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¿Se usa tejido teñido con hematoxilina / eosina para calificar el cáncer?

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Soy un estudiante de ingeniería que trabaja por primera vez en el campo del cáncer de mama. Estoy tratando de aprender a calificar el cáncer de mama (por ejemplo, el puntaje de Allred). Me he encontrado con 2 tipos de imágenes:

Primero (sea A):

Segundo (sea B):

Las imágenes son del sitio de VitroVivo.

Mi confusión: Para la puntuación del cáncer de mama, ¿se utiliza la imagen A?

Lo que creo que entiendo: En la puntuación de cáncer (en mama), estamos tratando de encontrar una puntuación. Por ejemplo, en la imagen B tenemos núcleos inmunopositivos (marrón) y núcleos inmunonegativos (azul) y la proporción de marrón a total es un indicador. Este núcleo marrón puede ser Ki67, HER2, estrógeno, progesterona proteína / antígeno. Pero en las imágenes teñidas con H&E, los núcleos están separados del citoplasma. No hay núcleos positivos / negativos, solo un tipo de núcleo. Entonces, ¿hay alguna forma en que los tejidos teñidos con H&E se usen para puntuar?


Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica

Contratinciones para inmunotinción enzimática / cromógena

Hematoxilina es posiblemente la contratinción nuclear más común utilizada cuando se emplea un sistema de detección de enzimas / cromógenos. Existen varias formulaciones disponibles, clasificadas según el tipo de mordiente utilizado y si son progresivas o regresivas. Todos ellos, en última instancia, dan a los núcleos celulares una agradable coloración azul de matiz e intensidad variables, según el tipo de hematoxilina utilizada.

La hematoxilina sola (o más exactamente su producto de oxidación, hematina) es aniónica y, por lo tanto, no tiene mucha afinidad por el ADN. Los mordientes son sales de hierro, a saber, las de hierro, aluminio, tungsteno y plomo. Los mordientes se combinan con la hematina, lo que da como resultado un complejo colorante-mordiente con carga positiva, lo que le permite unirse a la cromatina aniónica. Las hematoxilinas de alumbre (mordadas con aluminio) se pueden utilizar de forma progresiva o regresiva. Con las hematoxilinas progresivas (como las de Mayer, Carazzi y Gill), el tejido o las células se incuban en hematoxilina hasta que se alcanza el grado deseado de tinción nuclear, antes de ser azulado. En comparación, en el caso de las hematoxilinas regresivas (como las de Harris), los tejidos o las células se incuban hasta que se alcanza cierto grado de sobretensión, antes de eliminar parte del exceso de hematoxilina mediante inmersión en una solución ácida, como alcohol ácido al 1%. Este proceso se conoce como diferenciación. Por lo tanto, las hematoxilinas progresivas son más convenientes de usar que las regresivas, debido a la ausencia de una etapa de diferenciación y la compatibilidad resultante con productos finales de enzima / sustrato solubles en alcohol, como los producidos por HRP y AEC.

Ya sea progresiva o regresiva, una vez que se alcanza el nivel deseado de tinción nuclear, las hematoxilinas se "azulan". A pH ácido, las hematoxilinas tiñen los núcleos de rojo. Sin embargo, una vez expuesta a un ambiente alcalino, la hematoxilina adquiere un agradable color azul. El agua corriente del grifo se usa comúnmente para este propósito ya que tiene suficiente alcalinidad, especialmente en áreas de agua "dura". En áreas de agua "blanda", se puede utilizar una solución alcalina adecuada para azul de hematoxilina, como amoniaco al 0,05% (v / v).

Otras contratinciones nucleares tintóreas de uso común son los núcleos de tinción verde claro, rojo rápido, azul de toluidina y azul de metileno, ya sea verde, rojo o azul, respectivamente.

Una consideración importante al utilizar una contratinción de tinte nuclear es no hacer que la tinción sea demasiado intensa si está demostrando un antígeno nuclear, ya que la contratinción puede enmascarar potencialmente la señal positiva del sistema de detección.


Tinción con hematoxilina y eosina de secciones de tejidos y células

Las tinciones de hematoxilina y eosina (H & ampE) se han utilizado durante al menos un siglo y todavía son esenciales para reconocer varios tipos de tejidos y los cambios morfológicos que forman la base del diagnóstico de cáncer contemporáneo. La tinción no se ha modificado durante muchos años porque funciona bien con una variedad de fijadores y muestra una amplia gama de características de la matriz citoplasmática, nuclear y extracelular. La hematoxilina tiene un color azul violeta intenso y tiñe los ácidos nucleicos mediante una reacción compleja que no se comprende del todo. La eosina es de color rosa y tiñe las proteínas de forma inespecífica. En un tejido típico, los núcleos se tiñen de azul, mientras que el citoplasma y la matriz extracelular tienen diversos grados de tinción rosa. Las células bien fijadas muestran un detalle intranuclear considerable. Los núcleos muestran diferentes patrones de condensación de heterocromatina (tinción con hematoxilina) específicos del tipo de célula y del tipo de cáncer que son muy importantes desde el punto de vista diagnóstico. Tinción de nucleolos con eosina. Si hay abundantes polirribosomas, el citoplasma tendrá un tono azul distintivo. La zona de Golgi puede identificarse tentativamente por la ausencia de tinción en una región próxima al núcleo. Por tanto, la tinción revela abundante información estructural, con implicaciones funcionales específicas. Una limitación de la tinción con hematoxilina es que es incompatible con la inmunofluorescencia. Sin embargo, es útil teñir una sección en parafina en serie de un tejido en el que se realizará la inmunofluorescencia. La hematoxilina, generalmente sin eosina, es útil como contratinción para muchos procedimientos inmunohistoquímicos o de hibridación que usan sustratos colorimétricos (como fosfatasa alcalina o peroxidasa). Este protocolo describe la tinción H & ampE de secciones de tejido y células.


Visión general

La tinción de secciones de tejidos con tintes químicos y biológicos se ha utilizado durante más de un siglo para visualizar varios tipos de tejidos y cambios morfológicos asociados con el diagnóstico de cáncer contemporáneo. Sin embargo, el procedimiento de tinción es laborioso, necesita técnicos capacitados, es costoso y, a menudo, resulta en la pérdida de muestras irremplazables y retrasa los diagnósticos. En colaboración con Brigham and Women's Hospital (Boston, MA), describimos un enfoque de "tinción computacional" para teñir digitalmente fotografías de biopsias de tejido no teñidas con tintes de hematoxilina y eosina (H & ampE) para diagnosticar el cáncer.

Nuestro método utiliza redes neuronales para teñir rápidamente fotografías de tejidos no teñidos, proporcionando a los médicos información oportuna sobre la anatomía y la estructura del tejido. También informamos sobre un algoritmo de "decoloración computacional" que puede eliminar tintes y manchas de fotografías de tejidos previamente teñidos, lo que permite la reutilización de muestras de pacientes.

Estos métodos y redes neuronales ayudan a los médicos y pacientes mediante nuevos procesos computacionales en el punto de atención, que pueden integrarse sin problemas en los flujos de trabajo clínicos en hospitales de todo el mundo.


