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En el acoplamiento molecular, ¿cuál es la diferencia entre ligando y cofactor?

En el acoplamiento molecular, ¿cuál es la diferencia entre ligando y cofactor?


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En el aspecto de acoplamiento molecular, ¿cuál es la diferencia entre el ligando y el cofactor? ¿Se puede utilizar un cofactor como ligando para acoplarse al objetivo?


Ligando es un término genérico para unir no covalentemente cualquier cosa. Un cofactor, sustrato o regulador alostérico podría ser un ligando. Este es un ligando de definición bioquímica, no lo confunda con una definición química formal de ligando.

Lo que generalmente es importante sobre los cofactores es que no son proteínas, pero son esenciales para la actividad biológica de la proteína. Pueden ser un ión metálico, un complejo orgánico, una vitamina, etc. Los complejos orgánicos que actúan como cofactores también se conocen como coenzimas. Los cofactores que se unen con fuerza o se unen covalentemente se denominan grupos protésicos. La proteína sin los cofactores requeridos se llama apoenzima, y ​​con sus cofactores se llama holoenzima.

Tenga en cuenta que para centrarse en el tema de este sitio, debe investigar un poco con anticipación y producir una pregunta enfocada y estudiada. Wikipedia proporciona con regularidad la misma respuesta literalmente.


Acoplamiento rígido


Volver al índice.
Acoplamiento proteína-proteína:
Este problema involucra dos proteínas que son aproximadamente del mismo tamaño. Por lo tanto, generalmente el sitio de acoplamiento es una superficie más "plana" que en el acoplamiento ligando-proteína y los casos en los que el acoplamiento ocurre cuando una molécula se encuentra dentro de una cavidad en la otra molécula, son muy raros.

Hay varias fuerzas físicas y químicas que interactúan entre las dos moléculas. Estas fuerzas se utilizan para definir varios puntajes de acoplamiento que miden qué tan buena es cada solución. Estos puntajes tienen en cuenta la fuerza de estas fuerzas y la plausibilidad de la solución de acoplamiento.
Las fuerzas más significativas son:

    La fuerza más significativa que atrae partes de las moléculas más juntas o más separadas según su carga eléctrica.
    Esta fuerza es muy significativa cuando las moléculas están cerca y su superficie de contacto es grande.
    La fórmula de esta fuerza es A / (r 6) - B / (r 12) dónde A y B son constantes y r es la distancia entre ellos. Note que cuando la distancia r es muy pequeño, hay una fuerza de rechazo significativa que los separa.

Los problemas de acoplamiento pueden indicarse formalmente de la siguiente manera:
Dejar A, B ser dos moléculas rígidas con su representación geométrica en R 3. Nos gustaría encontrar una transformación rígida T: R 3 -> R 3 tal que la superficie de contacto entre T. A y B es máxima.

La superficie de contacto se define como la superficie donde la distancia entre las moléculas es menor que un umbral dado.
Observe que normalmente intentaremos conseguir una superficie de contacto que sea "suficientemente grande" en lugar de "máxima" y que normalmente tratamos de maximizar no el tamaño de la superficie de contacto, sino una puntuación que mida la calidad de las soluciones de acoplamiento propuestas. Estos dos parámetros están correlacionados pero no son equivalentes. Volver al índice.

El algoritmo DOCK (Kuntz et al.)
La versión básica de este algoritmo fue desarrollada por Kuntz et al. en la universidad de california hace más de 15 años y, a pesar de su antigüedad, todavía se considera un método exitoso para resolver el problema del acoplamiento rígido y se utiliza como punto de referencia para otros algoritmos.
El algoritmo es bastante lento y, por lo tanto, tiene dificultades para manejar grandes superficies. Por lo tanto, se usa principalmente para resolver el acoplamiento ligando-proteína mientras se intenta concentrarse en sitios "interesantes" en la superficie de las moléculas.

  1. Calcule la superficie molecular usando el método de Connolly. El resultado de esta etapa es un conjunto de puntos en la superficie molecular "suavizada" con sus normales.
  2. SPHGEN (generador de esferas): esta etapa crea una nueva representación de la superficie molecular de la proteína y el ligando utilizando 'pseudoátomos' (ver más abajo) y luego usa esta representación para encontrar sitios de acoplamiento plausibles en la superficie molecular: estos sitios de acoplamiento que SPHGEN busca son cavidades en la superficie del receptor. El resto del algoritmo se centra solo en estos sitios.
    Esta etapa es crucial para el éxito del algoritmo y se explicará con más detalle a continuación.

SPHGEN consta de las siguientes etapas:
(I) Por cada par en puntos Connolly pagI,pagjuna esfera que pasa a través de este par se coloca de manera que su centro esté en uno de los puntos normales (ver Figura 2) .
Recuerda que cada pagIes un punto en la superficie de un átomo específico de una de las moléculas.
Ahora definimos Snorma(i) = I>
(II) Suponiendo que hay norte Connolly apunta, luego para cada 1 & lt = i & lt = n y pagIestá en la superficie del receptor, tiramos todas las esferas en Snorma(I) y deje solo el que tenga el radio más pequeño. Esto arroja todas las esferas que penetran en la superficie del receptor.
(III) Deja solo las esferas donde Theta & lt 90 o (ver Figura 2). De lo contrario, los puntos que definen la esfera, pagI y pagj, están demasiado cerca entre sí y, por lo tanto, no se encuentran en una cavidad en la superficie del receptor.
(IV) Para cada átomo, deje solo la esfera con el radio máximo. Este paso deja solo las esferas que 'tocan' la superficie del átomo.
(V) Si los puntos que definen la esfera, pagI y pagj, pertenecen a dos átomos diferentes, y la distancia entre estos átomos en la secuencia molecular es menor que 4 - descarte la esfera. Esto se hace porque la longitud de una curva en una hélice alfa es 3.6 y no deseamos tratar estos sitios como posibles sitios de atraque.

Las esferas restantes se llaman pseudoátomos.
La siguiente etapa busca grupos de pseudoátomos que se cruzan. La existencia de este tipo de cúmulos indica la existencia de una cavidad en la superficie molecular, que se considera un buen sitio de atraque.

Figura 2 - Dos puntos pagI y pagj en la superficie de Connolly con sus normales (en rojo). La esfera en esta figura está en Snorma(I) porque su centro está en pagI'es normal. El ángulo Theta está marcado en azul.

Figura 3: un ejemplo de un grupo de pseudoátomos fuera de la superficie de Connoly del receptor. Si eliminamos el pseudo-átomo más grande (aquí en el medio del grupo) tendríamos dos sub-grupos de pseudo-átomos

El problema de emparejamiento
En el problema de emparejamiento del acoplamiento rígido, estamos tratando de encontrar una traslación y rotación de una molécula, de modo que se forme un buen emparejamiento entre los puntos interesantes de ambas moléculas.

En el grupo de Kuntz, las distancias entre el punto utilizado en lugar de las ubicaciones de los puntos: Para cada molécula, el receptor (R) y el ligando (L), se define una matriz de distancias apropiada - Dr yo, j y d L yo, j, respectivamente. Luego intentan encontrar dos subconjuntos en R y L de modo que sus distancias sean las mismas, con cierta tolerancia al error. Estos dos subconjuntos definen dos subgrafos con distancias casi similares entre sus vértices.
Esto se hace usando un método similar al árbol de interpretación por Grimson y Lozano-Perez:
La raíz tiene varios candidatos matemáticos y, a medida que bajamos en el árbol, debemos verificar que las distancias en la ruta cumplan con la tolerancia de error requerida. Para tener un algoritmo más eficiente, la implementación de grupo de Kuntz recorta las rutas donde la coincidencia no es lo suficientemente buena, pero esta implementación se vuelve sensible al orden de los puntos en el árbol, por lo que el algoritmo podría tener un tiempo de ejecución exponencial.

