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¿Cómo invierto mi inserto dentro de un plásmido?

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Tengo un plásmido con:

… T7pro. - RBS - Sitio de corte XBa1 - ProDpro. - RBS - AmilCP - T - Sitio de corte Spe1 - T…

¿Cómo diseño cebadores para invertir la parte en negrita, de modo que los promotores T7 y ProD estén en lados opuestos de AmilCP? Me resulta difícil entender cómo diseñar los cebadores adecuados.


Diseñe su imprimación de 5 'aguas arriba de ProDpro. con un sitio de corte Spe1 agregado al final (más algunas bases aleatorias adicionales para permitir un mejor corte). Agregue un sitio de corte Xba1 al final de la imprimación de 3 ', nuevamente con algunas bases aleatorias adicionales en el extremo para permitir un mejor corte.

Amplifique el inserto, limpie la PCR, digiera, limpie de nuevo y podrá clonar fácilmente en el vector digerido con Xba1 / Spe1 que se ha purificado en gel.


Charla: Biología sintética: Vectores / Plásmido de copia única

Me preguntaba sobre la disposición de los sitios de VF / VR y los terminadores. Si los terminadores estuvieran fuera de los sitios de VF / VR, obtendríamos lecturas de secuenciación algo más largas. De la forma en que están diseñados actualmente, supongo que habría menos posibilidad de transcripción no específica, por lo que hay argumentos de cualquier manera: BC

    Actualmente, los sitios VF2 y VR se encuentran fuera de los terminadores porque, por lo general, los datos de secuencia toman al menos


PCR de colonias

La PCR de colonias es un método conveniente de alto rendimiento para determinar la presencia o ausencia de inserto de ADN en construcciones de plásmidos. Los transformantes individuales pueden lisarse en agua con un paso de calentamiento corto o agregarse directamente a la reacción de PCR y lisarse durante el paso de calentamiento inicial. Este paso de calentamiento inicial provoca la liberación del ADN plasmídico de la célula, por lo que puede servir como molde para la reacción de amplificación. Se pueden usar cebadores diseñados para apuntar específicamente al ADN del inserto para determinar si la construcción contiene el fragmento de ADN de interés. Alternativamente, se pueden usar cebadores que se dirigen al ADN del vector que flanquea el inserto para determinar si el inserto tiene o no el tamaño molecular correcto. Los cebadores específicos del inserto pueden proporcionar información sobre la especificidad y el tamaño del ADN del inserto, mientras que el uso de cebadores específicos del vector permite el cribado de múltiples construcciones simultáneamente. La PCR de colonias también se puede utilizar para determinar la orientación del inserto. La amplificación por PCR del plásmido usando un cebador específico de inserto emparejado con un cebador específico de vector puede diseñarse para producir un amplicón de un tamaño específico solo si el inserto está en la orientación correcta. En todos los diseños experimentales, la presencia o ausencia de un amplicón de PCR y el tamaño del producto se determinan mediante electroforesis junto con un marcador de tamaño de ADN en un gel de agarosa.

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Hipótesis de provirus de ADN

A mediados del siglo XX hubo muchos avances en biología molecular, incluida la descripción del ADN en 1953 por el genetista y biofísico estadounidense James D. Watson y los biofísicos británicos Francis Crick y Maurice Wilkins. En la década de 1960 se entendió que los sarcomas son causados ​​por una mutación que da como resultado una división celular descontrolada. También fue evidente que el VSR se heredaba durante la división de las células cancerosas. Esta herencia se produjo de una manera que concuerda con las leyes mendelianas de la herencia genética, leyes que hasta ahora se había entendido que se aplicaban solo a las moléculas de ADN (ver los artículos genética y herencia).

Los científicos plantearon la hipótesis de que, para que se produzca dicha herencia viral, un virus necesitaría transcribir su genoma de ARN en ADN y luego insertar este ADN en el genoma de la célula huésped. Una vez incorporado al genoma del huésped, el virus se transcribirá como si fuera otro gen y podría producir más virus de ARN a partir de su ADN. Esta hipótesis, llamada "hipótesis del provirus de ADN", fue desarrollada a fines de la década de 1950 por el virólogo estadounidense Howard Martin Temin, cuando era becario postdoctoral en el laboratorio del virólogo italiano Renato Dulbecco en el Instituto de Tecnología de California. La hipótesis de Temin se propuso formalmente en 1964. La hipótesis del provirus surgió cuando los experimentos demostraron que un antibiótico llamado actinomicina D, que es capaz de inhibir la síntesis de ADN y ARN, inhibía la reproducción del RSV. Sin embargo, el concepto de que una molécula de ARN se convierta en ADN atrajo a muy pocos seguidores.


¿Cómo sabes si funcionó?

Después de la transformación, las bacterias se cultivan en un alimento rico en nutrientes llamado agar. Solo las bacterias que contienen un plásmido con resistencia a los antibióticos crecerán en presencia de un antibiótico.

