una proteína es de la entrada y otra es de la capa de transmisión (Figura 4C). Sorprendentemente, las diferencias en la variabilidad de los pares de proteínas que interactúan son significativamente más altas que las de los pares de proteínas que no interactúan (PAG& lt10 -16 Wilcoxon-Mann-Whitney). Podemos reproducir los mismos resultados al permutar los vínculos entre pares de proteínas que interactúan muestreados aleatoriamente entre la entrada y la capa de transmisión. Esto demuestra que las diferencias observadas pueden atribuirse tanto a las diferentes posiciones de la red de proteínas en las vías de señalización como a la tendencia de las proteínas de la capa de entrada variable a interactuar físicamente con las proteínas de la capa de transmisión expresadas de manera estable.

Estas observaciones sugieren que los PPI entre la entrada y la capa de transmisión podrían tener un impacto en la especificidad del tejido de la señalización.

Abundancia, variación de expresión y conservación de mutaciones de enfermedades en vías de señalización

La mayor conservación de la capa de transmisión de la señal está de acuerdo con el modelo de pajarita (o reloj de arena) que propone la presencia de un núcleo conservado con capas variables de entrada y salida que modulan la respuesta de la señal (p. Ej., Como se observa en la vía de señalización aguas abajo de EGFR [2]). El compromiso entre fragilidad y robustez de dicha arquitectura ha sido discutido [5] y, por lo tanto, estudiamos la distribución de mutaciones de enfermedades con respecto a la abundancia, variabilidad y conservación de proteínas.

Tanto la línea germinal como las mutaciones somáticas pueden conducir a la enfermedad por perturbación de las vías de señalización, p. Ej. en el cáncer [19]. Por lo tanto, investigamos la dependencia entre diferentes tipos de mutaciones y la abundancia, variabilidad y conservación de proteínas. Encontramos que las proteínas de señalización con mutaciones somáticas están significativamente más conservadas que las proteínas con mutaciones de la línea germinal (PAG = 0,001 Wilcoxon-Mann-Whitney (véase la Figura 5A). Además, investigamos cómo cambia el número medio de mutaciones de proteínas en diferentes intervalos de conservación (Figura 5B). Encontramos que tanto el número medio de mutaciones somáticas como el número medio de mutaciones de la línea germinal alcanzan su punto máximo para los valores de conservación intermedios, con la distribución de mutaciones somáticas desplazada hacia valores de conservación más altos (lo que da como resultado los valores de conservación más altos observados asociados con mutaciones somáticas). Para comparar las distribuciones de las mutaciones de la enfermedad con las tasas de mutación de fondo, también calculamos el número promedio de todos los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) informados en UniProt asociados con los diferentes intervalos de conservación. Esta distribución no alcanza un pico tan pronunciado como las dos distribuciones de mutaciones de la enfermedad y es más alta para valores de conservación bajos.Para investigar las causas funcionales del agotamiento inesperado de mutaciones para valores extremos de conservación, calculamos el enriquecimiento de categorías funcionales en los conjuntos de proteínas muy bajas y muy altamente conservadas (ver Métodos). Entre las proteínas más conservadas, las funciones con mayor enriquecimiento se relacionaron con la ubiquitinación de proteínas y el complejo proteasoma (PAG = e− 30). Las bajas tasas de ocurrencia para todas las categorías de mutaciones (somáticas, de línea germinal y todos los SNP) indican que no se toleran mutaciones en estas proteínas para mantener la integridad celular. Entre las proteínas poco conservadas, las funciones más fuertemente enriquecidas estaban todas relacionadas con la percepción sensorial y olfativa (PAG = e −195). La tasa más baja de mutaciones de la enfermedad en comparación con todos los SNP dentro de este grupo probablemente refleja el efecto tolerable de las mutaciones dentro del sistema sensorial sobre la viabilidad celular.

