Información

¿Qué significa dependiente de metales?

¿Qué significa dependiente de metales?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estaba leyendo sobre Cas1 y Cas2 y encontré este extracto:

... Cas2 se identificó como una endoribonucleasa dependiente de metales que escinde el ARNss o el ADNdc ...

¿Qué significa dependiente de metales en este contexto?


Significa que estas enzimas necesitan un ion metálico como cofactor para su función. Este ion metálico suele estar unido en algún lugar cercano o en el centro activo y ayuda a estabilizar los estados de transición.

Sin estos metales, estas enzimas no pueden funcionar correctamente, por eso se utilizan agentes quelantes en preparaciones de proteínas o ADN para inhibir su función.

Referencias

  1. Información disponible a tasas de corte: estructura y mecanismo de las ribonucleasas.
  2. El papel de los metales en la actividad enzimática

¿Qué significa que tengo una linfocitosis monoclonal de células B?: Conocimientos recientes y nuevos desafíos

La linfocitosis monoclonal de células B (MBL) se define como una anomalía de laboratorio en la que se detectan pequeñas poblaciones de células B clonales (& lt5 x 10 (9) / L) en la sangre periférica de sujetos por lo demás sanos. Según el inmunofenotipo, MBL se etiqueta como leucemia linfocítica crónica (CLL) similar (75% de los casos), CLL atípica y CD5 negativo. La concentración de células B clonales diferencia las MBL de recuento bajo (LC) y alto (HC) (& lt o ≥ 0,5 x 10 (9) / L, respectivamente). Gracias a las mejoras técnicas, podemos identificar poblaciones de células B clonales similares a la CLL con mayor frecuencia con la edad, pero todavía estamos lejos de comprender su relación con la CLL clínicamente manifiesta. LC-MBL, que requiere una técnica de detección de alto rendimiento para ser identificada en estudios de población, parece ser un ave de una pluma diferente y varios indicios sugieren que LC-MBL está relacionada con el envejecimiento y / o la estimulación antigénica crónica. Los datos inmunogenéticos, citogenéticos y genéticos apoyan la idea de que la HC-MBL, generalmente identificada en el contexto clínico, es una afección premaligna y, según los parámetros biológicos, con frecuencia es difícil diferenciarla de la CLL en etapa temprana. La rápida mejora y la amplia disponibilidad de tecnología de vanguardia, en particular la secuenciación de próxima generación (NGS), genera esperanzas de que estemos más cerca de revelar la naturaleza fundamental de MBL y CLL y cómo se relacionan entre sí.

Palabras clave: Leucemia linfocítica crónica Genes de inmunoglobulina citogenética Linfocitosis de células B monoclonales Secuenciación de próxima generación.


Siglo XIV, en el sentido definido en el sentido 1a.

Inglés medio progenitor tomado del anglo-francés y latino anglo-francés, tomado del latín progenitor `` individuo de quien desciende una persona o familia, antepasado '', derivado agentivo de prōgignere & quot; producir como descendencia, traer a la existencia, dar lugar a & quot (de Pro- pro-entrada 2 + gignere & quot; traer a la existencia, engendrar, dar a luz & quot), después genitor & quot; padre, madre, creador & quot; volviendo al indoeuropeo * ǵenh1- & quotengender, engendrar & quot + * -tor / * - tōr, sufijo de agente, del cual también griego genétōr & quot; padre, engendrador, antepasado & quot; sánscrito janitar-, janitá & quot; padre, progenitor & quot - más en la entrada de parientes 1

Nota: Alternativamente genitor se ha explicado como una nueva formación basada en genitus, participio pasado de gignere. La vista más antigua y aún algo más atractiva ve genitus como la nueva formación, basada en la perfecta genuī o en genitor sí mismo, después de la conexión con el adjetivo verbal original (gramo)nātus (volviendo al grado cero * ǵn̥h1-para-) se debilitó.


Contenido

Secuencias repetidas Editar

El descubrimiento de repeticiones de ADN agrupadas se produjo de forma independiente en tres partes del mundo. La primera descripción de lo que más tarde se llamaría CRISPR es del investigador de la Universidad de Osaka Yoshizumi Ishino y sus colegas en 1987. Clonaron accidentalmente parte de una secuencia CRISPR junto con el "gen iap " (conversión de isoenzimas de fosfatasa alcalina) del genoma de Escherichia coli [14] [15] ese era su objetivo. La organización de las repeticiones fue inusual. Las secuencias repetidas se organizan típicamente de forma consecutiva, sin secuencias diferentes intercaladas. [15] [11] No conocían la función de las repeticiones agrupadas interrumpidas.