Por ejemplo, si las bacterias se cultivan en agar que contiene el antibiótico ampicilina, solo sobrevivirán las bacterias que se hayan transformado con un plásmido que contenga el gen de resistencia a la ampicilina.

Las bacterias transformadas se pueden cultivar en grandes cantidades. El ADN de interés, o la proteína codificada por el ADN, puede aislarse y purificarse.


Protocolo de transfección general

Preparación de células para la transfección

Eliminación de células adherentes con tripsina

La tripsinización de las células antes del subcultivo o el recuento celular es una técnica importante para el éxito del cultivo celular. La siguiente técnica funciona consistentemente bien al pasar células.

Materiales necesarios:

  • Solución de tripsina-EDTA 1X
  • 1X PBS o 1X HBSS
  • células adherentes para ser subcultivadas
  • medio de crecimiento apropiado (por ejemplo, DMEM) con suero o factores de crecimiento o ambos agregados
  • Placas de cultivo, matraces o placas de pocillos múltiples, según sea necesario
  • hemocitómetro
  1. Prepare una solución estéril de tripsina-EDTA en una solución salina libre de calcio y magnesio, como 1X PBS o 1X HBSS. La solución 1X se puede congelar y descongelar para uso futuro, pero la actividad de la tripsina disminuirá con cada ciclo de congelación-descongelación. La solución de tripsina-EDTA se puede almacenar hasta 1 mes a 4 ° C.
  2. Retire el medio del plato de cultivo de tejidos. Agregue suficiente PBS o HBSS para cubrir la monocapa celular: 2 ml para un matraz de 150 mm, 1 ml para una placa de 100 mm. Mueva las placas para distribuir la solución de manera uniforme. Retirar y repetir el lavado. Retirar el lavado final. Agregue suficiente solución de tripsina para cubrir la monocapa celular.
  3. Coloque las placas en una incubadora a 37 ° C hasta que las células comiencen a desprenderse (generalmente 1 y 2 minutos).
  4. Retire el matraz de la incubadora. Golpee fuertemente el fondo y los lados del recipiente de cultivo con la palma de su mano para ayudar a desalojar las células adherentes restantes. Observe las células con un microscopio para comprobar si todas las células se han desprendido de la superficie de crecimiento. Si es necesario, las células pueden devolverse a la incubadora durante 1 & ndash2 minutos adicionales.
  5. Cuando todas las células se hayan desprendido, agregue medio que contenga suero a las células para inactivar la tripsina. Pipetee suavemente las células para romper los grupos de células. Las células pueden contarse usando un hemocitómetro, distribuirse en placas frescas para el subcultivo, o ambos.

Normalmente, las células se subcultivan para prepararlas para la transfección al día siguiente. El subcultivo debe llevar las células de interés a la confluencia deseada para la transfección. Como pauta general, coloque en placa 5 y veces 10⁴ células por pocillo en una placa de 24 pocillos o 5,5 y veces 10⁵ células para una placa de cultivo de 60 mm para

Confluencia del 80% el día de la transfección. Cambie los números de celda proporcionalmente para placas de diferentes tamaños (consulte la Tabla 3).

Tabla 3. Área de las placas de cultivo para el crecimiento celular.

Tamaño de la placa Área de crecimiento a (cm y sup2) Área relativa b
24 pocillos 1.88 1X
96 pocillos 0.32 0,2 veces
12 pocillos 3.83 2X
6 pocillos 9.4 5X
35 mm 8.0 4,2 veces
60 mm 21 11X
100 mm 55 29X

a Esta información se calculó para platos de cultivo Corning & reg.
b El área relativa se expresa como un factor del área de crecimiento total de la placa de 24 pocillos recomendada para los estudios de optimización. Para determinar la densidad de enchapado adecuada, multiplique 5 y 10⁴ las celdas por este factor.

Preparación del ADN para la transfección

El ADN de alta calidad libre de nucleasas, ARN y productos químicos es tan importante para una transfección exitosa como el reactivo de transfección elegido. Consulte el capítulo de la Guía de protocolos y aplicaciones sobre purificación de ADN para obtener información sobre la purificación de ADN con calidad de transfección.

Ejemplo de protocolo usando ViaFect & trade Reagent

Recomendamos encarecidamente que optimice las condiciones de transfección para cada línea celular. Si ha optimizado los parámetros de transfección, utilice las condiciones determinadas empíricamente para sus transfecciones experimentales.

Si elige no optimizar los parámetros de transfección, utilice las condiciones generales recomendadas a continuación.

Materiales necesarios:

  • medio de cultivo celular con suero apropiado para el tipo de célula que se transfecta
  • medio de cultivo celular sin suero para la formación de complejos (como el medio de suero reducido Opti-MEM & reg I)
  • Placas de cultivo de 96 pocillos u otras
  • Placas de dilución con fondo en U o en V o tubos de microcentrífuga

El volumen total de complejo de transfección (medio, ADN y reactivo de transfección ViaFect & trade) a añadir por pocillo de una placa de 96 pocillos es 5 & ndash10 & mul. El siguiente protocolo es una guía para transfectar aproximadamente 10 & ndash20 pocillos, dependiendo del volumen de ViaFect & trade Transfection Reagent: mezcla de ADN utilizada. Para pozos adicionales, escale los volúmenes en consecuencia.