(A) La conservación de proteínas asociada con las proteínas de señalización que portan mutaciones de enfermedades somáticas es significativamente mayor que la de las proteínas con mutaciones de la línea germinal. (B) La distribución de conservación de proteínas se divide en cinco contenedores aproximadamente iguales (Q) y se calcula el número relativo de mutaciones somáticas (línea roja) y de la línea germinal (línea azul) asociadas con las proteínas en cada contenedor. Como comparación, se muestran los valores respectivos para todos los SNP informados de UniProt (línea gris). (C) La variabilidad de la proteína asociada con las proteínas de señalización que portan mutaciones de la enfermedad de la línea germinal es significativamente mayor que la de las proteínas con mutaciones somáticas. (D) Las proteínas se agrupan de acuerdo con su variabilidad y el número relativo de mutaciones somáticas (línea roja) y de la línea germinal (línea azul), así como todos los SNP (línea gris), se muestra para cada grupo respectivo.

Con respecto a la expresión de proteínas, encontramos que las proteínas relacionadas con la señalización con mutaciones de cáncer somático tienen una variabilidad de abundancia de proteínas significativamente menor (PAG = 0,0005 Wilcoxon-Mann-Whitney (ver Figura 5C) como aquellos con mutaciones de la línea germinal. Las distribuciones del número medio de mutaciones somáticas y de la línea germinal asociadas con diferentes intervalos de valores de variabilidad muestran un comportamiento opuesto entre sí (Figura 5D): mientras que los valores de baja variabilidad están asociados con un alto número de mutaciones somáticas, el número medio de mutaciones de la línea germinal alcanza su punto máximo para mayores valores de variabilidad (antes de que caiga el número de mutaciones de la línea germinal para el intervalo de variabilidad más alto).

También encontramos una tendencia débil, aunque significativa, de que las proteínas de la enfermedad con mutaciones somáticas se expresen más que las proteínas con mutaciones de la línea germinal en las vías de señalización (PAG& lt0.05 Wilcoxon-Mann-Whitney).

En conjunto, estas observaciones apoyan nuestra hipótesis anterior de que la vía de señalización del núcleo expresada y conservada de forma estable puede desempeñar un papel general fundamental en el desarrollo y, en general, en muchos tipos de células y, por lo tanto, las mutaciones de la línea germinal parecen no tolerarse. Por el contrario, las proteínas no centrales, que tienden a expresarse de manera más específica para el tipo de célula, pueden tolerar mutaciones de la línea germinal en mayor medida, presumiblemente ya que las enfermedades que las causan afectarán solo a algunos tejidos.


Vías MAPK de levadura

Todos Saccharomyces cerevisiae Las vías de MAPK se definieron genéticamente. Aunque los componentes se comparten entre diferentes vías, no se produce una diafonía errónea. Esto se debe a los mecanismos de aislamiento que dan como resultado una especificidad exquisita. La ruta de apareamiento fue el primer módulo MAPK que se definió, la similitud de secuencia entre Ste11 MAPKKK y Ste7 MAPKK y sus equivalentes en mamíferos ayudó a la clonación de este último.