Resultados y discusión

Efectividad de iHE

Establecimos un sistema de tinción simple pero efectivo (Fig. 1A). Los tejidos se sumergieron en una solución de tinte en un tubo de centrífuga, que se fijó en un recipiente de acero inoxidable. Se adhirió un transductor ultrasónico a la parte inferior de un recipiente de acero inoxidable y un radiador, que se utilizó para enfriar el transductor ultrasónico. El recipiente de acero inoxidable se llenó de agua para garantizar una mejor transmisión de ultrasonidos. La potencia eléctrica máxima del transductor ultrasónico fue de 60 vatios. Durante el proceso de tinción del tejido con hematoxilina o enjuague, ajustamos el voltaje de entrada de la fuente de alimentación ultrasónica y controlamos la densidad de potencia acústica en el recipiente de acero inoxidable a 1,2

1,5 W / cm 2. Durante la tinción de tejidos con eosina, la densidad de potencia acústica fue de 0,8

Generalmente, es difícil teñir el tejido intacto de manera uniforme (Fig. 1C). Aquí, utilizamos dos medios para mejorar el teñido: deslipidación de DCM y ultrasonido. DCM es un solvente que puede disolver los lípidos en la membrana celular fácilmente 5,11,15,31. Una comparación de la figura 1C-I con la figura 1C-III muestra que el cerebro tratado con deslipidación de DCM podría teñirse más profundamente, probablemente porque el cerebro se vuelve poroso y la difusión del colorante tiende a mejorar después de la deslipidación. Una comparación de la Fig. 1C-III con la Fig. 1C-IV muestra que el cerebro teñido con ultrasonido tenía una tinción más uniforme en un tiempo más corto. En la Fig. 1C-II, la imagen muestra que el tejido cerebral tratado con deslipidación de DCM y teñido bajo ultrasonido durante 6 h presentó tinción uniforme con hematoxilina. En otras palabras, la deslipidación y la ecografía fueron indispensables para la iHE, y ambas contribuyeron a los resultados de la tinción. Comparando la figura 1C-II con la figura 1C-III, también encontramos que el encefalocele del cerebro con ultrasonido y deslipidación era mayor que el del cerebro sin ultrasonido y deslipidación, posiblemente debido a la contracción del cerebro durante la deshidratación y deslipidación.

Otro efecto de los ultrasonidos fue el enjuague acelerado (Fig. 1B). Los cerebros de ratones adultos con deslipidación se tiñeron primero con hematoxilina durante 6 horas y luego se cortaron en la línea media. La mitad se enjuagó con ultrasonidos, mientras que la otra mitad se enjuagó sin ultrasonidos. La temperatura de aclarado fue de 50 ° C. Para obtener la absorbancia de la solución de enjuague por ultrasonidos y la solución de enjuague estática (control), transferimos la solución superior y medimos la absorbancia utilizando el espectrómetro Lambda 950 UV / VIS a una longitud de onda de 445 nm. Con el tiempo, la absorbancia de la solución de enjuague por ultrasonidos se volvió mucho más alta que la de la solución de enjuague estática. Por lo tanto, el cerebro bajo ultrasonido liberó más tintes que en el estado estático.

Comparación de iHE con la tinción tradicional de H & ampE

El ultrasonido puede provocar la alteración de los tejidos y las células, por lo que un problema no despreciable es si la estructura celular se destruye después de la iHE. Como se muestra en la Fig. 2, encontramos que la estructura celular se conservó sin una distorsión significativa en comparación con la tinción tradicional con H & ampE. Los efectos de tinción de iHE y la tinción tradicional de H & ampE son similares, lo que indica que iHE es un método factible. Las fibras nerviosas perisomáticas que se muestran en la Fig. 2D son menores que las de la Fig. 2A, probablemente porque la citomembrana se disolvió parcialmente después de la deslipidación. Para evaluar más a fondo el sacrificio de la estructura subcelular, comparamos 100 núcleos de neuronas de la corteza utilizando los métodos H & ampE e iHE, pero no encontramos diferencias significativas entre estos dos métodos (datos no mostrados).

Comparación de la tinción iHE y la tradicional H & ampE. (C.A), Imágenes de cortes de cerebro de ratón de 7 μm de grosor teñidos con el método tradicional H & ampE. (D – F), Imágenes de tejidos cerebrales de ratón intactos después de tinción iHE, corte e imagen 2D. La materia roja que aparece en (A

F) representa las células sanguíneas que no se eliminaron por completo durante la perfusión cardíaca. Lente objetivo, 20 × N.A., 0,75 distancia de trabajo, 1 mm. Barra de escala: 50 μm.

Cerebro de ratón intacto teñido con iHE

Se tiñó un cerebro de ratón C57BL / 6 intacto con iHE, y las imágenes de la Fig. 3 muestran que el cerebro se tiñó uniformemente. El hipocampo era distinguible y la morfología de los núcleos celulares era clara (Fig. 3D-F). Por lo tanto, podríamos adquirir información de tinción de H & ampE para un cerebro de ratón en función de su contexto espacial natural. Encefalocele del cerebro era evidente (Fig. 3C).

Rebanadas de un cerebro de ratón intacto teñido con iHE, seguido de imágenes en 2D. (A) Proyección 3D de 20 cortes en (B). (B) Los cortes del plano coronal del cerebro de ratón C57BL / 6 después de iHE. Lente objetivo, 4 × y 20 × N.A., 0,2 y 0,75. El cerebro se cortó en el plano coronal durante 8 μm, y seleccionamos un corte por cada 400 μm desde el bulbo olfatorio hasta el epencéfalo. (DF) Ampliación de (C).

Otros tejidos de ratón intactos teñidos con iHE

Para generar un modelo de metástasis hepática, inyectamos células de cáncer de mama 4T-1 en ratones BALB / c de 7 semanas de edad, criamos a los ratones durante 40 días y perfundimos los ratones a los 3 meses de edad. A continuación, se tiñó el hígado y se prepararon rodajas para la obtención de imágenes posteriores utilizando microscopía Nikon NIS-Elements; los resultados se muestran en la Fig. 4A-C. En la imagen, la línea punteada negra se usa para dividir el área del tumor y el área normal, y los resultados muestran que la proporción nuclear-citoplasmática del área del tumor era diferente a la del área normal. El pulmón, el riñón, el estómago, la pata delantera, el corazón y los globos oculares del ratón se tiñeron con iHE (Figuras 4D-G y S4A-H). El lóbulo pulmonar y los alvéolos, estructuras pulmonares clásicas, se pueden observar en la Fig. 4D, E. Los túbulos renales se presentan claramente en la Fig. 4F, G. El estómago del ratón se tiñó y las vellosidades del píloro se muestran en la Fig. 4G complementaria, H. La estructura clásica del músculo en la pata delantera del ratón se reveló después de iHE, y también se observó la microestructura de la piel (Fig. Suplementaria S4A, B). El corazón es un órgano compuesto por cardiomiocitos, y se observaron claramente los tipos de células de la cámara y del miocardio (Fig. Suplementaria S4C, D). También aplicamos iHE a los globos oculares de los ratones y se pudo observar la estratificación celular de la retina (Fig. Suplementaria S4E, F).

Imágenes de otros tejidos de ratón teñidos con iHE. (AC) Imágenes de hígado de ratón con tumor. (D,mi) iHE para pulmón de ratón. (F,GRAMO) iHE para riñón de ratón. Lente objetivo, 20 × N.A., 0,75 distancia de trabajo, 1 mm.

Compatibilidad de iHE con tinción de vasos sanguíneos

El crecimiento de células cancerosas se asocia con cambios significativos en los vasos sanguíneos 30. Como se discutió anteriormente, la tinción H & ampE es un medio clásico para presentar los detalles de un tumor. Aquí, combinamos la tinción de H & ampE con la tinción de los vasos sanguíneos (Fig. 5) para observar la información de los vasos sanguíneos y los núcleos celulares simultáneamente. Este método de doble tinción tiene el potencial de proporcionar información significativa sobre el estado del tumor.