  1. A un tubo estéril o una placa con fondo en U o en V, agregue 90 & ndash99 & mul de medio sin suero precalentado a temperatura ambiente para que el volumen final después de agregar el ADN sea 100 & mul. Agregue 1 & taza de ADN plasmídico al medio y mezcle. Para obtener una relación de reactivo de transfección ViaFect & trade: ADN de 3: 1, agregue 3 & mul de reactivo de transfección ViaFect & trade y mezcle inmediatamente.
  2. Incube el reactivo de transfección ViaFect & trade: mezcla de ADN durante 5 y 20 minutos a temperatura ambiente.
    Opcional: Agregue la mezcla a las células sin un período de incubación.
    Nota: Las incubaciones más largas pueden afectar negativamente a las transfecciones.
  3. Agregue 5 & ndash10 & mul del reactivo de transfección ViaFect & trade: mezcla de ADN por pocillo a una placa de 96 pocillos que contiene 100 & mul de células en medio de crecimiento. Sugerimos 10 & mul de mezcla como punto de partida. Mezcle suavemente pipeteando o usando un agitador de placas durante 10 y 30 segundos. Devuelva las células a la incubadora durante 24 y 48 horas.
    Nota: El volumen total del medio de cultivo puede variar según el formato del pozo y las prácticas habituales de su laboratorio y rsquos.
  4. Mida la eficacia de la transfección utilizando un ensayo apropiado para el gen indicador. Para la transfección transitoria, las células se analizan típicamente 24 y 48 horas después de la transfección.

Optimización de la transfección con reactivos lipídicos

En secciones anteriores, discutimos los factores que influyen en el éxito de la transfección. Aquí presentamos un método para optimizar la transfección de una línea celular particular con un solo reactivo de transfección. Para reactivos basados ​​en lípidos más modernos, como el reactivo de transfección ViaFect & trade, recomendamos analizar inicialmente 50 ndash100 ng de ADN por pocillo de una placa de 96 pocillos con relaciones reactivo: ADN de 3: 1 o 4: 1 para líneas celulares adherentes o 2: 1 para líneas celulares en suspensión. La Figura 4 describe una matriz de optimización típica. Al preparar el reactivo de transfección ViaFect & trade: complejo de ADN, el tiempo de incubación puede requerir optimización, recomendamos 5 y 20 minutos.

Figura 4. Optimización de la transfección con el reactivo de transfección ViaFect & trade. Las células TF-1 se sembraron en medio de crecimiento sin antibióticos a 30.000 células por pocillo en una placa de ensayo blanca de 96 pocillos y se transfectaron con un CMV-luc2 plásmido usando varios lípidos (ViaFect & trade Transfection Reagent): proporciones de ADN. La concentración de ADN se mantuvo constante a 1 & mug por 100 & mul de medio de suero reducido Opti-MEM & reg I, y se varió la cantidad de reactivo de transfección ViaFect & trade para obtener las proporciones indicadas. A continuación, se añadieron 5 o 10 µl de complejo de transfección a las células en la placa de 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la transfección, se realizó el ensayo de luciferasa ONE-Glo & trade + Tox. Tenga en cuenta que 0: 1 es el control negativo con ADN pero sin lípidos. Estos resultados muestran que, para esta línea celular en particular, una relación 2: 1 de reactivo de transfección ViaFect & trade: ADN dio resultados óptimos.

Para los reactivos lipídicos catiónicos tradicionales, recomendamos analizar varias cantidades de ADN transfectado (0,25, 0,5, 0,75 y 1 µg por pocillo en una placa de 24 pocillos) con dos proporciones de carga de reactivo lipídico a ADN (2: 1 y 4: 1, consulte la Figura 5). Esta breve optimización se puede realizar utilizando un intervalo de transfección de 1 hora en condiciones libres de suero. Se requiere una placa de cultivo de 24 pocillos por reactivo para la breve optimización con células adherentes (tres réplicas por cantidad de ADN).

Figura 5. Formato de placa sugerido para la optimización inicial de las condiciones de transfección de lípidos catiónicos.

Se puede realizar una optimización más completa para examinar las proporciones de carga adicionales, los puntos de tiempo y los efectos del medio que contiene suero en las cantidades de ADN que se consideren óptimas durante los estudios de optimización inicial. Una hora o dos horas para el intervalo de transfección es óptimo para muchas líneas celulares. En algunos casos, sin embargo, puede ser necesario probar las proporciones de carga y los intervalos de transfección fuera de estos rangos para lograr una transferencia genética óptima.