Se han definido cinco rutas MAPK, utilizando seis MAPK: las MAPK Fus3 y Kss1 son más similares a las ERK1 / 2 de mamíferos, la MAPK Hog1 es más similar a la p38 de mamíferos y las MAPK Mpk1 (también conocidas como Slt2) Mpl1 y Smk1, que son distintas (Caffrey et al., 1999). Fus3 y Kss1 regulan el apareamiento en respuesta a las feromonas de apareamiento de péptidos y tienen sustratos compartidos y únicos, pero solo Fus3 es esencial para el apareamiento, Kss1 funciona en vías adicionales que regulan el crecimiento invasivo / desarrollo de pseudohifas y la integridad de la pared celular (Wang y Dohlman, 2004 Bardwell, 2005 Elion et al., 2005). Hog1 regula la osmolaridad intracelular en respuesta a la osmolaridad extracelular y el estrés del ácido cítrico, Mpk1 regula la integridad celular y la gemación en respuesta a los cambios mecánicos en la pared celular / membrana plasmática (con entrada indefinida de Mpl1) y Smk1 regula la esporulación, que se expresa solo después de que la meiosis ha se inició en respuesta a la privación de carbono y nitrógeno. Fus3 es activado por MAPKK Ste7 en el andamio Ste5 a través de interacciones de localización que involucran una proteína G heterotrimérica y Cdc42 GTPasa, que guían a MAPKKK Ste11 a MAPKKKK Ste20. Kss1 puede ser activado por Ste7 que no está vinculado a Ste5. Hog1 puede ser activado por Ste11 a través del enlace del andamio Pbs2 a un sensor de membrana plasmática, Sho1. También se activa mediante un sistema de relés de dos componentes que involucra el sensor Sln1 (una proteína histidina quinasa autofosforilante), una proteína de fosfotransferencia, Ypd1, y un receptor, Ssk1, que activa dos MAPKKKs Ssk2 y Ssk22 que activan Pbs2 MAPKK (Chellapan, 2000 Westfall et al., 2004). Mpk1 (y posiblemente Mpl2) regula la integridad celular y es activado por MAPKKK Bck1 y MAPKKs Mkk1 y Mkk2 en respuesta a la estimulación de proteínas similares a las integrinas (es decir, Wsc1-4, Mid2) ligadas a factores de intercambio de nucleótidos de guanina (Rom1 y Rom2 ) que activan la Rho1 GTPasa, que activa la proteína quinasa C (PKC) 1, una MAPKKKK para la vía (Hohmann, 2002).

Las proteínas de andamio son esenciales para el apareamiento y la señalización de alta osmolaridad. Ste5 y Pbs2 proporcionan especificidad al segregar quinasas compartidas con quinasas y receptores específicos de la vía que detectan los estímulos (Elion, 1998). Ste5 proporciona sitios de unión separados para Ste11, Ste7 y Fus3 y estimula el fosfo-relevo mediante efectos de proximidad, oligomerización y cambios conformacionales (Elion, 2001 Ferrell y Cimprich, 2003). El andamio de Pbs2 une Ste11 con Hog1 y también une Ste11 a Ste20 unido a Cdc42-GTP, mediante la unión de su dominio rico en prolina a un dominio SH3 de Sho1, que también se une a Ste11.

Las MAPK de levadura juegan un papel importante en la fisiología celular, aunque no son esenciales. hog1Δ y mpk1Δ Los mutantes individuales crecen mal, las cepas que carecen de todas las MAPK están muy enfermas y la reproducción sexual y la esporulación están bloqueadas en fus3Δ kss1Δ y smk1Δ mutantes, respectivamente. Las MAPK son inhibidas en diversos grados por MAPK fosfatasas, Msg5 y Sdp1, tirosina fosfatasas, Ptp2 y Ptp3, y Ptc1, una fosfatasa Ser / Thr de tipo 2C (PP2C).

Las MAPK de levadura ayudan a mantener la especificidad de la señalización: Hog1 evita la activación incorrecta de Fus3 y Kss1 por Ste11 durante el estrés de alta osmolaridad (Sprague, 1998) y Fus3 induce la degradación del regulador de crecimiento invasivo Tec1 y atenúa Kss1 (Elion et al., 2005). Factores adicionales pueden prevenir la activación incorrecta de la vía HOG por Ste11 activado durante el apareamiento y el crecimiento filamentoso y mejorar la activación de Fus3 sobre la de Kss1 durante el apareamiento.