Cerebro de ratón perfundido con tinta de carbón antes de iHE. (A,B) Hipocampo, (B) es la ampliación del cuadro en (A). (C,D) Thalami, (D) es la ampliación del cuadro en (C). Lente objetivo, 20 × N.A., 0,75 distancia de trabajo, 1 mm.

El principio de iHE se muestra en la Fig. 6. Después de la deslipidación de DCM, la citomembrana se disuelve parcialmente y el tejido se vuelve poroso 25. Suponemos que el ultrasonido causa una cavitación estable (densidad de energía del ultrasonido & lt10 Watt / cm 2). Los poros del tejido pueden cambiar su diámetro en el campo ultrasónico porque el ultrasonido es una onda longitudinal. Similar a un resorte que se estira y comprime debido a una fuerza externa, el tejido se estira y comprime a nivel de microescala. Así, los poros en la cresta de la onda del ultrasonido se estiran, mientras que los poros en el valle de las ondas se comprimen 26,32,33. Mientras tanto, con la onda ultrasónica, hay una compresión y enrarecimiento periódicas en el líquido. Por tanto, se facilita la transferencia de masa dentro y fuera del tejido 34. Por lo tanto, la difusión impulsada por la diferencia de concentración en las partículas se acelera en el campo ultrasónico y los tintes se difunden en el tejido más rápidamente.

Posible principio de iHE. Se utiliza un tejido fijo como tejido original. Después de la deshidratación, el tejido se somete a deslipidación, seguido del procedimiento de tinción H & ampE; el proceso de tinción H & ampE se simplificó para que el lector pudiera comprender mejor el principio de cómo el ultrasonido está involucrado en el proceso. El diclorometano puede causar un estado poroso de la membrana celular, igual al estado poroso del tejido. Los poros del tejido cambian en el campo ultrasónico porque el ultrasonido es una onda longitudinal. Así, los poros en la cresta de la onda del ultrasonido se estiran, mientras que los poros en el valle de las ondas se comprimen. Mientras tanto, el movimiento aleatorio de las partículas se mejora en el campo ultrasónico. El proceso de difusión se mejora y logra una tinción rápida y uniforme.

En general, el método iHE crea tejido poroso para teñir y mejora el movimiento aleatorio. Por lo tanto, el proceso de difusión se mejora y logra una tinción H & ampE rápida y uniforme. Establecimos un conjunto de métodos (iHE) para obtener información de tinción H & ampE de tejido intacto para imágenes de volumen. Se utilizó ultrasonido para facilitar la tinción de tejido de montaje completo y se evaluó cuantitativamente su capacidad para mejorar el enjuague. Como resultado, este método puede clasificar la etapa de invasión del tumor en función de su límite 3D natural y dilucidar mejor la metástasis tumoral a gran escala basándose en un modelo de ratón. iHE también era compatible con la tinción de los vasos sanguíneos, lo que implica que podríamos obtener la tinción de H & ampE y la información de los vasos sanguíneos para un solo tejido simultáneamente. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una nueva herramienta para estudiar la infiltración y la metástasis tumoral en un modelo de ratón. Además, el ultrasonido se muestra prometedor para facilitar otros tipos de procesamiento biológico de tejidos, como el aclarado óptico, el inmunomarcaje y la tinción química de tejidos intactos.


3 RESULTADOS

3.1 Wndchrm-análisis basado en la morfología en tejidos de cáncer gástrico y no cancerosos

Para evaluar cuantitativamente la morfología biológica de las condiciones de las células y los tejidos, realizamos un análisis de aprendizaje automático utilizando el wndchrm algoritmo y medidas de imagen específicas (Figura 1A). Se construyeron conjuntos de datos de imágenes de acuerdo con el diagnóstico patológico, utilizando microarrays de tejido derivados de pacientes con adenocarcinoma de estómago humano. Se recolectaron cincuenta y cuatro imágenes de tejido teñidas con H & E de 1360 × 1024 píxeles para cada clase: No canceroso, Grado 1 (bien diferenciado), Grado 2 (moderadamente diferenciado) y Grado 3 (poco diferenciado) (Figura 1B, Figura S1A y Tabla S1). Brevemente, wndchrm extrajo características de imagen de todas las imágenes de cada clase definida y entrenó a un clasificador para discriminar entre las clases usando conjuntos de datos de entrenamiento. Luego, el rendimiento de la clasificación se validó con imágenes de prueba que se seleccionaron al azar, donde estos pasos se realizaron automáticamente. Realizamos 20 análisis de validación cruzada entre los no cancerosos y los grados 1-3 de cáncer gástrico (Figura 1A, izquierda). Como paso inicial del análisis, examinamos el número óptimo de imágenes necesarias para una clasificación eficiente. Los resultados mostraron que el valor de la precisión de clasificación (CA) mejoró con un número creciente de imágenes de entrenamiento (Figura S1B), mientras que el de los errores estándar se redujo como se ve a menudo en los análisis de aprendizaje automático. 31 La mejor clasificación se encontró con 54 imágenes de entrenamiento en CA 0,78 (el CA máximo es posiblemente 1,0), y este valor de CA fue marcadamente más alto que la clasificación aleatoria en CA 0,25. Además, las similitudes relativas entre las clases se visualizaron con dendrogramas (Figura 1C). Además, utilizando 20 imágenes en cada clase, confirmamos la similitud de clasificación entre gastritis crónica, no cancerosa y grados 1-3 (Figura S1C). El rendimiento de la prueba de clasificación fue suficiente, ya que su especificidad y sensibilidad para discriminar los grados de cáncer de los tejidos no cancerosos fue del 100% y del 92%, respectivamente (Tabla S2, superior). Para una evaluación adicional de las características morfológicas, dividimos cada clase en dos subclases y medimos el grado de disimilitudes de los grados 1-3 de los tejidos no cancerosos, como lo indica la distancia morfológica (DM) (Figura 1D). El MD de Non-cancer_1 mostró similitud con Noncancer l_2 y disimilitud con los tejidos cancerosos de tres grados. Además, cuando las imágenes se colocaron en mosaico digital (ver Métodos), el número de imágenes de entrenamiento aumentó, pero se perdió la visión general de los tejidos. Sin embargo, los valores de CA se mantuvieron prácticamente sin cambios en 0,79-0,69 utilizando estas imágenes en mosaico (Figura S1D), lo que sugiere que la morfología local, así como la descripción histológica, son indicadores para discriminar entre tejidos no cancerosos y cancerosos.

Luego, realizamos comparaciones binarias detalladas entre muestras no cancerosas y cada grado de cáncer gástrico para evaluar la efectividad de wndchrm utilizando cada una de las 54 imágenes que mostraron suficientes valores de CA (Figura S1E). Los análisis de la curva ROC verificaron la precisión de las clasificaciones, porque los AUC fueron 0,99, 0,98 y 0,99 para No cancerosos frente a los Grados 1, 2 y 3, respectivamente (el AUC máximo es 1,0, en contraste con la asignación aleatoria de 0,5) (Figura 1E). Se indicaron listas representativas de características de imagen informativas en cada prueba de clasificación de acuerdo con las puntuaciones relativas de discriminación de Fisher (Figura 1F). Se usaban comúnmente muchos conjuntos de características de imagen para discriminar los grados 1, 2 y 3 de los no cancerosos (r & gt 0,7), aunque también estaban involucradas algunas características distintas (datos no mostrados). Nuestros resultados mostraron que wndchrm Los análisis recapitularon en gran medida los exámenes patológicos basados ​​en humanos de las imágenes de H&E de los tejidos cancerosos.