Algunos métodos de transfección requieren eliminar el medio con reactivo después de la incubación, otros no. Lea la literatura técnica que acompaña al reactivo de transfección seleccionado para saber qué método es apropiado para su sistema. Sin embargo, si hay una muerte celular excesiva durante la transfección, considere disminuir el tiempo de exposición al reactivo de transfección, disminuir las cantidades de ADN y reactivo agregadas a las células, sembrar células adicionales y retirar el reactivo después del período de incubación y agregar medio completo.

Ensayos de punto final

Muchos ensayos de expresión transitoria utilizan ensayos indicadores líticos como el sistema de ensayo Dual-Luciferase & reg Assay System (nº de cat. E1910) y el sistema de ensayo Bright-Glo & trade (nº de cat. E2610) 24 horas después de la transfección. El sistema de ensayo indicador Nano-Glo & reg Dual-Luciferase & reg Reporter (Cat. # N1610) permite la detección en tan solo unas horas después de la transfección. Sin embargo, el marco de tiempo para la mayoría de los ensayos puede variar (24 & ndash72 horas después de la transfección), dependiendo de los niveles de expresión de proteínas. Los ensayos de proteína informadora utilizan métodos colorimétricos, radiactivos o luminiscentes para medir la actividad enzimática presente en un lisado celular. Algunos ensayos (p. Ej., Luciferase Assay System) requieren que las células se lisen en un tampón después de eliminar el medio y luego se mezclen con un reactivo de ensayo separado para determinar la actividad luciferasa. Otros son ensayos homogéneos (por ejemplo, Bright-Glo & trade Assay System) que incluyen el reactivo de lisis y el reactivo de ensayo en la misma solución y se pueden agregar directamente a las células en el medio. Examine los resultados del ensayo informador y determine dónde se produjo la mayor expresión (lectura más alta). Estas son las condiciones para usar con sus constructos de interés.

Los métodos de detección alternativos incluyen tinción histoquímica de células (determinando el porcentaje de células que se tiñen en presencia del sustrato del gen informador Figura 6), microscopía de fluorescencia (Figura 7) o clasificación celular si se usa un indicador fluorescente como Monster Green & reg Fluorescent Protein phMGFP Vector (Cat. # E6421).

Figura 6. Tinción histoquímica de células RAW 264.7 para y actividad beta-galactosidasa. Se transfectaron células RAW 264.7 usando 0,1 µg de ADN por pocillo y una relación de 3: 1 de FuGENE y reg HD a ADN. Los complejos se formaron durante 5 minutos antes de aplicar 5 µl de la mezcla del complejo a 50.000 células / pocillo en una placa de 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se tiñeron para la actividad de β-galactosidasa usando X-gal. Datos cortesía de Fugent, LLC.

Figura 7. Microscopía de fluorescencia de células transfectadas con reactivo de transfección ViaFect & trade. Se transfectaron células de tejido humano iCell & reg en placas de 96 pocillos con reactivo de transfección ViaFect & trade y un plásmido indicador de GFP en la relación reactivo: ADN especificada y se obtuvieron imágenes de la expresión de GFP después de la transfección. Panel A. Hepatocitos iCell & reg con una relación de reactivo: ADN de 6: 1 obtenida un día después de la transfección. Panel B. Cardiomiocitos iCell & reg con una relación reactivo: ADN de 2: 1 obtenida un día después de la transfección. Panel C. iCell & reg DopaNeurons con una relación reactivo: ADN de 4: 1 obtenida en imágenes tres días después de la transfección. Datos cortesía de Cellular Dynamics International.

Ensayos en tiempo real

Para algunos tipos de experimentos de transfección, especialmente aquellos que examinan los cambios en los niveles de expresión génica asociados con los mecanismos patológicos, es deseable monitorizar la actividad informadora en las células vivas. Estos ensayos en tiempo real pueden proporcionar información valiosa sobre la expresión de múltiples genes de forma dinámica. Las opciones de detección de células vivas Nano-Glo & reg (Cat. # N2011) están diseñadas para detectar la luminiscencia NanoLuc & reg de células vivas utilizando protocolos no líticos. Estos ensayos controlan la luminiscencia en un solo momento o de forma continua durante hasta 72 horas sin comprometer la viabilidad celular.


Configurar el experimento

Al día siguiente comencé a aprender más sobre GFP, principalmente llamando a la gente. Un hecho alentador fue que GFP no necesitaba nada agregado para ser fluorescente. es decir, para absorber luz azul y emitir luz verde. Lo que realmente esperaba descubrir en todas mis llamadas telefónicas era una persona que estaba trabajando para obtener la región del ADN de la medusa que contenía el gen que codifica la GFP. Necesitábamos el ADN de GFP para poder transferirlo y expresarlo en C. elegans. Afortunadamente, encontré a alguien trabajando para identificar el gen GFP, Douglas Prasher, investigador del Instituto Oceanográfico Woods Hole. Cuando me comuniqué con Douglas por teléfono, descubrí que tenía ideas muy similares sobre el uso de GFP y, al final de nuestra conversación de una hora, decidimos colaborar.