Otra forma de resolver el problema de emparejamiento es encontrar una camarilla "lo suficientemente grande" en un gráfico coincidente. Si tenemos norte puntos en el receptor y metro punto en el ligando, el gráfico coincidente tiene Nuevo Méjico vértices donde cada vértice representa un punto del receptor y un punto del ligando.
Dejar G = (V, E) ser el gráfico matemático y dejar u, v ser vértices en V dónde tu representa tuL y tuR (puntos en el ligando y el receptor, respectivamente) y v representa vL y vR . Un borde e = (u, v) será agregado a mi sólo cuando ABS [d L (uL, vL) - d R (uR, vR)] & lt tolerancia. Por lo tanto, una camarilla en el gráfico coincidente define subconjuntos de puntos en el ligando y el receptor con distancias similares.

  • 1 si la distancia es 2.8A - 4.5A.
  • -127 si la distancia es inferior a 2,8A.
  • 0 si la distancia es superior a 4,5A.

Se utilizaron puntuaciones adicionales en varias versiones del algoritmo; por ejemplo, en una versión se calculó una puntuación de energía de Van der-Vaals para las transformaciones que tenían buenas puntuaciones coincidentes.
También hubo intentos de refinar el emparejamiento utilizando dinámica molecular, pero esto no ha demostrado ser un buen método hasta ahora. Una posible razón es que durante el proceso de acoplamiento, varios átomos de ambas moléculas cambian ligeramente de posición.


Biología del ligando y receptor de flt3

El ligando flt3 es miembro de una pequeña familia de factores de crecimiento que estimulan la proliferación de células hematopoyéticas, otros miembros de esta familia incluyen factor de acero (también conocido como factor de crecimiento de mastocitos, factor de células madre y ligando kit) y factor estimulante de colonias 1 Estas proteínas funcionan uniéndose y activando receptores únicos de tirosina quinasa. La expresión del receptor flt3 se restringe principalmente entre las células hematopoyéticas a las células progenitoras más primitivas. El ligando flt3 es similar al factor Steel en que ambas proteínas estimulan la proliferación de células madre o progenitoras tempranas. Ninguno de estos factores tiene mucha actividad proliferativa por sí solo, pero cada factor puede sinergizar con una amplia gama de otros factores estimulantes de colonias e interleucinas (IL) para estimular la proliferación. Una diferencia importante entre los dos factores parece ser su efecto sobre los mastocitos, que estimula el factor Steel pero no el ligando flt3. Aunque el ligando flt3 y el factor Steel actúan cada uno sobre las células hematopoyéticas tempranas, las diferencias en sus actividades sugieren que no son redundantes y que ambos son necesarios para la hematopoyesis normal. Hay una serie de situaciones clínicas en las que el ligando de flt3 puede resultar potencialmente muy útil.


Estudios evolutivos de los sitios de unión de ligandos en proteínas.

La promiscuidad es un impulsor importante de la evolución funcional divergente de los sitios de unión del ligando.

Las funciones enzimáticas de las familias de proteínas están relacionadas.

Las proteínas evolutivamente no relacionadas pueden unirse al mismo ligando usando los mismos o distintos grupos funcionales.

Pequeñas diferencias en los sitios de unión del ligando pueden tener efectos drásticos.

La evolución del sitio de unión afecta tanto a la especificidad como a la selectividad de las interacciones dentro del contexto celular.

Los procesos biológicos en sus aspectos moleculares más fundamentales se definen por interacciones moleculares con interacciones ligando-proteína, en particular en el núcleo de funciones celulares como el metabolismo y la señalización. Los procesos divergentes y convergentes dan forma a la evolución de los sitios de unión del ligando. La competencia entre ligandos similares y sitios de unión a través de familias de proteínas crea presiones evolutivas que afectan la especificidad y selectividad de las interacciones. Esta breve revisión muestra estudios recientes de la evolución de los sitios de unión de ligandos y métodos utilizados para detectar similitudes de sitios de unión.


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En el acoplamiento molecular, ¿cuál es la diferencia entre ligando y cofactor? - biología

1 Facultad de Ciencias Naturales, Indiana University Southeast, New Albany, EE. UU.

2 Departamento de Química, Universidad Purdue, West Lafayette, EE. UU.

3 Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, EE. UU.

Copyright y copia 2013 Victor F. Waingeh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la licencia de atribución de Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original se cite correctamente.

Recibido el 2 de agosto de 2013 revisado el 9 de septiembre de 2013 aceptado el 5 de octubre de 2013

Palabras clave: Inhibidores a base de quinolina Acoplamiento molecular Plasmodium falciparum

El desarrollo de nuevos fármacos antipalúdicos sigue siendo de gran importancia debido a la resistencia del parásito de la malaria a los fármacos que se utilizan actualmente. Las enzimas glicolíticas han surgido como objetivos potenciales para el desarrollo de nuevos fármacos debido a la dependencia del parásito de la glucólisis para obtener energía. En este estudio, se utilizó el acoplamiento molecular para estudiar la unión de algunos fármacos a base de quinolina a la enzima glucolítica lactato deshidrogenasa. Los estudios de acoplamiento identificaron dos sitios de unión potenciales para cada ligando, uno de ellos es el sitio de unión del cofactor. Para todos los ligandos estudiados, hubo una unión comparable al sitio de unión del cofactor así como al sitio de unión secundario cuando el cofactor estaba ausente. Todos los ligandos mostraron una afinidad de unión significativamente menor que el NADH por el sitio de unión del cofactor. El sitio alternativo fue el sitio de preferencia cuando el atraque se realizó en presencia del cofactor. Si bien la unión al sitio del cofactor puede respaldar otros estudios que sugieren un potencial de inhibición competitiva, el hecho de que las afinidades de unión de todos los ligandos sean significativamente más bajas que las de NADH en este sitio sugiere que estos ligandos serán inhibidores competitivos ineficaces. La identificación de un sitio de unión alternativo con afinidad comparable que no se ve afectado por la presencia del cofactor puede sugerir la posibilidad de una inhibición no competitiva que requiere una mayor exploración.

La malaria es una enfermedad infecciosa importante que mata a millones de personas en todo el mundo cada año, y la mayoría de las muertes ocurren en países pobres. Plasmodium falciparum (P. falciparum) es el más virulento de los parásitos de la malaria y su resistencia a los fármacos disponibles actualmente sigue aumentando, lo que constituye un impedimento para los intentos de tratar con éxito la enfermedad. Por lo tanto, existe una gran necesidad y desafío para desarrollar continuamente nuevos inhibidores, con el objetivo de superar la resistencia de los parásitos. La cloroquina y otros compuestos a base de quinolina como la quinina, la mefloquina y la amodiaquina (Figura 1) se han utilizado para el tratamiento de los incidentes de paludismo durante mucho tiempo. Sin embargo, el mecanismo por el cual estos compuestos ejercen sus propiedades antipalúdicas aún no es del todo evidente. Un mecanismo sugerido es la formación de un complejo con el hemo dentro de la vacuola alimentaria que inhibe la polimerización de la hematina [1, 2]. El aumento y la propagación de la resistencia a estos medicamentos actuales es motivo de preocupación y enfatiza la necesidad de un trabajo continuo con el objetivo de desarrollar nuevos y mejores antipalúdicos.

Se cree que la resistencia es el resultado de mutaciones en los sitios activos del fármaco diana [2]. Por lo tanto, al identificar los principales objetivos de los medicamentos y comprender completamente el mecanismo de acción con respecto a estos objetivos, se pueden desarrollar nuevos y mejores antipalúdicos con el objetivo de superar la resistencia a los medicamentos. Entre los objetivos emergentes para el desarrollo de fármacos antipalúdicos, se encuentran las enzimas de la vía glucolítica debido a la dependencia exclusiva del parásito de la glucólisis para obtener energía. Una de las enzimas glucolíticas importantes es la lactato deshidrogenasa (LDH), que participa en el paso final de la glucólisis y cataliza la interconversión de piruvato en lactato.Este paso de la glucólisis también es importante porque regenera el NAD + que necesita la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, otra enzima glucolítica.