3.2 WndchrmEl análisis basado en datos revela características informativas de imágenes teñidas con H & E

Para comprender qué características morfológicas contribuyen a la clasificación de grados no cancerosos y cancerosos, deconvolucionamos digitalmente las imágenes H&E RGB (rojo, verde, azul) en canales de hematoxilina y eosina en escalas de grises (Figura 2A). 30 Los núcleos celulares y los componentes citoplasmáticos generalmente se tiñen con hematoxilina y eosina, respectivamente. 4, 10 Usando las imágenes deconvolucionadas para los grados no cancerosos y 1-3, como se muestra en la Figura 2B y la Figura S2, medimos CA entre los grados no cancerosos y 1-3 (Figura 2C). Las pruebas de validación cruzada de imágenes de hematoxilina y eosina indicaron valores de CA equivalentes (0,72 y 0,69, respectivamente). La sensibilidad y la especificidad fueron igualmente altas en 82% -98% (Tabla S2, segundo desde arriba), lo que sugiere que las imágenes de hematoxilina y eosina contienen características morfológicas que distinguen entre tejidos cancerosos y no cancerosos.

Se creó una lista típica de características de imagen informativas en la prueba de clasificación de acuerdo con las puntuaciones relativas de discriminación de Fisher, y mostró similitudes generales (Figura 2D). El valor del coeficiente de correlación de Pearson fue débil entre las imágenes de hematoxilina y eosina (r = 0,55), lo que sugiere la presencia de características morfológicas únicas en cada imagen. De manera consistente, los MD de Non-cancer_1 en imágenes de hematoxilina y eosina mostraron diferencias entre los tejidos cancerosos y no cancerosos en un grado similar (Figura 2E, F). wndchrm Los análisis implicaron la presencia de características informativas en imágenes de tejidos cancerosos teñidas con hematoxilina y eosina.

3.3 Caracterización de la morfología nuclear en tejidos de cáncer gástrico

Nuestro análisis de clasificación de imágenes teñidas con hematoxilina indicó que las morfologías nucleares son distintas en cánceres no cancerosos y gástricos (grados 1-3), como se muestra por los valores de CA (Figura 2C). Para evaluar la morfología nuclear, medimos dos características del área del núcleo y la intensidad total (Figura 1A, Derecha). Usando un software de análisis de imágenes (Cellomics CellInsight), cada región de medición se detectó con un tamaño fijo de 1024 × 1024 píxeles a partir de imágenes de tejido originales (Figura 3A). Contando & gt12 000 núcleos, encontramos que el área nuclear era significativamente mayor en los tejidos cancerosos, en comparación con los tejidos no cancerosos (Figura 3B), y que la intensidad de la señal también era mayor en las células cancerosas (Figura 3C). Debido a que los núcleos estaban densamente distribuidos y, a veces, se superponían en los tejidos cancerosos, probablemente debido a las actividades de alto crecimiento, luego intentamos medir esta característica, utilizando el área nuclear que se tiñó continuamente con hematoxilina. Configuramos el software para reconocer el área positiva para hematoxilina que era mayor que el umbral definido (13 200 píxeles), como se muestra en la Figura 3D. El área con núcleos agrupados estuvo presente de manera prominente en los grados 1 y 2 de cánceres gástricos, pero escasamente en el grado 3 (Figura 3E, F). Las estadísticas resumidas para el área y la intensidad total se muestran en la Tabla S3, lo que indica que la morfología nuclear es un parámetro ventajoso para la clasificación del cáncer.

3.4 Los niveles de expresión de ATF7IP / MCAF1 nuclear están correlacionados con imágenes de H&E

Se ha informado de que varios factores nucleares 37, 38 y de membrana / factores solubles 39, 40 están implicados en la morfología de células y tejidos. A continuación, investigamos los vínculos biológicos entre la expresión molecular y las características morfológicas en los tejidos del cáncer gástrico, utilizando análisis basados ​​en marcadores moleculares o análisis basados ​​en hechos.

Para examinar cómo se pueden clasificar las imágenes de H&E en función de la expresión molecular, elegimos dos proteínas asociadas al cáncer: ATF7IP / MCAF1 nuclear y PD-L1 membranosa (Figuras 4 y 5). ATF7IP / MCAF1 es un factor epigenético implicado en la formación de heterocromatina y la regulación génica, que con frecuencia se sobreexpresa en varios tipos de tumores, incluidos los cánceres gástricos. ATF7IP / MCAF1 funciona para la represión génica basada en la metilación del ADN o la activación génica mediada por el factor de transcripción Sp1. 36 Por otro lado, PD-L1 generalmente es producido por células cancerosas para escapar de la vigilancia inmunológica y es un objetivo molecular para la terapia inmunológica del cáncer. 41-43 El informe anterior mostró que el PD-L1El promotor del gen está regulado por la metilación del ADN o la unión de Sp1 en las células cancerosas. 44, 45 Existe la posibilidad de que ATF7IP / MCAF1 pueda controlar PD-L1 expresión a través de Sp1, como indican los datos de ChIP-seq publicados sobre cáncer de colon (Figura S3A).

Realizamos tanto tinción H&E como IHC utilizando secciones seriadas de tejido (Tabla S4). Después de que los cortes de la sección se hicieron a partir de un bloque de parafina y se tiñeron, alineamos cuidadosamente las imágenes de H&E con IHC manualmente (Figura S3B-D). Seleccionamos 32 sitios de imágenes de H&E (cada uno de 1360 × 1024 píxeles) y las imágenes IHC correspondientes para la expresión de ATF7IP / MCAF1. El tejido de cáncer gástrico y las regiones no cancerosas adyacentes mostraron una expresión alta y baja de ATF7IP / MCAF1, respectivamente (Figura 4A, Figura S3E, F). Los niveles de señales de IHC se confirmaron mediante la cuantificación de sus señales (Figura 4B). Con base en los niveles de expresión de ATF7IP / MCAF1, luego clasificamos las imágenes de H&E usando wndchrm a una expresión baja y alta de esta proteína (CA 0,95-1,00, que muestra una alta precisión, independientemente de los números de imagen) (Figura S3G), lo que sugiere que los tejidos de cáncer gástrico como se prueban pueden dividirse claramente en estas dos clases. Además, la sensibilidad y la especificidad de las señales ATF7IP / MCAF1 fueron del 100% y el 98%, respectivamente (Tabla S2,segundo desde abajo). Para evaluar la CA entre las clases baja y alta de ATF7IP / MCAF1, organizamos subclases en imágenes H&E (Baja 1, Baja 2, Alta 1 y Alta 2). El Bajo 2 tuvo similitud con el Bajo 1, pero una diferencia significativa con el Alto 1 (Figura 4C). Además, la alineación de las puntuaciones relativas de Fisher indicó una correlación débil entre las dos comparaciones (Figura 4D, r = 0,44), lo que sugiere la presencia de diferencias de características. Además, cada MD de Low 1 en el espacio de características y el dendrograma mostró una disimilitud morfológica entre las clases bajas y altas de ATF7IP / MCAF1 (Figura 4E, F), lo que sugirió que los niveles de expresión de esta proteína se correlacionan con la morfología del tejido.