Los científicos descubren una enzima de estrés celular que podría desempeñar un papel clave en enfermedades neurodegenerativas como la ELA

Una enzima llamada MARK2 ha sido identificada como un interruptor clave en la respuesta al estrés en las células en un estudio realizado por investigadores de la Escuela de Salud Pública Johns Hopkins Bloomberg. La sobreactivación de este tipo de respuesta al estrés es una posible causa de lesión de las células cerebrales en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, el Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica. El descubrimiento convertirá a MARK2 en un foco de investigación por su posible papel en estas enfermedades y, en última instancia, puede ser un objetivo para los tratamientos de enfermedades neurodegenerativas.

Además de su relevancia potencial para las enfermedades neurodegenerativas, el hallazgo es un avance en la comprensión de la biología celular básica.

El documento que describe el descubrimiento aparece en línea el 11 de marzo en Biología PLoS.

El estudio se centró en la respuesta celular al estrés "proteotóxico", una acumulación de proteínas dañadas o agregadas dentro de la parte principal de la célula, que es una característica central de las enfermedades neurodegenerativas. Se ha sabido que las células responden a este tipo de estrés reduciendo la producción de nuevas proteínas y que una enzima de señalización probablemente medie en esta respuesta. Los investigadores, después de descartar otras enzimas de señalización, pudieron demostrar que la enzima de señalización MARK2 tiene este papel.

"Nuevos estudios de esta vía de señalización previamente desconocida deberían ampliar nuestra comprensión de la regulación de proteínas en las células y el papel de este proceso en el desarrollo de enfermedades humanas", dice Jiou Wang, Ph.D., profesor del Departamento de Bioquímica y Molecular Biología en la Escuela Bloomberg.

Juntos, el Alzheimer, la ELA y otros trastornos neurodegenerativos afectan a más de 50 millones de personas en todo el mundo. Hasta la fecha, no existe un tratamiento que ralentice la enfermedad, y mucho menos una cura, para ninguno de ellos, principalmente porque sus causas no se comprenden bien.

Un posible conjunto de causas de los trastornos neurodegenerativos se relaciona con el estrés proteotóxico y la respuesta de las células cerebrales. Cuando esta respuesta se activa, reduciendo la síntesis de proteínas, idealmente minimiza la carga de proteínas de la célula bajo estrés proteotóxico, lo que le permite recuperarse del estrés. Pero la reducción a largo plazo de la síntesis de proteínas podría terminar privando a la célula de las proteínas necesarias, dañándola y potencialmente desencadenando la muerte celular. En otros casos, la falla de la respuesta al estrés proteotóxico, en lugar de su sobreactivación, puede ser el problema, de modo que la sobrecarga de proteínas conduce a la lesión celular o la muerte.

Para comprender completamente cualquiera de los escenarios, los científicos deben comprender la vía de señalización que detecta el estrés proteotóxico y activa la respuesta al estrés proteotóxico. Wang y sus colegas en su nuevo estudio se propusieron descubrirlo.

Como otros en este campo, el equipo de investigación ya sabía que la molécula al final de esta vía que apaga la producción de proteínas es miembro de una amplia clase de enzimas de señalización llamadas quinasas. También sabían de antemano que hay varias quinasas específicas que interrumpen la producción de proteínas de la misma manera, pero en respuesta a otros tipos de estrés celular, como la infección viral. El desafío en este estudio fue encontrar la quinasa específica que activa este interruptor en respuesta al estrés proteotóxico en la parte principal de la célula.

Los investigadores identificaron por primera vez la quinasa MARK2 como uno de varios candidatos para su investigación al examinar una gran base de datos, producida con investigaciones previas, de varias quinasas y las proteínas sobre las que potencialmente actúan. Siguiendo sus pistas con varios experimentos de cultivo celular y sin células, pudieron demostrar que MARK2, y ninguna otra quinasa candidata, puede apagar la maquinaria de producción de proteínas en las células en respuesta al estrés proteotóxico, incluso cuando los otros cuatro conocidos las quinasas de desactivación de proteínas están ausentes.