Douglas dijo que llamaría cuando hubiera tenido éxito en el primer paso: aislar el ADN de la medusa para la GFP. Pero en ese momento, este paso no fue fácil. Si desea saber más sobre cómo hizo esto, consulte “Profundizar 1: clonación del ADN de medusas. "

Desafortunadamente, nunca recibí la llamada de Douglas de que había logrado clonar GFP (más tarde supe que me llamó cuando estaba en un año sabático). Posteriormente supe que, como Doug no podía ponerse en contacto conmigo, pensó que yo había dejado la ciencia.

En septiembre de 1992, los nuevos estudiantes de posgrado se unieron al departamento y uno de ellos, Ghia Euskirchen, preguntó si podía rotar en mi laboratorio (muchos estudiantes de posgrado hacen proyectos a corto plazo llamados "rotaciones" para probar varios laboratorios antes de decidir dónde hacer su investigación de posgrado). Estaba muy feliz de que rotara en mi laboratorio, porque ya había obtenido una maestría en ingeniería química en Columbia trabajando en fluorescencia. Le conté a Ghia mi idea de usar una proteína fluorescente como marcador biológico. Pero después de esperar 3 años por la llamada de Douglas, había perdido la esperanza sobre sus experimentos. Así que sugerí que deberíamos buscar algo más que GFP. Luego buscamos el término "proteína fluorescente" en Medline (un motor de búsqueda inicial creado por los Institutos Nacionales de Salud) y vimos qué otras proteínas fluorescentes existían. Columbia acababa de conectar las computadoras de la Universidad a Medline, otro momento afortunado. El primer artículo que apareció en nuestra búsqueda fue el artículo de Douglas de principios de ese año que describe el aislamiento del ADN de GFP. Corrimos hasta la biblioteca para buscar el papel. Luego, otro golpe de suerte: aunque Douglas había dejado el Instituto Oceanográfico Woods Hole, el periódico tenía su nuevo número de teléfono (los artículos científicos no suelen incluir los números de teléfono de los autores). Inmediatamente llamé a Douglas y renové nuestra colaboración. Nos envió el clon de ADN unos días después.

Con el ADN de GFP de medusa en la mano, el proyecto de Ghia fue, en cierto sentido, muy sencillo: introducir el ADN de GFP de medusa en bacterias (E. coli), expresar la proteína y ver si las bacterias emiten luz verde cuando son estimuladas por luz azul.

La mayoría de las personas que trabajaban en GFP en ese momento creían que este experimento nunca funcionaría porque GFP es una proteína muy inusual. La mayoría de las proteínas son cadenas lineales de aminoácidos. La GFP también comienza con la columna vertebral del péptido lineal habitual (la línea que se muestra en la Figura 3), pero luego se somete a una reordenación química para formar un bucle (un anillo químico) en una sección de la columna vertebral lineal (Figura 3). Este anillo químico es fundamental para que la proteína sea fluorescente. Cuando hicimos nuestros experimentos, nadie sabía cómo se hacía este bucle. La gente imaginaba que había una enzima específica de medusa que producía el bucle. Por lo tanto, si esta enzima no estuviera presente en las bacterias (como cabría esperar), la GFP no debería ser fluorescente. Como resultado, nuestro experimento se consideraría una tontería, las bacterias no deberían brillar en verde. Sin embargo, no nos disuadimos y decidimos intentar el experimento de todos modos.

Figura 3 La química que hace que GFP sea fluorescente. Las proteínas se componen de una columna vertebral lineal (trazada con la flecha) de aminoácidos conectados con cadenas laterales (numeradas) que se ramifican fuera de la columna vertebral. GFP sufre una reacción química inusual que crea un bucle (un anillo químico) en la columna vertebral. Este nuevo anillo químico es lo que permite a la GFP emitir fluorescencia (absorber luz azul y emitir luz verde).

Hubo un detalle experimental adicional, que resultó ser muy importante y afortunado para nosotros. El clon de GFP de Douglas tenía la secuencia de codificación completa para GFP, pero también tenía ADN de medusa adicional en cada lado. Este ADN adyacente no codificaba aminoácidos y no sabíamos nada sobre su función. Estaba receloso de este ADN adicional y no quería incluirlo en nuestro experimento y le sugerí a Ghia que lo dejáramos fuera y que usáramos el ADN que codifica para GFP. Podríamos copiar solo la secuencia de codificación de GFP utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (o comúnmente conocida como PCR), una técnica que amplifica una pieza precisa de ADN. Vea el Video 2 para obtener una explicación de cómo funciona la PCR.