3.5 Los niveles de expresión de PD-L1 citoplásmico se correlacionan con imágenes de H&E

Además, investigamos si la expresión de la proteína membranosa PD-L1 en el cáncer está relacionada con la morfología del tejido. Realizamos de nuevo tinción H&E e IHC con anticuerpos anti-PD-L1, utilizando secciones seriadas de micromatrices de tejido en muestras de cáncer gástrico (Figura 5A y Tabla S5). Cuantificamos los niveles de señal de IHC de tinción de PD-L1, agrupados en baja y alta expresión de esta proteína, y además creamos conjuntos de datos de la imagen correspondiente de H&E (1360 × 1024 píxeles) (Figura 5B, Figura S4A, B). Además, evaluamos la puntuación de proporción tumoral (TPS) contando células teñidas positivamente en 100 células por imagen y encontramos que PD-L1 High mostró TPS significativamente más alto, mientras que PD-L1 Low tenía TPS muy bajo (Figura S4C). se clasificaron como PD-L1 bajo y alto, en CA 0,86 utilizando 60 imágenes (Figura S4D). La sensibilidad y la especificidad de las señales de PD-L1 fueron 88% y 84%, respectivamente (Tabla S2, más bajo). Confirmamos la disimilitud morfológica entre las subclases baja y alta de PD-L1 como lo muestra el CA (Figura 5C). Las puntuaciones discriminantes relativas de Fisher de características de imagen sugirieron la presencia de características responsables de la disimilitud (Figura 5D, r = 0.59). Cada MD de Low 1 en el espacio de características y el dendrograma mostró diferencias morfológicas entre las clases Low y High de PD-L1 (Figura 5E, F).

En conjunto, estos resultados indicaron que la expresión de ATF7IP / MCAF1 y PD-L1 se correlaciona con las características del tejido, lo que sugiere que la apariencia espacial de las proteínas asociadas al cáncer refleja la información morfológica de los tejidos patológicos.


Clasificación de imágenes microscópicas de histología del cáncer de mama teñidas con hematoxilina y eosina mediante el aprendizaje por transferencia con EfficientNets

El cáncer de mama es una enfermedad mortal y es una de las principales causas de muerte en mujeres en todo el mundo. El proceso de diagnóstico basado en el tejido de la biopsia no es trivial, requiere mucho tiempo y es propenso a errores humanos, y puede haber conflictos sobre el diagnóstico final debido a la variabilidad interobservador. Se han diseñado e implementado sistemas de diagnóstico asistido por computadora para combatir estos problemas. Estos sistemas contribuyen significativamente a aumentar la eficiencia y precisión y a reducir el costo del diagnóstico. Además, estos sistemas deben funcionar mejor para que su diagnóstico determinado sea más confiable. Esta investigación investiga la aplicación de la arquitectura EfficientNet para la clasificación de imágenes histológicas de cáncer de mama teñidas con hematoxilina y eosina proporcionadas por el conjunto de datos ICIAR2018. Específicamente, se ajustaron y evaluaron siete EfficientNets en función de su capacidad para clasificar imágenes en cuatro clases: carcinoma in situ normal, benigno, y carcinoma invasivo. Además, se observaron dos técnicas estándar de normalización de manchas, Reinhard y Macenko, para medir el impacto de la normalización de manchas en el rendimiento. El resultado de este enfoque revela que el modelo EfficientNet-B2 arrojó una precisión y sensibilidad del 98,33% utilizando el método de normalización de tinción de Reinhard en las imágenes de entrenamiento y una precisión y sensibilidad del 96,67% utilizando el método de normalización de tinción de Macenko. Estos resultados satisfactorios indican que la transferencia de características genéricas de imágenes naturales a imágenes médicas mediante el ajuste fino en EfficientNets puede lograr resultados satisfactorios.

1. Introducción y antecedentes

Una de las principales causas de muerte de las mujeres en todo el mundo es el cáncer de mama [1]. Se define como un grupo de enfermedades en las que las células del tejido de la mama se alteran y se dividen de manera descontrolada, lo que generalmente da como resultado bultos o crecimientos. Este tipo de cáncer a menudo comienza en las glándulas mamarias o en los conductos que conectan estas glándulas con el pezón. En las etapas iniciales de la enfermedad, el pequeño tumor que aparece es mucho más fácil de tratar de manera efectiva, evitando la progresión de la enfermedad y disminuyendo las tasas de morbilidad, por lo que el cribado es crucial para la detección precoz [2].

El proceso de diagnóstico del cáncer de mama comienza con la palpación, la mamografía periódica y la inspección por imágenes ultrasónicas. Los resultados de estos procedimientos indican si se requieren más pruebas. Si se sospecha cáncer en un paciente, se realiza una biopsia y se obtiene tejido para análisis microscópico, de modo que un patólogo pueda realizar un examen histológico del tejido extraído para confirmar el diagnóstico [2, 3]. Una vez que se completa la biopsia, el tejido se analiza en un laboratorio. El proceso de preparación del tejido debe comenzar con la fijación con formalina y, posteriormente, la inclusión en secciones de parafina. A continuación, los bloques de parafina se cortan en rodajas y se fijan en portaobjetos de vidrio. Desafortunadamente, estructuras interesantes como el citoplasma y los núcleos en el tejido aún no son evidentes en este momento. La falta de claridad en el tejido requiere la tinción del tejido para que las estructuras se vuelvan más visibles. Typically, a standard and well-known staining protocol, using hematoxylin and eosin, is applied. When added to the tissue, the hematoxylin can bind itself to deoxyribonucleic acid, which results in the nuclei in the tissue being dyed a blue/purple color. On the other hand, the eosin can bind itself to proteins, and, as a result, other relevant structures such as the stroma and cytoplasm are dyed a pink color. Traditionally, after staining, the glass slide is coverslipped and forwarded to a pathologist for examination [4]. Routinely, the expert gathers information on the texture, size, shape, organization, interactions, and spatial arrangements of the nuclei. Additionally, the variability within, density of, and overall structure of the tissue is analyzed. In particular, the information concerning the nuclei features is relevant for distinguishing between noncarcinoma and carcinoma cells. In contrast, the information concerning the tissue structure is relevant for distinguishing between en el lugar and invasive carcinoma cells [5].

The noncarcinoma class consists of normal tissue and benign lesions these tissues are nonmalignant and do not require immediate medical attention. En el lugar and invasive carcinoma, on the other hand, are malignant and become continuously more lethal without treatment. Específicamente, en el lugar carcinoma refers to the presence of atypical cells that are confined to the layer of tissue in the breast from which it stemmed. Invasive carcinoma refers to the presence of atypical cells that invades the surrounding normal tissue, beyond the glands or ducts from where the cells originated [2]. Invasive carcinoma is complicated to treat, as it poses a risk to the entire body [3]. This threat means that the odds of surviving this level of cancer decreases as the progression stages increase. Moreover, without proper and adequate treatment, a patient’s en el lugar carcinoma tissue can develop into invasive carcinoma tissue. Therefore, it is of paramount importance that biopsy tissue is examined correctly and efficiently so that a diagnosis can be confirmed and, subsequently, treatment can begin. Examples of histology images belonging to each of these classes are shown in Figure 1.

The task of performing a practical examination on the tissue is not simple and straightforward. On the contrary, it is rather time-consuming and, above all, prone to human error. The average diagnostic accuracy between professionals is around 75% [6]. These issues can result in severe and fatal consequences for patients who are incorrectly diagnosed [7].

The advancement of image acquisition devices that create whole slide images (WSI) from scanning conventional glass slides has promoted digital pathology [8]. The field of digital pathology focuses on bringing improvement in accuracy and efficiency to the pathology practice [9] by associating histopathological analysis with the study of WSI [8].

An excellent solution to address the limitations of human diagnosis is computer-aided diagnosis (CAD) systems, which are developed to automatically analyze the WSI and provide a potential diagnosis based on the image. These systems currently contribute to improving efficiency and reducing both the cost of diagnosis and interobserver variability [5, 10]. Even though current CAD systems that operate at high sensitivity provide relatively good performance, they will remain a second-opinion clinical procedure until the performance is significantly improved [10].