Figura 1 . Estructuras de los fármacos antipalúdicos a base de quinolina utilizados en este estudio de acoplamiento, junto con la estructura del cofactor enzimático, NADH.

Se ha demostrado que los inhibidores con actividad antipalúdica se unen a la lactato deshidrogenasa de P. falciparum (pfLDH) [3-7]. La unión de cloroquina en o cerca del sitio de unión del cofactor de pfLDH sugiere que la cloroquina actúa como un inhibidor competitivo de esta enzima [5]. De manera similar, el gosipol, que se ha demostrado que exhibe una actividad antipalúdica significativa, parece unirse selectivamente a pfLDH en comparación con la LDH humana [8]. Sin embargo, el efecto exacto de estas interacciones o su papel en la actividad antipalúdica de estos compuestos aún no se comprende por completo.

En este estudio, la unión de ligandos basados ​​en quinolina a pfLDH se investiga mediante acoplamiento molecular, con el objetivo de mapear los sitios de unión potenciales y determinar las conformaciones de unión más favorables.

2.1. Estructura y configuración de proteínas

Para este estudio, la estructura cristalina del monómero pfLDH en complejo con su cofactor NADH y oxamato se obtuvo del Protein Data Bank (código de entrada PDB 1LDG) [4]. Aunque la unidad funcional biológica de la enzima es un tetrámero de cuatro unidades idénticas, el estudio se realizó utilizando una sola subunidad. Se utilizó Accelrys Discovery Studio (DS) Visualizer 2.5 para editar la estructura de la proteína para eliminar las moléculas de agua junto con los ligandos unidos. Para los estudios de acoplamiento en ausencia de cofactor, también se eliminó el NADH unido.

Los ligandos utilizados en este estudio son inhibidores basados ​​en quinolonas que se han utilizado en el tratamiento de la malaria e incluyen amodiaquina (adq) mefloquina (mfq), quinina (qnn) y cloroquina (clq). La Figura 1 muestra las estructuras de los ligandos utilizados en este estudio, incluido el cofactor NADH para comparación. Las coordenadas de la estructura del ligando se obtuvieron del Drug Bank como archivos de datos de estructura [9]. Se utilizó DS visualizer para reescribir los archivos de datos en formato pdb. Se utilizó AutodockTools [10] para agregar hidrógenos completos a los ligandos, calcular las cargas atómicas parciales de Gasteiger y guardar la estructura resultante en el formato requerido para su uso con AutoDock. Todas las posibles torsiones flexibles de las moléculas de ligando se definieron utilizando AUTOTUTORES en AutoDockTools [10,11].

Una vez que se identificaron los sitios de unión potenciales, se llevó a cabo el acoplamiento de ligandos a estos sitios para determinar las conformaciones de unión más probables y más favorables desde el punto de vista energético. Para este acoplamiento más riguroso que implica un espacio de búsqueda más pequeño limitado al sitio de unión identificado, se utilizó AutodockVina [12]. Se ha demostrado que AutodockVina mejora significativamente la precisión de los modos de enlace previstos en comparación con Autodock 4 [12]. Se llevaron a cabo 10 experimentos independientes por ligando por sitio de unión, con una exhaustividad de 100 y un rango de energía de 3. Las soluciones de acoplamiento se analizaron y clasificaron sobre la base de la función de puntuación de Vina. Para complementar los resultados de Vina y seleccionar los mejores complejos representativos, se realizaron análisis adicionales de soluciones acopladas utilizando NNScore 2.0 [13, 14].

Todos los cálculos se realizaron en máquinas basadas en PC que ejecutan sistemas operativos red hat Linux 5.0, × 86. Las estructuras resultantes se visualizaron y analizaron utilizando una combinación de programas de visualización que incluían DS visualizer y VMD.

3.1. Identificación de sitios vinculantes

Los cuatro ligandos se acoplaron con éxito a pfLDH. Las soluciones de acoplamiento revelaron dos sitios de unión principales en las enzimas (Figura 2), uno de los cuales era el sitio de unión del cofactor (Sitio 1).

El sitio 1, el sitio de unión a NADH, es un bolsillo de unión en el extremo N-terminal de la enzima constituido predominantemente por los residuos de aminoácidos: GLY 27, SER 28, GLY 29, PHE 52, ASP 53, ILE 54, THR 97 , ALA 98, GLY 99, PHE 100, THR 139 y ASN 140. Estos residuos de aminoácidos forman un bolsillo de unión que comienza en el cierre de la superficie (el extremo de adenina del sitio del cofactor) y se extiende profundamente en la enzima (el extremo de nicotinamida de sitio cofactor). El sitio 2 está constituido por residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal de la enzima, incluidos LYS 198, MET 199, VAL 200, LEU 201, GLU 226, PHE 229, ASP 230, VAL 233, LYS 314 y GLU 317. Estos residuos forman un surco de unión cerca de la superficie de la enzima y son parte del dominio de unión del sustrato. Este surco de unión se encuentra en la parte posterior del sitio activo del sustrato que se encuentra a unos 10 & Aring profundo dentro de la enzima y adyacente al extremo de nicotinamida del sitio del cofactor [15].

La distribución de las conformaciones acopladas a los dos sitios de unión se vio afectada por la presencia del cofactor (Figura 3). En ausencia del cofactor, hubo una distribución comparable de conformaciones acopladas estables a ambos sitios de unión. Sin embargo, en presencia del cofactor, el sitio secundario (Sitio 2) fue el sitio de unión preferido para todos los ligandos estudiados.

3.2. Conformaciones atracadas favorables

Para todos los ligandos estudiados, hubo una unión comparable dentro del sitio de unión del cofactor y el sitio secundario cuando el cofactor estaba ausente (Figura 4). Cuando el sitio de unión al cofactor estaba ocupado durante el acoplamiento, las soluciones mejor acopladas para cada ligando se producían en el Sitio 2 (Figura 5). La conformación mejor acoplada en cada sitio de unión se seleccionó en función de las energías de unión calculadas utilizando la función de puntuación AutoDock, así como

Figura 2 . Sitios de unión más probables identificados durante el acoplamiento. El sitio 1 se refiere al sitio de unión al cofactor y el sitio 2 se refiere al sitio de unión secundario.

(a) (b)

Figura 3 . Distribución de conformaciones acopladas a sitios de unión identificados en ausencia (a) y presencia (b) del cofactor NADH.

Figura 4 . La mayoría de las conformaciones unidas estables en los sitios de unión cuando se acoplan se llevan a cabo en ausencia de cofactor.

Figura 5 . Las conformaciones unidas más estables en los sitios de unión cuando el acoplamiento se lleva a cabo en presencia del cofactor.

Clasificación NNScore. Las energías de enlace para las estructuras representativas calculadas por AutoDock se dan en la Tabla 1.

Todos los ligandos muestran menor afinidad que NADH por el sitio de unión del cofactor. Esto se atribuye a las interacciones específicas significativamente menores entre los ligandos y los residuos de aminoácidos cercanos. NADH forma una significativa

Tabla 1 . Energías de unión promedio (en kcal / mol) de las conformaciones acopladas más favorables según la puntuación de AutoDock.

mayor número de enlaces de hidrógeno con residuos vecinos que cualquiera de los compuestos estudiados. La presencia del cofactor disminuye significativamente la capacidad de los ligandos para unirse al sitio de unión del cofactor tanto en términos de probabilidad como de afinidad (Figura 3, Tabla 1). En ausencia del cofactor, los ligandos generalmente se unen hacia el extremo adenina del sitio de unión del cofactor, que está más cerca de la superficie. Aunque los ligandos tienen estructuras diferentes, muestran afinidades de unión similares en el sitio de unión secundario. Ésta es una observación algo sorprendente dadas las diferencias estructurales significativas entre los ligandos. Esto puede atribuirse al hecho de que este sitio de unión está cerca de la superficie de la enzima y, como tal, la unión a este sitio no está significativamente influenciada por consideraciones estéricas. Los ligandos flexibles (como se tratan en este estudio de acoplamiento) pueden reorganizarse en conformaciones favorables sin solapamientos estéricos que se encontrarían si el sitio de unión fuera más profundo dentro de la estructura de la enzima. Una mirada más cercana a las conformaciones estables revela que generalmente están estabilizadas por 1-2 enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos cercanos.