El único problema con la PCR en esta etapa de su desarrollo es que era algo propenso a errores (es decir, copiar el ADN mediante PCR podría introducir mutaciones (Figura 4). Por lo tanto, los investigadores que querían copias precisas del ADN de GFP habrían dejado la medusa ADN solo y usó el fragmento de ADN completo obtenido por Douglas para expresar la GFP. Por el contrario, razoné que si algunos de los productos de ADN de PCR tuvieran mutaciones, esto no sería un problema. Ciertamente, parte del ADN habría sido copiado con precisión por PCR, y esas bacterias serían fáciles de detectar porque brillarían en verde.Como leerá más adelante, esta decisión estratégica aparentemente trivial nos permitió tener éxito, mientras que otros laboratorios fracasaron en el mismo esfuerzo utilizando el clon de ADN original de Douglas.

Figura 4 Uso de PCR para amplificar el gen GFP. El clon de GFP original contenía el gen GFP, así como ADN de medusa adicional a ambos lados de la función desconocida. Amplificación habilitada por PCR de solo el gen GFP. Sin embargo, la PCR puede introducir mutaciones que potencialmente podrían dar lugar a una GFP no funcional. Sin embargo, no todo el ADN de GFP tenía que ser GFP funcional. Si hubiera algo sin mutar, las bacterias con el ADN normal permitirían que las bacterias brillaran en verde.

Ahora le pasaré la narración a Ghia, quien puede decirte lo que hizo.


Enzima restrictiva

Una enzima de restricción, endonucleasa de restricción o restrictasa es una enzima que escinde el ADN en fragmentos en o cerca de ...

Dado que los RE cortan en secuencias específicas, puede ver cómo APE es útil para nosotros. APE viene con una biblioteca de enzimas de restricción y la secuencia que reconocen y cortan. Entonces, cuando importa un nuevo plásmido a APE, puede determinar rápida y fácilmente qué RE cortará su plásmido y dónde.

Mantenemos un stock de enzimas RE y se pueden comprar en empresas como New England Biolabs:

El sitio web de NEB es útil ya que tiene muchas herramientas en línea gratuitas para averiguar qué enzimas se pueden usar, qué tampones y otras condiciones de reacción son necesarias, etc. NEB vende mucho más que los RE, pero así es como comenzaron.

Otras empresas que también venden ER incluyen las siguientes:


ADNc y análisis de genes

Los vectores plasmídicos están limitados en el tamaño del ADN clonado que puede incorporarse y reintroducirse con éxito en la bacteria, por lo general con un máximo de aproximadamente 15 kb (kilobases [1 kb equivale a 1000 bases]) de ADN extraño. Un uso común de los vectores plasmídicos es la creación de bibliotecas de ADNc (ADN complementario) Las moléculas de ADNc son copias de ADN de moléculas de ácido ribonucleico mensajero (ARNm), producidas in vitro por acción de la enzima la transcriptasa inversa . Debido a que los ADNc representan solo las porciones de genes eucariotas que se transcriben en el ARNm, los clones de ADNc son particularmente útiles para el análisis de la expresion genica y especialización celular. La existencia de un ADNc también es una prueba de que el gen está activo o se transcribe en las células o tejidos de los que se aisló el ARNm. Esta información se puede utilizar para comparar las actividades génicas en células sanas frente a células enfermas, por ejemplo.

Con frecuencia, la secuencia más simple de un ADNc es más fácil de analizar que la secuencia genómica correspondiente, ya que no contendrá secuencias no codificantes o intermedias (intrones). Otra ventaja del cDNA es que generalmente la secuencia no incluye potenciadores o secuencias reguladoras para dirigir su transcripción. Como resultado, se pueden combinar con otros sistemas reguladores en el clon para dirigir su expresión.

Los proyectos de secuenciación del genoma suelen generar información de secuencia a partir de muchos clones de ADNc diferentes. La secuencia clonada de ADNc se denomina & # x0022 etiqueta de secuencia expresada & # x0022 (EST) y, cuando se correlaciona con la secuencia de ADN genómico completa, la información de EST puede ayudar a determinar las ubicaciones y tamaños de los genes.

Para obtener el ADNc de un gen específico, primero es necesario construir una biblioteca de ADNc. Se trata de una colección de bacterias que contienen todos los ADNc de la célula o el tipo de tejido de interés. Para hacer una biblioteca, los miles de ARNm diferentes se recolectan primero de la célula de interés y el ADNc se elabora utilizando transcriptasa inversa. Luego, el ADNc se clona en plásmidos y se introduce en bacterias. En las condiciones adecuadas, cada bacteria absorberá solo un ADNc. A continuación, las bacterias se cultivan en placas de Petri en un medio sólido. Por tanto, una biblioteca consta de una población mixta de bacterias, cada una de las cuales lleva un tipo de ADNc. Para encontrar la bacteria que contiene un tipo particular de ADNc, se puede buscar el gen mismo con una sonda de nucleótidos o su producto proteico con un anticuerpo .