Recently, deep learning approaches to the development of CAD systems have produced promising results. Previous attempts to classify breast cancer histology images using a combination of handcrafted feature extraction methods and traditional machine learning algorithms required additional knowledge and were time-consuming to develop. Conversely, deep learning methods automate this process. These systems allow pathologists to focus on difficult diagnosis cases [11].

Hence, to ensure early diagnosis in breast cancer candidates, increase treatment success, and lower mortality rates, early detection is imperative. Although the advent of and advancements in computer-aided systems have benefited the medical field, there is plenty of room for improvement.

1.1. Research Problem

In general, the shortage of available medical experts [12], the time-consuming quest to reach a final decision on a diagnosis, and the issue of interobserver variability justify the need for a system that can automatically and accurately classify breast cancer histopathology images. Previous approaches to this problem have been relatively successful considering the available data and return adequate classification accuracies but tend to be computationally expensive. Thus, this work will explore the use of seven lightweight architectures within the EfficientNet family [13]. Since the EfficientNet models were designed to optimize available resources, while maintaining high accuracies, a CAD system that performs at the level of the current state-of-the-art deep learning approaches, while consuming less space and training time, is desirable. Transfer learning techniques have become a popular addition to deep learning solutions for classification tasks. In particular, many state-of-the-art approaches utilize fine-tuning to enhance performance [14]. Therefore, this research explores the application of seven pretrained EfficientNets for the classification of breast cancer histology images. Furthermore, the addition of stain normalization to the preprocessing step will be evaluated. Hence, the primary question that this research will answer is, “Can fine-tuned EfficientNets achieve similar results to current state-of-the-art approaches for the application of classifying breast cancer histology images?”

1.2. Research Contributions

In this research, the application of seven versions of EfficientNets with transfer learning for breast cancer histology image classification is investigated. The proposed architecture was able to effectively extract and learn the global features in an image, such as the tissue and nuclei organization. Of the seven models tested, the EfficientNet-B2 architecture produced superior results with an accuracy of 98.33% and sensitivity of 98.44%.

The key takeaway from this investigation is that the simple and straightforward approach to using EfficientNets for the classification of breast cancer histology images reduces training time while maintaining similar accuracies to previously proposed computationally expensive approaches.

1.3. Paper Structure

The remainder of the paper is structured as follows: Section 2, the literature review, provides details on previous successful approaches. Section 3, the methods and techniques, provides insight into the framework followed in this study. Section 4, the results, provides details of the results that were obtained during the research. Finally, section 5 elaborates on the insights of this work and concludes the paper.

2. Literature Review

Currently, computer-aided diagnosis (CAD) systems occupy the position of aiding physicians during the process of diagnosis, by easing their workload and reducing the disagreement that stems from the subjective interpretation of pathologists. However, the performance of these systems must be enhanced before they can be considered more dependable than a second-opinion system [10].

2.1. Traditional Approaches

In the traditional approach, expert domain knowledge is required so that the correct features may be handcrafted this is a time-consuming endeavor. Nevertheless, the approach yields acceptable results on the datasets used. For instance, Kowal [15] used multiple clustering algorithms to achieve nuclei segmentation on microscopic images. Segmentation made it possible to extract microscopic, textural, and topological features so that classifiers could be trained and images could be classified as either benign or malignant. The accuracy of patient-wise classification was in the range of 96–100%. It is worth noting that this method performs poorly when an image contains overlapping nuclei or a small number of nuclei. In this case, either the approach fails to identify the nuclei or the clustering algorithms could return unreliable results. Therefore, in order to attain an acceptable detection accuracy, a large number of sample images are required. Hence, it is evident that accurate nuclei segmentation is not a straightforward task this can also be attributed to the variability in tissue appearance or the presence of clustered or tightly clumped nuclei [5].

An alternative approach is utilizing information on tissue organization as in the work by Belsare et al. [16], which presents a framework to classify images into malignant and nonmalignant. Firstly, segmentation was done using spatio-color-texture graphs. After that, statistical feature analysis was employed, and classification was achieved with a linear discriminant classifier. The choice of this classifier considerably impacted the outcome of this approach, as the result outperformed the use of k-nearest-neighbor and state vector machine classifiers, especially for the detection of nonmalignant tissue. Accuracies of 100% and 80% were achieved for nonmalignant and malignant images, respectively.

2.2. Deep Learning Approaches

The increase in the availability of computing power has led to the emergence of advanced architectures called convolutional neural networks (CNNs). Contrary to the conventional approach, no expert domain knowledge is required to define algorithms for segmentation, feature extraction, and classification, but instead expert knowledge is needed to annotate the dataset for a CNN to achieve superior results. Instead, these networks can automatically determine and extract discriminative features in an image that contribute to the classification of the image. Generally, a CNN will use a training set of images to learn features that are unique to each class so that when a similar feature is detected in an unseen image, the network will be able to assign the image to a class with confidence.

2.2.1. Convolutional Neural Network Approaches

The success of convolutional neural networks (CNNs) with general computer vision tasks motivated researchers to employ these models for classifying histopathology images. For the classification of hematoxylin and eosin-stained breast cancer histology images, both Araújo et al. [5] and Vo et al. [17] used the Bioimaging 2015 dataset [18] and classified the images into four classes (normal, benign, en el lugar, and invasive) and two groups (carcinoma and noncarcinoma). The former work [5] proposes a CNN that can integrate information from multiple histological scales. The process begins with stain normalization via the method proposed by Macenko et al. [19] in a bid to correct color discrepancies. After that, 12

overlapping patches were extracted from each image. The chosen size of the patches ensures that no relevant information is lost during extraction and, therefore, every patch can be appropriately labeled. Then, data augmentation was used to increase the number of images in the dataset. Finally, a patch-wise trained CNN and a fusion of a CNN and support vector machine classifier (CNN + SVM) were used to determine the patch class probability. Image-wise classification was attained through a patch probability fusion method. The evaluation showed that using majority voting strategy as the fusion method produced the best results. Considering all four classes, patch-wise classification with the CNN achieved an accuracy rate of 66.7%, while the CNN + SVM achieved an accuracy rate of 65%. The image-wise classification achieved higher results at 77.8% accuracy for both classifiers. With only two classes, patch-wise accuracy for the CNN was 77.6%, and for the CNN + SVM, the approach yielded 76.9% accuracy. The image-wise classification for the 2-class task produced the best results at 80.6% for the CNN and 83.3% for the CNN + SVM. The reason for the lower patch-wise classification is that images may contain sections of normal-looking tissue. Since during patch generation the extracted patches inherit the image’s label, this may confuse the CNN. The increase in image-wise classification accuracy is due to the fusion method that is applied. The authors also recorded the sensitivity rates for each of the classes. It is worth noting that overall, for image-wise classification, the approach was more sensitive to the carcinoma class than the noncarcinoma class. This outcome, although not ideal, is preferable since the architecture that was proposed focuses on correctly classifying the carcinoma (malignant) instances [5].