Aunque la unión al sitio de unión al cofactor indica la posibilidad de inhibición competitiva, todos los ligandos estudiados mostraron una afinidad de unión significativamente menor que la del NADH. Una mirada más cercana a los complejos formados muestra que NADH forma un número significativamente mayor de enlaces de hidrógeno con los residuos de aminoácidos vecinos que cualquiera de los ligandos. La presencia de NADH unido durante el acoplamiento redujo significativamente la frecuencia y afinidad por la unión al sitio de unión al cofactor. Esto sugiere que la unión del ligando no es lo suficientemente fuerte para ninguna inhibición competitiva significativa. Todos los ligandos mostraron afinidades de unión similares tanto para el sitio cofactor como para el sitio secundario. Esto puede ser significativo porque este sitio de unión alternativo incluye residuos que forman parte del dominio de unión del sustrato y pueden interferir con la unión del sustrato o la actividad catalítica de la enzima. El dominio de unión al sustrato es una estructura alfa / beta que consta de los residuos 163 - 247 y 267 - 331, y se encuentra adyacente al extremo de nicotinamida del dominio de unión al cofactor [15]. Los residuos de aminoácidos implicados en la unión de los ligandos dentro del sitio de unión secundario son parte de este dominio. Se ha sugerido que una de las principales vías de unión de sustrato en la catálisis de LDH implica el cierre del llamado bucle móvil, que consta de 10 residuos de superficie 98 - 110 [16]. Dado que el sitio activo de la enzima está enterrado profundamente, las fluctuaciones dinámicas son necesarias para facilitar el acceso del sustrato al sitio activo [17]. En LDH, el bucle móvil está en conformación abierta antes de la unión del ligando y se cierra sobre el sitio activo después de que se une el sustrato. Esto implica un cambio estructural transitorio del 10% al 15% dentro del dominio de unión al sustrato, que es necesario para acercar los residuos de aminoácidos catalíticamente necesarios al sustrato unido [16]. Los ligandos basados ​​en quinolonas de este estudio no se unen exactamente al sitio activo y, por lo tanto, no pueden considerarse inhibidores competitivos del sustrato. Sin embargo, su unión al sitio de unión secundario, identificado en este estudio, puede interferir con los cambios estructurales que deberían acompañar al movimiento del bucle móvil y son fundamentales para la unión del sustrato. La formación de interacciones significativas con residuos dentro del dominio de unión al sustrato y cerca del sitio activo, como Lys198, MET199, LEU201, puede inhibir los movimientos del bucle. El sitio de unión secundario puede, por tanto, actuar como un sitio alostérico, lo que sugiere la posibilidad de algún tipo de inhibición alostérica de la actividad catalítica.

En este estudio, se utilizó el acoplamiento molecular para estudiar la unión de cuatro ligandos basados ​​en quinolonas a la lactato deshidrogenasa de Plasmodium falciparum. Los resultados muestran que las moléculas se acoplaron con éxito a la enzima y que hay dos sitios de unión potenciales para estos fármacos antipalúdicos en la enzima, con el sitio de unión del cofactor como uno de ellos. La unión de estos ligandos a la bolsa de unión al cofactor de pfLDH sugiere que todas estas moléculas pueden ser inhibidores potencialmente competitivos del cofactor, NADH, como sugirieron otros estudios con cloroquina [5]. Sin embargo, cualquier inhibición potencial puede ser ineficaz ya que todos los ligandos muestran afinidades de unión más bajas en comparación con NADH. El acoplamiento molecular también identifica un sitio de unión alternativo con una afinidad de unión comparable al sitio del cofactor. El hecho de que estas moléculas puedan unirse a este sitio con afinidades de unión comparables, incluso en presencia del cofactor, sugiere la posibilidad de una inhibición no competitiva o no competitiva. Este sitio de unión incluye residuos que forman el dominio de unión al sustrato y puede sugerir una posible interferencia con la unión del sustrato o la actividad catalítica mediante la inhibición de los cambios conformacionales que se requieren para el acceso del sustrato al sitio activo y la catálisis. Será necesario realizar más investigaciones, incluidos estudios cinéticos experimentales, para determinar el efecto inhibidor, si lo hay, asociado con este modo de unión.

Este trabajo fue apoyado por la oficina del Decano de Investigación del Sureste de la Universidad de Indiana, con una Beca de Investigación de la Facultad de Verano y Subvenciones para Asistente de Investigación de Pregrado para apoyar a los estudiantes que trabajan en el proyecto.


Métodos

Conjuntos de datos

Los datos de RNASeq2 de la cohorte COAD se descargaron del repositorio TCGA [3] utilizando el paquete TCGA2STAT [54]. Los pacientes se filtraron según el tipo de problema en estudio. Para la clasificación según el estado metastásico en los ganglios linfáticos se obtuvo un total de 283 pacientes, clasificando 166 en estadio norte0 y 117 entre etapas norte1 y norte3.

Para el problema de clasificación del estadio de la enfermedad, se clasificaron 154 pacientes entre los estadios S1 y S2, mientras que 120 se clasificaron entre las etapas S3 y S4.

Finalmente, para el problema de clasificación entre tejidos sanos y tumorales, se incluyeron en el análisis 26 pacientes. Estos pacientes presentaron datos RNASeq de su tejido tumoral y tejido normal adyacente. Para una mejor comprensión de esta cohorte, se pueden consultar algunos de los datos clínicos de estos pacientes en el archivo de información complementaria S3.

Análisis de expresión diferencial

Se realizó un análisis de expresión diferencial utilizando el paquete edgeR. Este paquete asume que el número de lecturas en cada muestra (j) asignadas a un gen (i) se modela a través de una distribución binomial negativa con dos parámetros, la media μI, j y el parámetro de sobredispersión Θij.

Yij corresponde al número entero no negativo de lecturas en cada muestra (j) asignada a un gen (i). Los valores de la media y la sobredispersión, en la práctica, no se conocen, por lo que debemos estimarlos a partir de los datos. Finalmente, utilizando la prueba exacta para la distribución binomial negativa, se estiman los genes expresados ​​diferencialmente.

Aprendizaje automático

Se implementaron los siguientes algoritmos: bosque aleatorio (RF) y modelo lineal generalizado (glmnet). Se utilizó una validación cruzada anidada para entrenar los modelos. En otras palabras, hubo dos fases de validación. En primer lugar, se utilizó un holdout para la selección de los mejores hiperparámetros (2/3 para entrenamiento y 1/3 para pruebas) y, en segundo lugar, se utilizó Leave One Out para la validación del modelo.

Acoplamiento molecular

La fuerza de las interacciones se cuantificó mediante la energía de afinidad (AE, kcal / mol) de los ligandos para las proteínas objetivo utilizando el software abierto AutoDock Vina [55]. Todo el procesamiento se realizó en el cluster BioCAI de la Universidad de A Coruña (España). El flujo de acoplamiento tenía varios pasos que incluían el procesamiento de ligandos y proteínas, la conversión y la optimización de la geometría antes de los cálculos de acoplamiento.