Mirando hacia arriba en la vía de señalización, el equipo descubrió que MARK2 es activado por otra quinasa de señalización, PKCδ, que se vuelve disponible para su función de activación de MARK2 en condiciones de estrés proteotóxico, actuando así eficazmente como un sensor de estrés proteotóxico.

Como comprobación preliminar de la relevancia clínica de estos hallazgos, los investigadores examinaron un modelo de ratón de ELA familiar y muestras de tejido de la médula espinal de pacientes humanos con ELA. Encontraron evidencia de que esta vía PKCδ-MARK2 es muy activa en estos casos en comparación con los humanos y los ratones sin ELA.

"Estos hallazgos son consistentes con la idea de que en la ELA, por ejemplo, esta vía PKCδ-MARK2 es muy activa y reduce la producción de proteínas, lo que a largo plazo contribuye al proceso de la enfermedad", dice Wang.

Habiendo aclarado los conceptos básicos de cómo funciona esta vía, Wang y sus colegas ahora planean estudiarla en diferentes modelos de enfermedades neurodegenerativas para determinar si la vía podría apuntar para tratar tales enfermedades.

"Sospecho que esta vía PKCδ-MARK2 finalmente demostrará ser relevante no solo en los trastornos neurodegenerativos sino en muchas otras enfermedades, incluidos los cánceres", dice Wang.

Más información: "MARK2 fosforila eIF2α en respuesta al estrés proteotóxico" Biología PLoS (2021).


La transducción de señales a través de cascadas MAPK puede requerir tráfico endocítico y / o transporte molecular activo

Nuestros resultados demuestran que el reclutamiento en la membrana de proteínas citosólicas específicas puede mejorar la activación inducida por el receptor de un objetivo anclado a la membrana, como la proteína Ras o una quinasa unida a la membrana, en 1000 veces, pero ¿cómo lo hacen las señales que emanan de las proteínas unidas a la membrana? propagarse al interior de la célula y llegar al núcleo? Mostraremos aquí que la simple difusión de proteínas activadas puede ser insuficiente para la transferencia de señales a través de las vías MAPK.

Activación de MAPK por RTK y GPCR

Las cascadas de MAPK están ampliamente involucradas en la transducción de señales eucariotas, y estas rutas se conservan evolutivamente en células desde levaduras hasta mamíferos (revisado en Chang y Karin, 2001 Lewis et al., 1998). Las células de mamífero expresan al menos cuatro familias diferentes de MAPK, incluidas las cascadas ERK, la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y p38 MAPK. Una cascada de tres niveles comprende MAPK, MAPK quinasa (MKK) y MKK quinasa (MKKK). Una quinasa en el primer nivel de cascada, MKKK, se activa en la membrana celular. Una quinasa en el nivel inferior, MAPK, se activa en el citosol y fosforila las proteínas diana tanto en el citosol como en el núcleo. La señalización mitógena por RTK y GPCR está asociada con la estimulación de la cascada ERK dependiente de Ras. El paradigma clásico para la señalización de GPCR implica la interacción dependiente de agonistas de GPCR con proteínas G heterotriméricas que estimula el intercambio de GDP unido por GTP, lo que da como resultado la disociación de proteínas G en subunidades α y βγ. La interacción posterior de las subunidades α y βγ con las enzimas efectoras o los canales iónicos regula la generación de segundos mensajeros solubles o cambios de conductancia iónica. Sin embargo, este paradigma debería ampliarse para incluir los efectos proliferativos y diferenciativos de los GPCR. Actualmente se sabe que en una multitud de tipos de células, los GPCR estimulan las cascadas MAPK, tales como las cascadas ERK, JNK y p38 MAPK (Garrington y Johnson, 1999 Gutkind, 1998 van Biesen et al., 1996). Curiosamente, las vías de activación de MAPK mediada por GPCR y RTK a menudo convergen. Recientemente, ha surgido evidencia de que la superposición de las vías de señalización de GPCR y RTK se explica en parte por la `` activación '' de RTK mediada por GPCR, como EGFR (Figura 1), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor de crecimiento similar a la insulina. -1 receptor. Por ejemplo, se demostró que la activación de EGFR por GPCR está mediada por vías de señalización que involucran tirosina quinasas no receptoras, Src y Pyk2, y a través de la activación de la metaloproteasa que conduce a la liberación de EGF de unión a heparina (Pierce et al., 2001 Prenzel et al. ., 1999). Sin embargo, es importante darse cuenta de que aunque la transactivación de RTK es ahora un mecanismo reconocido para la activación de la cascada de ERK inducida por GPCR, otras vías de señalización también pueden contribuir a este vínculo (Andreev et al., 2001 Miller y Lefkowitz, 2001).