The approach taken by Vo and Nguyen [17] proposed a combination of an ensemble of deep CNNs and gradient boosting tree classifiers (GBTCs). Stain normalization via Macenko et al. [19] and data augmentation were the initial steps of the process. Unlike the standard data augmentation method of rotating and flipping images, the proposed method [17] incorporates reflection, translation, and random cropping of the images. The normalized and augmented data was then used to train the proposed architecture. Specifically, three deep CNNs (Inception-ResNet-v2) were trained using three different input sizes:

. Then, visual features were extracted and fed into GBTCs, which increased classification performance. The majority voting strategy was used to merge the outputs of the GBTCs, resulting in a much more robust solution. Recognition rates of 96.4% for the 4-class classification and 99.5% for the 2-class classification were reported. This result surpasses state-of-the-art achievements. An interesting note is that the authors added global average pooling layers in place of dense (fully connected) layers, and this did not negatively impact the accuracy of the ensemble. Similar to Araújo et al. [5], the authors of this work recorded the sensitivities of their approach. The results indicate that, for the 4-class task, the proposed method struggles with the classification of the en el lugar instances, while the other three classes have incredibly high sensitivities. For the 2-class task, the approach yields a 100% sensitivity on carcinoma instances and 98.9% on noncarcinoma instances. These results indicate that the approach was able to successfully learn both local and global features for the multiclass and binary classification. However, the downfall of this approach is the computational expense.

2.2.2. Convolutional Neural Network with Transfer Learning Approaches

For the TK-AlexNet proposed by Nawaz et al. [3] to classify breast cancer histology images, the classification layers of the AlexNet architecture were replaced with a single convolutional layer, and a max-pooling layer was added before the three fully connected layers with 256, 100, and 4 neurons, respectively. The input size of the proposed network [3] was increased to 512 512. The transfer learning technique used in this application was to fine-tune the last three layers on the ICIAR2018 dataset after having the entire network trained on the ImageNet dataset. The images were stain-normalized with the method proposed in Macenko et al. [19]. An interesting fact is that the authors compared the performance of the model with both non-stain-normalized and stain-normalized images and concluded that using the latter resulted in a gain in performance. After that, data augmentation techniques such as mirroring and rotation were applied, and overlapping patches of size were extracted from each image. Hence, there was a total of 38400 images generated. Evaluation of the model was done using a train-test split of 80%–20%.

The image-wise accuracy reported in [3] was 81.25%, and the patch-wise accuracy was 75.73%. A noteworthy observation is that the normal and benign classes were classified with 85% sensitivity however, the en el lugar and invasive carcinoma classes were classified with 75% sensitivity. For a model to be practical as a second-opinion system, it should ideally have a higher sensitivity to the carcinoma class given the dangers of misdiagnosis.

For this classification task, the Inception-ResNet-v2 was used by Ferreria et al. [20]. The classification layers of the base model were replaced by a global average pooling layer, a dense (or fully connected) layer with 256 neurons, a dropout layer with a dropout rate of 0.5, and a final dense layer of 4 neurons. Moreover, the input size of the network was changed to . Reshaping the images does not significantly impact the form of the cellular structures however, it does reduce computational cost [20]. The authors did not incorporate stain normalization into their experiments. Data augmentation techniques such as image flips (horizontal and vertical), a 10% zoom range, and shifts (horizontal and vertical) were used to increase the dataset. These particular techniques were chosen with care because if the augmentation causes too much distortion, the anatomical structures in the image could be destroyed [20], and this may result in the network having difficulty extracting discriminative features during training.

Two forms of transfer learning were used in this experiment. At first, only the dense (fully connected) layers of the model were trained. This technique is referred to as feature extraction since the network is using pretrained features (from ImageNet) to classify the breast cancer histology images. The result of this step is that only the weights of the dense layers were adjusted. This aids in overfitting [20]. Afterwards, a certain number of layers were unfrozen so that the network could be fine-tuned. Early stopping with a patience of 20 epochs, and a checkpoint callback monitoring minimum validation loss were the additional techniques implemented to avoid overfitting. The dataset was randomly split into 70% training, 20% validation, and 10% testing. The test set achieved an accuracy of 90%.

In a study by Kassani et al. [21], five different architectures (Inception-v3, Inception-ResNet-v2, Xception, VGG16, and VGG19) were investigated for the classification of the ICIAR2018 dataset. Two stain normalization methods were observed in this study: Macenko et al. [19] and Reinhard et al. [22]. Data augmentation included vertical flips, contrast adjustment, rotation, and brightness correction. The data was split into 75% and 25% for training and testing, respectively. The images were resized to pixels with the help of bicubic interpolation. For each of the models, features were extracted from specific blocks, particularly the layer after a max-pooling layer. The extracted features were put through a global average pooling layer and then concatenated to form a feature vector which was fed into an MLP (multilayer perceptron) set with 256 neurons for final classification. Of these models, the modified Xception network trained with Reinhard stain-normalized images performed the best, with a reported accuracy score of 94%. Overall, the Xception architecture performed the best for both of the stain normalization methods, and the Reinhard [22] technique produced higher accuracies than Macenko [19]. The other architectures ranked in the following order: Inception-v3, Inception-ResNet-v2, VGG16, and VGG19. Interestingly, the approximate parameters for these architectures are 23 million, 54 million, 138 million, and 143 million, respectively. One could hypothesize that an increase in parameter count translates to a decrease in accuracy of this dataset. This indicates that the bigger architectures may have more difficulty extracting critical features from training images, even if measures are taken to enlarge the dataset being used. The results of this study also emphasize the benefit of incorporating stain normalization into preprocessing and how choosing the correct method improves accuracy significantly. Table 1 shows a comparison summary of related deep learning techniques in the literature.


Histopathology-driven artificial intelligence predicts TMB-H colorectal cancer

IMAGEN: A representative microscopic image of the hematoxylin and eosin (H&E) stained tumor mutational burden-high colorectal cancer tumor. Digital information from such this neoplastic and also non-neoplastic images is transformed and. ver más

Credit: Niigata University

Niigata, Japan - Biomarkers are important determinants of appropriate and effective therapeutic approaches for various diseases including cancer. There is ample evidence pointing toward the significance of immune check point inhibitors (ICI) against cancer, and they showed promising clinical benefits to a specific group of patients with colorectal cancer (CRC). Several reports demonstrated the efficacy of biomarkers such as programmed death-1 protein ligand (PD-L1), density of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), and tumor mutational burden (TMB), to determine the patient responsiveness for the efficient use of ICIs as therapeutics against cancer.

A high level of TMB (TMB-H), which reflects elevated total number of non-synonymous somatic mutations per coding area of a tumor genome and normally derived from gene panel testing, is recognized as a promising biomarker for the ICI therapies of various solid cancers. However, in clinical practice, it is not feasible to perform gene panel testing for all cancer patients.

In addition, the studies of Dr. Shimada group also provided means to predict TMB-H CRC only by using the TIL information from the H&E slides from the patients' tumor tissues. However, considering that the patients in the studied cohort were not treated with any ICIs, no conclusions could be drawn regarding their ICI responsiveness following the TMB-H diagnosis and it was suggested that future clinical trials need to be conducted to address whether TIL alone can be useful as a predictive biomarker for the efficacy of ICIs. Dr. Shimada says about the present study: "We have developed artificial intelligence to predict genetic alterations in colorectal cancer by deep learning using hematoxylin and eosin slides. This artificial intelligence is important in solving the cost problems associated with genetic analysis and facilitating personalized medicine in colorectal cancer."

Overall, the studies by Dr. Shimada and associates provide a cost and time effective and reliable method to inform the clinicians if the CRC patient they are managing can benefit from Immune Checkpoint Inhibitor (including inhibitors of the PD-1 protein and its ligand, PD-L1) therapy, without implicating the use of gene panel.