Por tanto, los ligandos se presentan como una lista de nombres de fármacos comerciales. Con las API de PubChem, los compuestos de todos los medicamentos se descargaron como SDF 2D. Las moléculas de ligando se convirtieron en AP mediante la optimización de la estructura 3D utilizando el software babel [56]. Las dianas proteicas solo se filtraron para el primer modelo de PDB, se eliminó la parte no proteica (moléculas de agua, otros ligandos, etc.). El PDB de ligandos y proteínas se convirtió en formato PDBQT utilizando scripts de AutoDockTools (prepare_ligand4.py y prepare_receptor4.py) [57]. El objetivo de la proteína se consideró rígido en todos los cálculos de acoplamiento y la búsqueda de interacción consideró toda la superficie de los objetivos. El flujo de acoplamiento se basa en scripts de python y bash, incluida la lectura de los resultados finales. El límite para interacciones estables se considera AE (& lt -7.0 frac ) [58]. Los resultados se basan en el primer conformador de acoplamiento de los ligandos con una desviación de la raíz cuadrada media de las posiciones atómicas (RMSD) de 0 [59]. Presentamos las 50 interacciones principales (los valores de EA más negativos). Usamos 155 dianas proteicas y 151 compuestos (24.273 acoplamientos / valores AE). La lista de interacciones y las cifras de acoplamiento se presentan para una de las mejores interacciones, como nilotinib - compuesto 644241 (ligando) con 3s0i (proteína diana).

Para comprender todos los detalles, se introdujo una nueva herramienta web abierta como COAD-DRD: Colon Adenocarcinoma Drug Repurposing with Docking (https://muntisa.github.io/COAD-DRD/). La herramienta incluye varias secciones sobre el mejor fármaco propuesto para COAD, las 50 interacciones principales, nuestra selección de interacciones y todo el conjunto de datos de resultados de acoplamiento. Todos los archivos y la fuente de la herramienta están disponibles como un repositorio abierto de GitHub en https://github.com/muntisa/muntisa.github.io/tree/master/COAD-DRD. Las secciones de la web incluían tablas interactivas, gráficos, tablas dinámicas y widgets de estructuras 3D (generados con cuadernos de python jupyter basados ​​en HTML, plotly - https://plotly.com, ipywidgets - https://ipywidgets.readthedocs.io/en / latest /, nglview - https://github.com/arose/nglview (DOI: 10.5281 / zenodo.3700850), pivottablejs - https://pivottable.js.org y datatables - https://datatables.net). Por lo tanto, es posible hacer zoom en las estructuras complejas en 3D entre las poses y los objetivos de unión a los fármacos, buscar resultados específicos, encontrar detalles en los gráficos, comprender la firma del fármaco en todos los genes COAD, verificar los átomos de contacto y los enlaces de hidrógeno de las interacciones, y descargar todos los archivos de acoplamiento.

Canalización de análisis

En esta sección describiremos el pipeline seguido para obtener los candidatos a genes presentados en este trabajo. A continuación, se describirán paso a paso cada una de las etapas que se llevan a cabo en este trabajo.

Revisión del estado del arte

El objetivo de este trabajo consistió en la búsqueda y validación de firmas y dianas terapéuticas para el cáncer colorrectal ya reportadas en la literatura.

Para ello, se realizó una revisión de artículos publicados que han utilizado datos TCGA para la ejecución de algoritmos de Machine Learning. De todos los trabajos encontrados, solo se eligieron aquellos estudios en los que la variable dependiente estaba relacionada con el pronóstico de la enfermedad. Finalmente, se identificaron tres artículos. Cada uno de estos estudios informó una firma de genes relacionados con el pronóstico de los pacientes con cáncer de colon.

Generación de la meta-firma

En segundo lugar, se construyó una firma genética fusionando las tres firmas previamente identificadas. Se obtuvieron un total de 34 genes. La firma se verificó para los impulsores previamente definidos para el cáncer de colon. Para ello, los impulsores definidos en cáncer de colon se descargaron de la base de datos de Intogen y no se encontró coincidencia entre las dos listas.

Si asumimos que la expresión de estos genes influye en el pronóstico de los individuos, es interesante, en primer lugar, saber si esta firma predice con precisión el pronóstico de los pacientes en una cohorte como TCGA y en segundo lugar, si alguno de estos genes podría ser un futuro. proteína diana, que podría ser atacada con medicamentos ya aprobados en la industria.

Luego, la firma se validó para dos tipos diferentes de problemas. En primer lugar, para la clasificación del estadio del cáncer y, en segundo lugar, para la clasificación de los pacientes entre sanos y enfermos. Este experimento fue seguido por un estudio de la importancia de las variables dentro de los mejores modelos.

Búsqueda de nuevas dianas terapéuticas

El siguiente enfoque de este trabajo fue la detección de posibles nuevos objetivos terapéuticos mediante la reutilización de fármacos. Este experimento presenta dos partes bien diferenciadas: la obtención de dianas (proteínas) y la obtención de ligandos (fármacos).

Para obtener las dianas, se transformó la firma de genes (nomenclatura HGNC) y todas sus posibles estructuras de PDB proteicas. La transformación se realizó mediante el paquete biomaRt. En este paso, se perdió parte de los genes porque no hay una anotación en PDB para todos los productos proteicos de todos los genes. Al final, nos quedamos con 16 genes que tienen anotación PDB. En la Tabla 5, se muestra la lista de genes utilizados para el experimento de acoplamiento molecular. Se analizaron un total de 155 estructuras PDB derivadas de estos genes.

Para obtener los ligandos, se eligieron medicamentos contra el cáncer que ya habían sido aprobados para el tratamiento. El objetivo de este proceso fue encontrar un fármaco, ya aprobado, que tenga una fuerza de interacción significativa contra una proteína diana para poder reutilizarlo, en este caso, para el cáncer de colon.

Los medicamentos contra el cáncer se obtuvieron del sitio web del Instituto Nacional del Cáncer [60]. Para validar todos los nombres de los medicamentos, se descargaron del repositorio DRUG REPURPOSING HUB [61]. Hicimos una combinación de ambas listas y solo conservamos las que ya pasaron el ensayo clínico y, por tanto, están en el mercado. Finalmente, después del procesamiento, nos quedamos con 81 medicamentos contra el cáncer aprobados.


Introducción

El acoplamiento molecular se utiliza ampliamente para predecir complejos proteína-ligando [1], [2] y para seleccionar grandes bibliotecas de moléculas que modularán la actividad de un receptor biológico. Aunque sufre de responsabilidades bien conocidas, ha pronosticado nuevos ligandos para más de 50 objetivos solo en los últimos cinco años [3] - [57]. En estudios comparativos prospectivos con cribado experimental de alto rendimiento (HTS), ha aumentado las tasas de aciertos en más de 1000 veces [58]. Mientras que HTS ha iluminado el acoplamiento de falsos negativos [56], el acoplamiento ha iluminado correspondientemente los falsos negativos de HTS [3]. Cada vez con mayor frecuencia, las predicciones de acoplamiento se prueban mediante estructuras cristalográficas de rayos X posteriores, a menudo confirmando las geometrías predichas del complejo acoplado [7], [14], [59] - [65].