Distribución espacial heterogénea de componentes activados en cascadas MAPK

Se fosforilan y desfosforilan múltiples proteínas celulares en distintas ubicaciones celulares. En la vía Ras-ERK, Raf-1 inactivo (MKKK) reside en el citosol. Tras la estimulación de los receptores de la superficie celular, Raf-1 se transloca desde el citosol a la membrana plasmática mediante una unión de alta afinidad a Ras cargado con GTP. En la membrana, Raf-1 sufre una serie de pasos de activación que implican la interacción con las proteínas 14-3-3 y la fosforilación en residuos específicos de tirosina y serina (Mason et al., 1999). Aunque el mecanismo de activación aún no se comprende completamente, la asociación de Raf-1 con membranas parece ser esencial para su activación. La quinasa Raf-1 fosforila la quinasa citosólica MEK (MKK) en la membrana plasmática, mientras que las serina / treonina fosfatasas solubles desfosforilan la MEK activada en la fase de masa (Kyriakis et al., 1992 Strack et al., 1997). En el citosol, la MEK quinasa activa fosforila ERK (MAPK) y las fosfatasas ERK específicas se localizan en el citosol y el núcleo. La separación espacial de proteína quinasas y fosfatasas sugiere que puede haber gradientes celulares de formas fosforiladas (activas) de MEK y ERK, con concentraciones altas en la región periplásmica cerca del lugar de fosforilación y concentraciones bajas a una distancia de la membrana plasmática. Dado que la ERK activada fosforila múltiples dianas citoplasmáticas y nucleares, los grandes gradientes espaciales de esta quinasa pueden tener implicaciones muy importantes para la señalización celular.

Disminución de la concentración de fosfoproteínas con la distancia de la membrana celular a diferentes valores del parámetro α. El parámetro α está determinado por la relación entre los tiempos característicos de difusión y la reacción de la fosfatasa (α 2 =Kpag×L 2 /D,dónde L es el radio de la celda, Kpag=Vmax, p/Km, p es la constante de velocidad de primer orden observada de la fosfatasa y D es el coeficiente de difusión de proteínas). La disminución, pag(X)/pag(1), se calcula como la relación de las concentraciones de la forma fosforilada a distancia SG desde el centro celular y en la membrana plasmática, donde X= 1. Reproducido con permiso de Kholodenko (2002).

Disminución de la concentración de fosfoproteínas con la distancia de la membrana celular a diferentes valores del parámetro α. El parámetro α está determinado por la relación entre los tiempos característicos de difusión y la reacción de la fosfatasa (α 2 =Kpag×L 2 /D,dónde L es el radio de la celda, Kpag=Vmax, p/Km, p es la constante de velocidad de primer orden observada de la fosfatasa y D es el coeficiente de difusión de proteínas). La disminución, pag(X)/pag(1), se calcula como la relación de las concentraciones de la forma fosforilada a distancia SG desde el centro celular y en la membrana plasmática, donde X= 1. Reproducido con permiso de Kholodenko (2002).