El cribado de una biblioteca depende de tener una sonda que lleve parte de la secuencia de nucleótidos o un anticuerpo u otra forma de reconocer la proteína codificada por el gen. El cribado mediante sondas de nucleótidos (marcadas con etiquetas radiactivas o químicas para su detección) depende de Base par complementariedad entre el ADN diana monocatenario y el ADN sonda, esto permite que el marcador marque la célula con el ADNc deseado. El cribado mediante el anticuerpo marcado depende de la unión del anticuerpo a la proteína codificada por el gen. De esta forma se han aislado literalmente miles de genes clonados a partir de bibliotecas de muchas especies diferentes. Una de las observaciones más poderosas en biología es que se pueden aislar secuencias de genes iguales o similares de diferentes especies, desde bacterias hasta humanos.

La insulina humana fue el primer medicamento creado mediante tecnología de ADN recombinante. La insulina es una proteína hormona producido por el páncreas que es vital para la regulación del azúcar en sangre. En la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), el sistema inmunológico ataca y destruye las células productoras de insulina. Una persona con IDDM requiere inyecciones diarias de insulina para controlar el azúcar en sangre. Antes de 1980, la insulina se aisló de cerdos u otros animales. La insulina animal tiene un efecto ligeramente diferente aminoácidos secuencia de la forma humana. A principios de la década de 1980, se utilizó tecnología de ADN recombinante para empalmar el gen de la insulina humana en bacterias, que se cultivaron en cubas para producir grandes cantidades de proteína humana. La insulina humana recombinante fue el primer fármaco recombinante aprobado para uso humano. Desde entonces, se han creado más de dos docenas de otros medicamentos de esta manera, incluida la hormona del crecimiento, los factores de coagulación de la sangre y el activador del plasminógeno tisular, que se utilizan para disolver los coágulos de sangre después de un accidente cerebrovascular. Las similitudes en la secuencia de genes indican que todos los organismos vivos descienden de ancestros comunes compartidos, desde el comienzo de la vida.


Transcriptasa inversa NZY (MB124)

Descripción: La transcriptasa inversa NZY es una forma recombinante modificada de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV) purificada de Escherichia coli. La enzima se ha modificado para promover la estabilidad. La transcriptasa inversa NZY sintetiza la hebra de ADN complementaria en presencia de un cebador utilizando ARN (síntesis de ADNc) o ADN monocatenario como plantilla en un amplio rango de temperaturas (37-50 ° C). Esto es útil cuando se utilizan plantillas con alto contenido de GC o con un alto grado de estructura secundaria. La enzima carece de actividad exonucleasa 3´ → 5´ y no tiene actividad RNasa H, lo que permite una síntesis mejorada de cDNA de longitud completa incluso para mRNA largos, utilizando cebado aleatorio.

Características:
& # 8211 Sintetiza cDNA a partir de RNA o ssDNA en solo 30 min
& # 8211 Altos rendimientos de cDNA de primera hebra
& # 8211 Sin actividad intrínseca de RNasa H
& # 8211 termoestable & # 8211 rango de temperatura de trabajo 37-50 ºC

Aplicaciones:
& # 8211 Síntesis de ADNc de primera cadena para RT-PCR y RT-qPCR
& # 8211 Transcripción inversa a temperaturas elevadas (ideal para plantillas con alto contenido de GC)
& # 8211 Síntesis de ADNc para clonación y expresión
& # 8211 Análisis de ARN por extensión de cebadores

Alta sensibilidad de la transcriptasa inversa NZY:
La alta sensibilidad de la transcriptasa inversa NZY se demuestra utilizando cantidades decrecientes de ARN total aislado de hígado de ratón (1 μg - 10 pg) como material de partida en una reacción de síntesis de ADNc de primera hebra de 20 μL con 200 unidades de la enzima.

Después de la transcripción inversa, se utilizó 1 μL del ADNc resultante como plantilla para amplificar el gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en una reacción de PCR de punto final de 25 μL con ADN polimerasa Suprema NZYTaq II. NC: Sin control de plantilla. Carril M: Escalera NZYDNA III

Especificaciones:

Longitud del producto: hasta 7 kb
Sensibilidad: elevado
Temperatura de reacción óptima: 50 ºC
Disponible como kits: Kit de síntesis de ADNc de primera hebra NZY (MB125) Kit de síntesis de ADNc de primera hebra NZY, oligos separados (MB170)
Velocidad: 30 minutos
Condiciones desnaturalizantes: La transcriptasa inversa NZY se inhibe en presencia de quelantes de metales (por ejemplo, EDTA), fosfato inorgánico, pirofosfato y poliaminas. La enzima se inactiva a 85 ° C durante 5 min.
Formato Lyo disponible: Transcriptasa inversa Lyo NZY (MB409)
Condiciones de almacenaje: Conservar a -20 ºC
Condiciones de envío: Enviado con hielo seco

Componentes:
& # 8211 NZY Transcriptasa inversa (200 U / μL)
& # 8211 Tampón de reacción (10x)

Transcriptasas inversas NZYTech: Guía de selección

NZY Reverse Transcriptase vs la competencia. Una dilución en serie de 10 veces del ARN total de hígado de ratón (1 μg a 1 ng) se transcribió de forma inversa utilizando 200 unidades de NZY Reverse Transcriptase o una popular transcriptasa inversa. El ADNc resultante se usó luego como molde en una PCR usando cebadores específicos para la amplificación del gen GAPDH de ratón con ADN polimerasa Suprema NZYTaq II. NC: Sin control de plantilla. Carril M: NZYDNA Ladder III.