A pesar de estos éxitos, el atraque conserva pasivos cruciales. Dado que se utiliza para seleccionar bibliotecas de compuestos cada vez más grandes en busca de nuevos ligandos candidatos, la velocidad de los cálculos de acoplamiento sigue siendo un objetivo de optimización. La necesidad de programas de acoplamiento eficientes se ha vuelto más urgente a medida que ha aumentado el tamaño de las bibliotecas de compuestos accesibles. Mientras que las campañas de acoplamiento a principios de la década de 1990 se dirigieron a bibliotecas como el Fine Chemical Directory (MDL) de unas 60.000 moléculas y el Available Chemicals Directory de unas 250.000 moléculas a principios de la década de 2000, el advenimiento de ZINC y bases de datos relacionadas [66], [67] aumentó el número de moléculas adquiribles para el cribado a más de 700.000 en 2005 ya casi 20.000.000 de moléculas de masa molecular inferior a 500 daltons en la actualidad [68]. Más crucial aún es la necesidad de un muestreo suficiente de los estados de ligandos y proteínas en el acoplamiento, y de una evaluación precisa de las energías de unión de los posibles complejos proteína-ligando. El espacio conformacional crece exponencialmente con el tamaño del ligando, y el muestreo de este espacio sigue siendo un desafío. Una cuestión clave es si el acoplamiento es un muestreo suficiente y cómo un mayor muestreo se relaciona con la mejora de la puntuación y los resultados. Esto incluye muestrear los grados internos de libertad dentro del ligando, así como tomar muestras de las poses del ligando entre el ligando y el receptor de proteína.

Se han introducido varios métodos de acoplamiento ampliamente utilizados para abordar estos problemas y aprovechar las oportunidades que presentan las grandes bibliotecas de compuestos para el descubrimiento de nuevos ligandos. El programa FRED [69] muestrea exhaustivamente las geometrías definidas por un retículo regular, filtra usando farmacóforos y luego evalúa las poses restantes con una función de energía. ICM [70] utiliza múltiples ejecuciones estocásticas para muestrear poses que se puntuarán con una función de energía, mientras que GOLD [71] utiliza un algoritmo genético para muestrear poses e incluye una variedad de funciones de puntuación. GLIDE SP [72] utiliza varios niveles de muestreo y puntuación, terminando con una versión modificada de ChemScore con diez términos de puntuación [73], y GLIDE XP [74] utiliza ochenta parámetros para puntuar y está entrenado para reproducir datos de afinidad de unión para complejos conocidos. . Autodock 4 [75] y Autodock Vina [76] son ​​versiones diferentes del mismo enfoque energético basado en cuadrículas con un algoritmo genético para muestrear poses. La serie de programas DOCK se ha centrado típicamente en funciones de puntuación basadas en la física con relativamente pocos términos y muestreo mediante comparación de gráficos entre átomos de ligandos y “puntos calientes” de receptores, puntos de probable complementariedad para un átomo de ligando en particular. Hay dos ramas principales de DOCK, las familias DOCK 6.x [77] y DOCK 3.x, de las cuales la primera se ha centrado más en la predicción precisa de geometrías de ligandos y ha adoptado una gama más amplia de funciones de puntuación. Mientras tanto, los programas DOCK 3.x se han unido más estrechamente a las funciones de puntuación basadas en la física con menos términos, y se han centrado en optimizar la velocidad necesaria para hacer frente a las grandes pantallas de la biblioteca. Es el último programa que se ha probado más extensamente mediante experimentos para el descubrimiento de nuevos ligandos, y se encuentra entre los programas de acoplamiento más exhaustivamente probados por comparación directa con HTS prospectivo y confirmación cristalográfica, al menos en la literatura.

DOCK3.5.54 logró un cribado relativamente rápido de bibliotecas químicas mediante un muestreo eficiente de posibles orientaciones y mediante el uso de una flexibase [78] de conformaciones de ligando precalculadas [79], [80]. El primero se basó en una implementación de la correspondencia gráfica basada en puntos calientes tradicional de DOCK [81], [82] que centró la búsqueda de orientaciones de ligandos complementarios a la proteína que probablemente conduzcan a ajustes favorables, mientras que el segundo eliminó la necesidad de construir ligando conformaciones sobre la marcha, especialmente útil cuando se acopla el mismo ligando a múltiples proteínas, ya que se ahorra tiempo para pantallas adicionales más allá de la primera. Sin embargo, al tratar de optimizar aún más el programa, encontramos que el muestreo de orientaciones se comportaba de manera errática a medida que se variaban los parámetros. Cuando se utilizan histogramas para limitar el muestreo, las orientaciones muestreadas eran siempre un subconjunto de lo que era posible en cualquier tolerancia de distancia dada. El cambio de los parámetros del histograma siempre devolvió diferentes coincidencias posibles de clique de gráficos, pero no devolvió subconjuntos o superconjuntos de las posibles orientaciones realizadas por otros parámetros del histograma, lo que genera confusión al intentar explorar y optimizar el muestreo orientacional. De manera similar, nos preocupaba el muestreo de conformaciones de ligandos en la flexibasa. El problema principal fue la recombinación de diferentes conformaciones generadas por OMEGA [83] en nuevas conformaciones, que tenían el potencial de crear choques estéricos internos. Estas conformaciones a menudo estaban presentes en las pantallas de la biblioteca DOCK3.5.54 [79], [80]. Un esquema para filtrar conformaciones sin choques internos en DOCK3.6 [84] no fue del todo satisfactorio, ya que estas geometrías tensas aún se generaban y los filtros no fueron del todo exitosos, lo que llevó a conformaciones señuelo con buena puntuación. Además, los problemas con las conformaciones en la flexibasa que se va a acoplar, como el muestreo de hidroxilos aromáticos fuera del plano, introdujeron más errores.

Aquí exploramos nuevos algoritmos y estrategias de ingeniería para abordar estos problemas. Adaptamos una técnica exhaustiva de comparación de gráficos [85], [86] que garantiza que tomamos muestras de todos los posibles grupos de gráficos coincidentes. Por camarillas de gráficos nos referimos a superposiciones de conjuntos de átomos de ligandos en conjuntos de puntos calientes de receptores (Figura 1A). Ahora, a medida que aumentamos la cantidad de coincidencias, el muestreo de orientación de ligandos crece de forma regular, predecible y no estocástica. Esto nos permite explorar cómo, y si, un mayor muestreo de ligandos conduce a un mejor rendimiento de acoplamiento, a juzgar por las energías y el enriquecimiento de ligandos conocidos sobre señuelos emparejados. Esto es fundamental para comprender si nuestros principales desafíos en el acoplamiento son el muestreo o la puntuación. Además, exploramos si los cálculos físicamente mejorados de la geometría del ligando, utilizando un término electrostático en la generación de la conformación del ligando, así como un muestreo más realista de hidroxilos aromáticos, conducen a un mejor rendimiento de acoplamiento. En alerta sobre la necesidad de eficiencia en un método que busca clasificar la complementariedad de proteínas de 20.000.000 de moléculas no relacionadas, también exploramos la ingeniería de software para un acoplamiento eficiente, que finalmente mejoró la velocidad bruta del método. El resultado es un método de acoplamiento cuyo muestreo aumenta de manera regular y predecible mientras conserva su cálculo de energía y velocidad basados ​​en la física: en núcleos comunes de 2,66 GHz, puede acoplar de manera confiable la biblioteca de compuestos 1.400.000 utilizada en DUD-E [87] en tan solo 1000 Horas de CPU. Dada la fácil accesibilidad de los clústeres de múltiples núcleos, esta velocidad nos permite probar DOCK estrictamente utilizando diferentes parámetros, en la biblioteca DUD-E de 102 dianas proteicas diversas con un total de 22.805 ligandos y 1.411.214 señuelos con propiedades coincidentes. Varios de los métodos aquí descritos pueden encontrar una amplia aplicación. El nuevo programa se llama DOCK3.7 [88] e incorpora actualizaciones al código fuente de DOCK, el programa de generación de flexibase mol2db2 (una actualización de mol2 db [79], [80]), blastermaster (un DOCK Blaster actualizado [89]) y otros guiones accesorios. DOCK permanece disponible como descarga gratuita, con fuente para todos nuestros programas, para académicos e instituciones de investigación sin fines de lucro. También está disponible una implementación basada en la web para aquellos interesados ​​en usarlo para el descubrimiento de ligandos sin invertir en una instalación local [90].