Este análisis sugiere que a menos que haya un mecanismo adicional (además de la difusión lenta de proteínas) para la propagación de la señal a través de la cascada MAPK, los niveles de MEK y ERK activadas caerán precipitadamente en el interior de la célula. A distancias mayores de varios μm de la membrana plasmática, la señal de fosforilación debería disminuir a niveles subumbrales, siempre que la actividad de la fosfatasa citosólica sea suficientemente alta. Dado que los radios de las células eucariotas varían de 5 a 50 μm, llegamos a la conclusión de que la propagación de un mensaje desde la membrana plasmática al núcleo puede requerir un vehículo adicional además de la difusión en el citoplasma.

Un nuevo papel de la endocitosis en la activación de la señalización de MAPK

Tras la unión y activación del ligando, muchos GPCR y RTK internalizan vía fosas recubiertas de clatrina. Por ejemplo, en los hepatocitos más del 50% del EGFR fosforilado se transfiere a los endosomas tempranos durante los primeros 10 minutos después de la estimulación con EGF (Di Guglielmo et al., 1994).La internalización toma complejos de receptor-ligando y otras proteínas de señalización de la membrana plasmática y las lleva al interior de la célula. Las moléculas que no se reciclaron de nuevo a la membrana celular se degradan en los lisosomas. Aunque los GPCR internalizados se reciclan continuamente de nuevo a la superficie celular después de la desfosforilación en los endosomas, una proporción significativa de receptores se localiza internamente (Koenig y Edwardson, 1997). Por lo tanto, tradicionalmente, la endocitosis mediada por clatrina se ha implicado en la regulación a la baja de la señalización por los receptores de la membrana plasmática. Un nuevo papel de la endocitosis en la activación de la cascada ERK por los receptores de la superficie celular se informó por primera vez para el receptor de EGF (Vieira et al., 1996). Se puede imponer un defecto condicional en la endocitosis por la expresión regulada de una forma mutante de dinamina (Dyn1-K44A), una GTPasa necesaria para la formación de vesículas recubiertas de clatrina. En las células HeLa, esta expresión condujo a una marcada disminución en la activación de ERK inducida por EGF, mientras que la fosforilación de Shc se incrementó en las células con endocitosis defectuosa. Estudios posteriores han demostrado que la activación de ERK mediada por GPCR y EGFR es sensible a varios inhibidores distintos de la endocitosis mediada por clatrina, incluida la monodansilcadaverina, el agotamiento del K + intracelular o del colesterol, la citocalasina D y una dinamina mutante (Ceresa et al., 1998 Daaka et al., 1998 Kranenburg et al., 1999 Maudsley et al., 2000 Rizzo et al., 2001 Vieira et al., 1996). Por lo tanto, un posible mecanismo de control sobre la transducción de señales puede involucrar la endocitosis del receptor (Clague y Urbe, 2001 Di Fiore y De Camilli, 2001 Haugh et al., 1999). Sin embargo, mientras que la evidencia experimental apunta a un papel esencial de la endocitosis del receptor en la activación de las cascadas de MAPK, la razón de la participación de la maquinaria endocítica sigue siendo poco conocida (Ceresa y Schmid, 2000 Kranenburg et al., 1999 Pierce et al., 2000 ). Curiosamente, en algunos sistemas celulares no se requería endocitosis para activar ERK (para una revisión, ver Leof, 2000).

La relación entre la internalización del receptor y la activación de ERK nos permite sugerir que el tráfico de intermediarios de señalización dentro de las vesículas endocíticas puede ser una forma eficaz de propagar la señal (Kholodenko, 2002). De hecho, se informó que la participación de la maquinaria endocítica es esencial para la activación de ERK por MEK, pero no para la activación de Ras (Kranenburg et al., 1999). Curiosamente, los datos sobre la distribución subcelular de MEK activada demostraron que la MEK bifosforilada es detectable solo en la membrana plasmática y en vesículas intracelulares, mientras que la reserva total de MEK es citosólica (Kranenburg et al., 1999). El tráfico endocítico de MEK activa puede ayudar a evitar la formación de gradientes espaciales pronunciados de MEK fosforilada y ERK, ya que este mecanismo supera la separación espacial de quinasas y fosfatasas dentro de la cascada MAPK. Por lo tanto, la endocitosis de MEK fosforilada (o un complejo proteico que contiene MEK activada) en lugar de los receptores activados parece ser crítica para la activación de ERK.