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HER2 Molecular Marker Scoring Using Transfer Learning and Decision Level Fusion

In prognostic evaluation of breast cancer, immunohistochemical (IHC) marker human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) is used for prognostic evaluation. Accurate assessment of HER2-stained tissue sample is essential in therapeutic decision making for the patients. In regular clinical settings, expert pathologists assess the HER2-stained tissue slide under microscope for manual scoring based on prior experience. Manual scoring is time consuming, tedious, and often prone to inter-observer variation among group of pathologists. With the recent advancement in the area of computer vision and deep learning, medical image analysis has got significant attention. A number of deep learning architectures have been proposed for classification of different image groups. These networks are also used for transfer learning to classify other image classes. In the presented study, a number of transfer learning architectures are used for HER2 scoring. Five pre-trained architectures viz. VGG16, VGG19, ResNet50, MobileNetV2, y NASNetMobile with decimating the fully connected layers to get 3-class classification have been used for the comparative assessment of the networks as well as further scoring of stained tissue sample image based on statistical voting using mode operator. HER2 Challenge dataset from Warwick University is used in this study. A total of 2130 image patches were extracted to generate the training dataset from 300 training images corresponding to 30 training cases. The output model is then tested on 800 new test image patches from 100 test images acquired from 10 test cases (different from training cases) to report the outcome results. The transfer learning models have shown significant accuracy with VGG19 showing the best accuracy for the test images. The accuracy is found to be 93%, which increases to 98% on the image-based scoring using statistical voting mechanism. The output shows a capable quantification pipeline in automated HER2 score generation.


Discusión

One limitation of percutaneous image-guided ablation when compared with surgery is the lack of pathologic evidence that the target lesion was completely ablated with sufficient tumor-negative margins. Most studies indicate that positive surgical margins have been associated with a higher risk of local recurrence and shorter overall survival (28,29), a conclusion that has been verified in recent studies performed in the context of modern preoperative chemotherapy (30,31).

Similarly, after RF ablation, the minimal ablation margin is a factor associated with local tumor control (23,32–35). Treatment effectiveness is routinely assessed with postprocedural imaging (US, CT, or MR imaging) to evaluate if the intended ablation margin has been reached, and if it has not, to direct further treatment (23,36,37). Several methods have been proposed for precise calculation of the ablation margin, including fusion imaging (32) and use of anatomic intrahepatic landmarks (23). All of these methods suffer from differences when comparing images from scans performed at different times. Despite progress in fusion and registration software, limitations of these techniques still present a challenge when attempting accurate calculation of the margin of the ablation zone around a previously treated tumor (23,32). Despite the use of these imaging modalities, incomplete tumor treatment and LTP remain common after RF ablation (7–10).

The sole use of imaging in the assessment of ablation margins presumes that the entire depicted ablation zone contains necrotic or nonviable cells however, few studies have validated image findings with tissue characteristics after ablation. In the early radiologic-pathologic correlation study performed by Goldberg et al (38), imaging failed to depict peripheral residual untreated tumor foci, even in four of five cases in which initial tumor and ablation zone sizes were identical. Es más, (a) prior studies performed to evaluate tissue collected from the electrodes used for ablation and (B) our study, in which we preformed direct assessment of the ablation zone with biopsy, show that viable tumor cells may be present within the ablation zone, even when postprocedural imaging displays sufficient ablation margins and findings compatible with radiographic technical success (12,13,16). It appears that these incompletely treated viable tumor cells within the ablation zone “escape” the spatial resolution of available anatomic and functional imaging modalities. In addition, the assessment of tissue examinations in the ablation zone introduces an objective tool with which to assess ablation effectiveness. This assessment is less vulnerable to operator variability and technical limitations, such as those described in the assessment and calculation of the ablation margin (23), and it may be easier to reproduce. Nevertheless, biopsies and sampling errors can also occur, and residual tumor may not be detected in some cases. This can explain the few recurrences seen in our study even after negative biopsy results and sufficient margins were obtained.

Histopathologic examination of tumors excised immediately after RF ablation has shown regions of altered cellular morphology within the treated volume that do not correspond to coagulative necrosis or classic tumor cell appearance (38). These areas may represent either (a) cells in the early stages of irreversible apoptosis or coagulative necrosis or (B) viable cells maintaining their proliferative potential, allowing them to replicate once the cellular insult is removed (21,22). Thus, it is prudent to further interrogate such cells with available immunohistochemical staining for cytosolic and mitochondrial enzyme activity, especially in the immediate postprocedural setting. Days after RF ablation, the evolution of intracellular cascades leads to more pronounced cellular changes in the direction of irreversible apoptosis or necrosis that can be evaluated with standard hematoxylin-eosin staining (38,39). However, immunohistochemical staining has been considered superior to hematoxylin-eosin staining in the diagnosis of irreversible cellular damage up to 24 weeks after RF ablation, as noted in an earlier study by Morimoto et al (39).

An interesting and unique finding of our study is that immunohistochemistry did not alter the initial classification based on the interpretation of the morphologic (hematoxylin-eosin) stain. All 16 ablation zones containing tumor cells were also positive for Ki-67, OXP, or both. This observation differs from observations in previous studies in which ablated tissue was assessed and in which immunohistochemistry was considered necessary to determine viability and changed specimen classification in two (13%) of 15 cases (12,13). It is possible that this finding represents the acquired experience of study pathologists at our institution in the evaluation of ablated tissue, and it potentially justifies the future investigation of the utility of immediate postablation frozen sections and morphologic assessment to document complete tumor cell necrosis.

Viability of tissue adherent to electrodes was analyzed in a study by Snoeren et al (16), who used the autofluorescence method and glucose-6-phosphate diaphorase staining. They concluded that viable tissue was an independent risk factor for LTP . Despite the different methods used to document viability, the incidence of viable tissue in the Snoeren et al study (29.2%) was slightly greater than that in our study (24%) and in the prior studies by Sofocleous et al (19.1%) (12,13). This observation, in combination with the fact that viability in all studies was an independent predictor of LTP , may indicate that both methods of tissue evaluation possess similar efficacy.

Our study had several limitations. The most important factor limiting the weight of our conclusions was the relatively small number of enrolled patients (norte = 47). In addition, pathologic evaluation with biopsies from the center and the margin of the ablation zone does not yield information about necrosis within the entire treated lesion volume, as opposed to the evaluation of resected tumors and their surgical margins. Moreover, specimens were classified as Ki-67 positive even if the evaluated tissue was only slightly positive at immunostaining. Estimation of the labeling percentage of the target CLM was not performed, thereby precluding investigation of any potential correlation between the level and grade of proliferation (Ki-67 positivity) and time to LTP . Another limitation of our study was that the minimal margin analyzed as a predictor for time to LTP was evaluated by using 4–8-week postablation CT images, while the presumed minimal margin targeted with biopsy was estimated by using CT images obtained immediately after ablation. That was a rough estimate suited to the time limitations of the procedure however, for this study, accurate estimation and recording of the minimal margin (using CT landmarks) was performed by using CT images obtained 4–8 weeks after RF ablation, as previously described in detail (23). Software capabilities with fusion of the preablation tumor with the ablation zone are currently under development and are evolving. This will enable accurate calculation of the margin during or immediately after ablation and at subsequent time points. As indicated in our work, a positive viable tumor biopsy had a strong and significant prognostic value, as it was an early biomarker of local tumor recurrence and ablation failure. The addition of biopsy of the ablation zone introduces a more objective and reproducible significant predictive assessment of the ablation zone rather than relying on the imaging findings and margin assessment alone.

Avances en el conocimiento

■ Ablated tumors with posttreatment biopsies containing tumor cells positive for Ki-67 or OxPhos antibodies are 3.4 times more likely to recur (PAG = .008).


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