Métodos

ASMT e inhibidores melatoninérgicos

La proteína utilizada en el estudio de acoplamiento se obtuvo mediante modelos de homología de Azam et al., [24]. Se empleó un servidor web Dogsite para detectar el bolsillo de unión de ASMT (Tabla 1) [25]. Setenta y tres inhibidores de ASMT estructuralmente diversos (archivo adicional 1) con una buena actividad biológica representativa se seleccionaron de la literatura [26-31]. Las estructuras 2D de los inhibidores melatoninérgicos se dibujaron utilizando el paquete de dibujo de estructuras químicas, ChemOffice 2004 [32]. Las energías conformacionales de los inhibidores se redujeron al mínimo mediante el uso de UCSF Chimera [33]. A continuación, las estructuras minimizadas se sometieron a estudios de acoplamiento.

Protocolo de atraque

Los protocolos de acoplamiento molecular se utilizan ampliamente para predecir las afinidades de unión de varios ligandos. En el trabajo actual, nuestro objetivo fue examinar la posibilidad de una relación existente entre las bioactividades experimentales de los inhibidores en estudio y las puntuaciones de acoplamiento. Para obtener resultados precisos, todos los experimentos de acoplamiento se realizaron con los parámetros predeterminados. El tiempo para acoplar un ligando fue de aproximadamente 1-2 min. El acoplamiento con AutoDock / Vina, GOLD y FRED se realizó en una estación de trabajo Linux (openSUSE11.4) con un procesador Intel Pentium D (3.0 GHz) y 1 GB de RAM, mientras que FlexX se ejecutó en Windows 7 equipado con Intel® Atom ™ procesador (1,67 GHz) y 1 GB de RAM.

Acoplamiento con AutoDock / Vina

Los pasos intermedios, como los archivos pdbqt para la preparación de proteínas y ligandos y la creación de cuadros de cuadrícula, se completaron utilizando el programa de interfaz gráfica de usuario AutoDock Tools (ADT). ADT asignó hidrógenos polares, cargas de Kollman de átomos unidos, parámetros de solvatación y volúmenes fragmentarios a la proteína. AutoDock guardó el archivo preparado en formato PDBQT. AutoGrid se utilizó para la preparación del mapa de cuadrícula utilizando un cuadro de cuadrícula. El tamaño de la cuadrícula se estableció en 60 × 60 × 60 xyz puntos con un espaciado de la cuadrícula de 0.375 Å y el centro de la cuadrícula se designó en las dimensiones (x, y, yz): -1.095, -1.554 y 3.894. Se calcula una cuadrícula de puntuación a partir de la estructura del ligando para minimizar el tiempo de cálculo. Se empleó AutoDock / Vina para el acoplamiento utilizando información de proteínas y ligandos junto con las propiedades del cuadro de cuadrícula en el archivo de configuración. AutoDock / Vina emplea un optimizador global de búsqueda local iterado [34, 35]. Durante el procedimiento de acoplamiento, tanto la proteína como los ligandos se consideran rígidos. Los resultados inferiores a 1,0 Å en la desviación de la raíz cuadrada media posicional (RMSD) se agruparon y se representaron mediante el resultado con la energía libre de unión más favorable. La pose con menor energía de unión o afinidad de unión se extrajo y se alineó con la estructura del receptor para su posterior análisis.

Acoplamiento mediante GOLD (optimización genética para el acoplamiento de ligandos)

GOLD utiliza un algoritmo genético para explorar la flexibilidad rotacional de los hidrógenos del receptor y la flexibilidad conformacional del ligando [18]. En GOLD, el atraque se llevó a cabo usando el asistente con parámetros predeterminados tamaño de población (100) selección - presión (1.1) número de operaciones (10,000) número de islas (1) tamaño del nicho (2) y pesos de operador para migrar (0), mutar Se aplicaron (100) y cruzado (100). El sitio activo con una esfera de radio de 10 Å se definió seleccionando un residuo de proteína del sitio activo. Se utilizaron los ajustes del algoritmo genético por defecto para todos los cálculos y se guardó un conjunto de 10 soluciones para cada ligando. GOLD fue utilizado por una función de aptitud de GoldScore. GoldScore es un mecanismo molecular como función y se ha optimizado para el cálculo de las posiciones de unión del ligando. Tiene en cuenta cuatro términos:

Donde Shb_ext es el enlace de hidrógeno proteína-ligando y Svdw_ext son las interacciones de van der waals entre proteína y ligando. Shb_int son las interacciones hidrofóbicas intramoleculares mientras que Svdw_int es la contribución debida a la tensión intramolecular en el ligando.

Acoplamiento con FlexX

FlexX (que ahora forma parte de LeadIT) es un método de acoplamiento flexible que utiliza un algoritmo de construcción incremental (IC) y una función de puntuación empírica pura similar a la desarrollada por Böhm y colaboradores [36] para colocar ligandos en el sitio activo. Los algoritmos de IC primero diseccionan cada molécula en un conjunto de fragmentos rígidos de acuerdo con enlaces rotativos, y luego ensamblan gradualmente los fragmentos alrededor del bolsillo de unión [19]. Para los estudios de acoplamiento, los archivos pdb de ligandos se transformaron en un formato de archivo SYBYL mol2 y se generó una biblioteca de ligandos. Se preparó un archivo de descripción del receptor a través de la interfaz gráfica FlexX. Se definió un sitio activo seleccionando el residuo de la proteína. El sitio activo incluye residuos de proteínas alrededor de una esfera de radio de 10 Å centrada en el centro de masa del ligando. Sobre la base de los valores de energía, se seleccionaron las diez poses más clasificadas para cada ligando en el conjunto de datos para un análisis adicional.

La energía de unión libre ΔG del complejo proteína-ligando viene dada por:

Aquí, f (ΔR, Δα) es una función de escala que penaliza las desviaciones de la geometría ideal y Nputrefacción es el número de enlaces rotativos libres que están inmovilizados en el complejo. Los términos ΔGRAMOmedia pensión, ΔGRAMOio, ΔGArkansas y ΔG0 son parámetros ajustables. ΔGlipo es la energía de contacto lipofílica (Rarey et al., [19]).

Acoplamiento con FRED (acoplamiento rápido, rígido y exhaustivo)

FRED utiliza un algoritmo de acoplamiento multiconformer que genera por separado un conjunto de confórmeros de baja energía y luego realiza un acoplamiento rígido para cada confórmero [37]. Para llevar a cabo el acoplamiento correcto, FRED requería un archivo receptor preparado con precisión, así como una biblioteca de conformadores de ligandos. El archivo receptor se preparó utilizando el archivo make-receptor proporcionado en FRED, mientras que la biblioteca de conformadores de ligandos se creó en Omega 2.3.2 (OpenEye Scientific Software) con la configuración predeterminada. El volumen de la caja de acoplamiento centrada en el receptor se expandió en todas las direcciones hasta que fue de aproximadamente 31671 Å 3. Las dimensiones de la caja eran: 28,10 Å × 32,91 Å × 34,25 Å. Se usó FRED con una función de puntuación de ajuste de tipo gaussiano Chemgauss4 para acoplar ASMT con la biblioteca de conformadores de ligandos con el fin de obtener un potente inhibidor contra ASMT. Chemgauss4 usa los potenciales entre las posiciones químicamente emparejadas alrededor de la pose de ligando acoplado. Esas posiciones químicas son complementarias a los grupos específicos cercanos en el receptor. Generalmente, las interacciones son donantes o aceptores de enlaces de hidrógeno y se obtiene una puntuación de enlace de hidrógeno favorable cuando una posición de hidrógeno polar en una molécula se superpone a una posición de par solitario en otra molécula. Las interacciones que pueden puntuarse mediante las funciones de Chemgauss son: estérico, aceptor, donantes, grupos coordinadores, metales, pares solitarios, hidrógenos polares y grupos coordinadores quelantes [38].