Andamiaje, transmisión citoplasmática y transporte activo como mecanismos que facilitan la propagación de la señal.

Otros mecanismos además de la endocitosis pueden ayudar a difundir las señales de fosforilación desde la membrana plasmática hacia el interior de la célula evitando la formación de gradientes espaciales pronunciados de ERK fosforilada. Por ejemplo, el flujo citoplásmico, es decir, los flujos de disolventes provocados por el movimiento de orgánulos citoplasmáticos a lo largo de los cables de actina, pueden contribuir al transporte intracelular de quinasas MAPK activadas (Agutter et al., 1995). Evidencia reciente indica que los componentes en cascada de MAPK pueden unirse a proteínas de andamiaje, p. MP1 y JIP-1 en células de mamíferos (para una revisión, véase Garrington y Johnson, 1999). La desfosforilación de las MAP quinasas en los complejos de armazón puede disminuir o incluso evitarse debido a obstrucciones estéricas, como sugirieron Levchenko et al. (2000).

El andamiaje también puede ayudar a entregar un complejo de señalización completo que contiene las MAP quinasas a las vesículas endocíticas. Se han descubierto nuevos mecanismos que unen los GPCR a la activación de MAPK mediante el uso de β-arrestina como andamio para las cascadas ERK y JNK (Miller y Lefkowitz, 2001 Pierce et al., 2001). Además de su papel en la desensibilización de GPCR, se ha demostrado que la β-arrestina promueve la orientación del receptor a las fosas recubiertas de clatrina. Como las β-arrestinas también pueden reclutar y activar Src, es probable que todas las cascadas de ERK y JNK puedan activarse y reclutarse para la internalización mediada por clatrina.

Los datos recientes sugieren que los motores moleculares pueden participar en el transporte de complejos de señalización. De hecho, en las células nerviosas, se ha identificado una carga para la quinesina motora molecular como proteínas de andamiaje para la vía JNK, conocidas como JIP (Verhey y Rapoport, 2001). Las vesículas endocíticas y los complejos de señalización, cargados en motores moleculares, pueden transportarse a lo largo de los microtúbulos a ubicaciones celulares remotas.


Una descripción general de las vías de señalización que regulan la actividad de YAP / TAZ

YAP y TAZ son proteínas homólogas expresadas de forma ubicua originalmente identificadas como penúltimos efectores de la vía de señalización de Hippo, que desempeña un papel clave en el mantenimiento del tamaño del tejido / órgano de los mamíferos. En la actualidad, se sabe que YAP / TAZ también interactúan con varias vías de señalización que no son de hipopótamo y tienen diversas funciones en múltiples procesos biológicos, incluida la proliferación celular, la regeneración de tejidos, la determinación del destino del linaje celular, la tumorigénesis y la mecanosensibilidad. En esta revisión, primero examinamos las diversas señales microambientales y vías de señalización que regulan la activación de YAP / TAZ, a través de las vías de señalización Hippo y no Hippo. A esto le sigue un breve resumen de las interacciones de YAP / TAZ con TEAD1-4 y una amplia gama de otros factores de transcripción distintos de TEAD. Finalmente, ofrecemos una perspectiva crítica sobre cómo el conocimiento cada vez mayor de los mecanismos reguladores de la señalización YAP / TAZ podría abrir la puerta a nuevas aplicaciones terapéuticas en los campos interrelacionados de biomateriales, ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y biología sintética.

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Ver el vídeo: Señalización intracelular V: Receptor Tirosin-Kinasa - MAPK (Mayo 2022).