1. ¿Qué cebadores se utilizan para la transcripción inversa?
Hay tres enfoques diferentes para cebar reacciones de ADNc: cebadores oligo (dT), cebadores aleatorios o cebadores específicos de secuencia. These primers differently bind to the template RNA strand, by providing a starting point for the cDNA synthesis, and each one has advantages and disadvantages. The choice between these three priming methods will depend on the size and type of RNA, on the reverse transcription temperature, or on the intended downstream applications.

An overview of different priming methods for reverse transcription

Oligo(dT) primers specifically bind to the poly(A)-tail found at the 3´-end of most eukaryotic mRNAs. The capacity to generate many different cDNAs from the same starting RNA pool, makes these primers the preferred choice for two-step RT-PCR reactions. Different types of oligo(dT)s are available. Oligo (dT)18 primer mix, a homogenous mixture of 18-mer thymidines, is available at NZYTech for the synthesis of full-length cDNA from poly(A)-tailed mRNA. In contrast to the standard oligo (dT), which randomly bind within the poly(A) tail of the eukaryotic mRNA, the anchored oligo(dT) primers bind at the beginning of the tail. This avoids an unnecessary reverse transcription of this often long region as well as erroneous products synthesized by mispriming.

Random hexamers are preferred for long transcripts or if they contain significant secondary structures. In addition, random hexamers are used for non-polyadenylated target templates (as prokaryotic mRNA). They will perform random priming throughout the entire length of the RNA to generate a cDNA pool containing various lengths of cDNA. With this method, all RNAs present in a population constitute templates for cDNA synthesis experiment. NZYTech provides a Random hexamer mix that includes oligonucleotides representing all possible hexamer sequences.

A mixture of both oligo(dT) and random hexamer primers is usually used to improve the efficiency of cDNA synthesis and qPCR sensitivity.

Gene-specific primers (GSPs) enhance sensitivity by allowing the reverse transcription of a specific RNA sequence. This priming method is chosen to perform one-step RT-PCR reactions once the same primer is used in both the RT and PCR steps. However, GSPs offer less flexibility than oligo(dT) and random primers, since each cDNA synthesis is limited to one target gene.

2. Is the NZYReverse Transcriptase RNase H minus?
The enzyme has no intrinsic RNase H activity.

3. The reaction buffer in my NZYReverse Transcriptase has precipitated. Can I still use?
The NZYReverse Transcriptase 10x Reaction Buffer can on occasions form a white precipitate after repeated freeze/thaws. If this happens, mix thoroughly to resuspend the precipitate. If you verify non-conformity of results, then the buffer needs to be replaced.

4. Should I treat the synthesized cDNA with RNase H before PCR?
Addition of RNase H after first-strand synthesis will degrade the RNA used as template, by removing it from the cDNA:RNA hybrid molecule. The RNA is still present when using RNase H – versions of reverse transcriptase, as is the case of the NZYReverse Transcriptase. Presence of RNA during PCR could inhibit annealing of the primers to the cDNA and then affect the amplification reaction, especially for long fragments. However, the 95°C denaturing step could cause RNA degradation of the RNA-cDNA hybrids and therefore RNase H treatment may not be necessary. We recommend performing RNase H digestion before PCR when using lower levels of template or when amplifying long fragments.

5. How much synthesized cDNA should be used in a PCR reaction?
Do not exceed 10% of the final PCR reaction volume. The volume of cDNA used will depend on the amount of RNA used as template for first-strand synthesis, as well as the abundance of the target gene.

6. Little or no RT-PCR/RT-qPCR amplification product is observed. ¿Qué tengo que hacer?
This may result from several factors, such as:
a) RNA damage or degradation. Analyze RNA by denaturing gel electrophoresis to verify nucleic acid integrity. Use aseptic conditions while working with RNA to prevent RNase contamination. Ensure the use of NZY Ribonuclease Inhibitor: addition of this inhibitor is essential when using less than 50 ng of RNA in order to safeguard the template against degradation due to ribonuclease contamination. Replace RNA if necessary.
B) Presence of RT inhibitors. Some inhibitors of RT enzymes include: SDS, EDTA, glycerol, sodium phosphate, spermidine, formamide and guanidine salts. They can be problematic if present in smaller reaction volumes. If necessary, remove inhibitors by ethanol precipitation of the RNA preparation before use wash the pellet with 70% (v/v) ethanol.
c) Not enough starting RNA. Increase the concentration of starting RNA.


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