Moléculas Pequeñas
- Generación de coordenadas 3D
- Herramientas computacionales para la optimización de la geometría
- Análisis conformacional
- Determinación de los potenciales de interacción molecular
- Identificación de farmacóforos
- Métodos 3D QSAR

Un caso de estudio para el modelado de moléculas pequeñas: antagonistas del receptor de dopamina D3
- Construcción de un modelo de farmacóforo
- Análisis 3D QSAR

Introducción al modelado comparativo de proteínas
- Dónde y cómo obtener información sobre proteínas
- Terminología y principios de la estructura de las proteínas
- Modelado comparativo de proteínas
- Procedimientos de optimización -
Refinamiento del modelo -
Dinámica molecular
- Validación de modelos de proteínas
- Propiedades de las proteínas

Detección y acoplamiento virtuales
- Preparación de los socios
- Algoritmos de acoplamiento
- Funciones de puntuación
- Postfiltrado de los resultados del cribado virtual
- Comparación de diferentes métodos de atraque y puntuación
- Ejemplos de estudios de detección virtual exitosos

Alcance y límites del acoplamiento molecular
- Acoplamiento en el sitio activo Polar que contiene agua
- ¿Incluyendo cofactor en el acoplamiento? (NUEVO)
- Impacto de la tautomería en el acoplamiento (NUEVO)

Enfoques quimiogenómicos para el diseño racional de fármacos (NUEVO)
- Descripción de los espacios de ligando y destino
- Enfoques quimiogenómicos basados ​​en ligandos
- Enfoques quimiogenómicos basados ​​en objetivos
- Enfoques quimiogenómicos basados ​​en ligandos diana

Un caso de estudio para el modelado de proteínas: el receptor de hormonas nucleares CAR como ejemplo para el modelado comparativo y el análisis de complejos proteína-ligando (NUEVO)
- La descripción bioquímica y farmacológica del problema
- Modelado comparativo del CAR del receptor de hormonas nucleares humanas
- Análisis de los modelos que surgieron de las simulaciones MD
- Análisis de mutantes CAR
- Modelado de complejos CAR-Ligando
- La estructura CAR X-Ray entra en juego
- Proyección virtual para nuevos activadores de CAR


Resultados y discusiones

Estudio de acoplamiento molecular para el complejo sirtuin2 usando LigandFit

El enfoque de acoplamiento molecular, uno de los métodos de renombre en el proceso de descubrimiento de fármacos, se utilizó para encontrar la solución para revelar los residuos críticos para la unión del ligando en la proteína. LigandFit /El DS se utilizó para conocer mejor las conformaciones de unión de los inhibidores más probables en el sitio activo de una proteína específica. La precisión de acoplamiento, medida por el modo de unión verdadero relativo de moléculas pequeñas en el sitio activo de los receptores, determina la calidad de la metodología de acoplamiento. El acoplamiento molecular se llevó a cabo utilizando la forma apo de SIRT2 como receptor para hacer visible la orientación de unión del inhibidor en el sitio activo de SIRT2. La orientación adecuada del sirtinol se seleccionó comparando con la estructura cristalina de sir2af2 (ID PDB: 1YC2) (60).El sirtinol acoplado se colocó bien en el bolsillo de unión adecuado y mostró todas las interacciones necesarias informadas en la literatura (60, 61). El complejo SIRT2 seleccionado final se sometió a simulación MD para observar qué tan bien se colocó el sirtinol en su posición original, así como qué tan bien cambia la estructura debido a la unión del inhibidor.

Simulaciones de dinámica molecular

El mejor complejo SIRT2-sirtinol de LigandFit y la forma apo de SIRT2 se sometieron a simulaciones MD de 5 ns usando GROMACS (45-47). La estabilidad de la proteína para los dos sistemas se confirmó trazando la desviación cuadrática media de la raíz (RMSD) y el radio de giro (Rgramo) de proteína. La gráfica RMSD bidimensional de átomos de Cα se dibujó a lo largo de la trayectoria manteniendo la estructura inicial (t = 0) en función del tiempo. El gráfico RMSD de la forma apo y la estructura compleja ha mostrado una desviación entre 0,33 y 0,35 nm (Figura 1). Este valor indica que ambos sistemas están bien estabilizados durante nuestro período de simulación. Para encontrar la flexibilidad de cada residuo a lo largo de la cadena polipeptídica, que es el átomo de Cα de un residuo particular promediado durante todo el tiempo de simulación (4), se calculó la fluctuación cuadrática media (RMSF). Los resultados de RMSF mostraron que las hélices α y las cadenas β están bien estabilizadas (no muestran mucha desviación) como se esperaba y el pico en la gráfica bidimensional representa que las regiones de bucle son flexibles (Figura 2). Las estructuras promediadas de los últimos 2 nsegundos se utilizaron para el estudio comparativo, así como para distinguir la transformación entre la forma de apo y el complejo SIRT2. En la familia de las sirtuinas, el bolsillo de unión de NAD + se clasificó en tres sitios: Sitio A: el grupo de adenina de NAD + interactúa con los residuos como N286, E288, G86, G261, C324, K287, E323 Sitio B: NAD + ribosa formó interacciones con H187 y Q167 y el sitio C: la parte de nicotinamida de NAD + se colocó en una orientación adecuada para el proceso de desacetilación. S88, N178, H149, D180, I179, F96 y A91 son los residuos cruciales presentes en el sitio C e implicados en la polarización e hidrólisis del enlace glucosídico NAD +. Se planteó la hipótesis de que el sirtinol ocupaba el sitio C del bolsillo de unión de NAD + y reducía la flexibilidad del residuo F96 en Loop3 (Figura 3). Aquí, principalmente, nos centramos en el sitio C del bolsillo de unión de NAD + porque el inhibidor debería ocupar este sitio para cambiar el SIRT2 activo a inactivo. Por lo tanto, la distancia entre los residuos ocupados en el cuello del sitio C se calculó a partir de estructuras iniciales y representativas para calcular su tamaño. Apo y estructuras complejas mostraron una distancia de 11,97 y 20,80 Å entre el H187 y F96, respectivamente (Figura 4). A partir de este análisis, sugerimos que el aumento de la distancia en forma compleja distorsionó el ensamblaje del sitio C del bolsillo de unión de NAD +. La estructura compleja inicial mostró una distancia de 8,44 Å entre el grupo fenilo de F96 (presente en Loop3) y el sirtinol, pero la distancia se incrementó a 13 Å en una estructura compleja representativa (Figura 5). La flexibilidad de Loop3 jugará un papel importante en el alojamiento de NAD + en el sitio activo de SIRT2. El sirtinol mueve F96 fuera del sitio activo con el apoyo de la distorsión parcial de Helix 3 y la flexibilidad de Loop3 se vio obstaculizada. Por lo tanto, sugerimos que cualquier molécula pequeña que reduzca la flexibilidad de Loop3 podría ser un buen inhibidor y también se demostró que el sirtinol ocupa un lugar y una orientación perfectos en SIRT2 durante nuestro proceso de simulación. La trayectoria se agrupa aplicando el método de enlace único de GROMACS. Este método genera inicialmente la matriz XPM basada en RMSD, que compara cada instantánea con todas las demás. Luego, agrega las estructuras al grupo cuando la distancia entre los elementos del grupo es menor que el valor de corte de 0.107 nm. Del total de diez grupos (Figura 6A), se seleccionaron tres estructuras representativas (Figura 6B) para generar la hipótesis basada en la estructura (de los tres grupos poblados superiores).

Perfiles de desviación cuadrática media (RMSD) de átomos de Cα para la forma apo, proteína unida con sirtinol. Se utilizan accesorios independientes en cada perfil RMSD con respecto a la estructura inicial.


Ver el vídeo: Molecular Docking: conceptos y aplicaciones #Conferencia (Julio 2022).


Comentarios:

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