En 1993, investigadores de Tuberculosis micobacteriana en los Países Bajos publicó dos artículos sobre un grupo de repeticiones directas interrumpidas (RD) en esa bacteria. Reconocieron la diversidad de las secuencias que intervienen en las repeticiones directas entre diferentes cepas de M. tuberculosis [16] y usé esta propiedad para diseñar un método de escritura que se denominó spoligotipado, que todavía está en uso hoy. [17] [18]

Francisco Mojica de la Universidad de Alicante en España estudió las repeticiones observadas en los organismos arqueales de Haloferax y Haloarcula especies y su función. El supervisor de Mojica supuso en ese momento que las repeticiones agrupadas tenían un papel en la segregación correcta del ADN replicado en las células hijas durante la división celular porque los plásmidos y cromosomas con matrices de repeticiones idénticas no podían coexistir en Haloferax volcanii. La transcripción de las repeticiones interrumpidas también se observó por primera vez, esta fue la primera caracterización completa de CRISPR. [18] [19] Para el año 2000, Mojica realizó un estudio de la literatura científica y uno de sus estudiantes realizó una búsqueda en genomas publicados con un programa diseñado por él mismo. Identificaron repeticiones interrumpidas en 20 especies de microbios como pertenecientes a la misma familia. [20] En 2001, Mojica y Ruud Jansen, que buscaban repeticiones interrumpidas adicionales, propusieron el acrónimo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para aliviar la confusión derivada de los numerosos acrónimos utilizados para describir las secuencias en la literatura científica. [19] [21] En 2002, Tang, et al. mostró evidencia de que CRISPR repite regiones del genoma de Archaeoglobus fulgidus se transcribieron en moléculas de ARN largas que posteriormente se procesaron en ARN pequeños de longitud unitaria, además de algunas formas más largas de 2, 3 o más unidades espaciadoras-repetidas. [22] [23]

En 2005, el investigador del yogur Rodolphe Barrangou, descubrió que Streptococcus thermophilus, después de desafíos iterativos de fagos, desarrolla una mayor resistencia a los fagos, y esta mayor resistencia se debe a la incorporación de secuencias espaciadoras CRISPR adicionales. [24] La empresa de alimentos danesa Danisco, para la que en ese momento trabajaba Barrangou, desarrolló una resistencia a los fagos. S. thermophilus cepas para su uso en la producción de yogur. Más tarde, Danisco fue comprada por DuPont, que "posee alrededor del 50 por ciento del mercado mundial de cultivos lácteos" y la tecnología se generalizó. [25]

Sistemas asociados a CRISPR Editar

Una importante adición a la comprensión de CRISPR vino con la observación de Jansen de que el grupo de repeticiones de procariotas estaba acompañado por un conjunto de genes homólogos que componen los sistemas asociados a CRISPR o cas genes. Cuatro cas genescas 1-4) fueron reconocidos inicialmente. Las proteínas Cas mostraron motivos de helicasa y nucleasa, lo que sugiere un papel en la estructura dinámica de los loci CRISPR. [26] En esta publicación se utilizó el acrónimo CRISPR como el nombre universal de este patrón. Sin embargo, la función CRISPR siguió siendo enigmática.

En 2005, tres grupos de investigación independientes demostraron que algunos espaciadores CRISPR se derivan del ADN del fago y del ADN extracromosómico, como los plásmidos. [30] [31] [32] En efecto, los espaciadores son fragmentos de ADN recolectados de virus que previamente intentaron atacar la célula. La fuente de los espaciadores fue una señal de que el CRISPR /cas El sistema podría tener un papel en la inmunidad adaptativa de las bacterias. [27] [33] Los tres estudios que proponen esta idea fueron inicialmente rechazados por revistas de alto perfil, pero finalmente aparecieron en otras revistas. [34]

La primera publicación [31] que propone un papel de CRISPR-Cas en la inmunidad microbiana, de Mojica y colaboradores de la Universidad de Alicante, predijo un papel de la transcripción de ARN de los espaciadores en el reconocimiento de blancos en un mecanismo que podría ser análogo a la interferencia del ARN. sistema utilizado por las células eucariotas. Koonin y sus colegas ampliaron esta hipótesis de interferencia de ARN al proponer mecanismos de acción para los diferentes subtipos CRISPR-Cas de acuerdo con la función predicha de sus proteínas. [35]

El trabajo experimental de varios grupos reveló los mecanismos básicos de la inmunidad CRISPR-Cas. En 2007, se publicó la primera evidencia experimental de que CRISPR era un sistema inmunológico adaptativo. [11] [4] Una región CRISPR en Streptococcus thermophilus espaciadores adquiridos del ADN de un bacteriófago infectante. Los investigadores manipularon la resistencia de S. thermophilus a diferentes tipos de fagos agregando y eliminando espaciadores cuya secuencia coincidía con las encontradas en los fagos probados. [36] [37] En 2008, Brouns y Van der Oost identificaron un complejo de proteínas Cas (llamado Cascade) que en E. coli cortar el precursor de ARN CRISPR dentro de las repeticiones en moléculas de ARN maduras que contienen espaciador llamadas ARN CRISPR (ARNcr), que permaneció unido al complejo proteico. [38] Además, se descubrió que se requería Cascade, crRNA y una helicasa / nucleasa (Cas3) para proporcionar a un huésped bacteriano inmunidad contra la infección por un virus de ADN. Al diseñar un CRISPR antivirus, demostraron que dos orientaciones del crRNA (sentido / antisentido) proporcionaban inmunidad, lo que indica que las guías del crRNA estaban dirigidas al dsDNA. Ese año Marraffini y Sontheimer confirmaron que una secuencia CRISPR de S. epidermidis ADN dirigido y no ARN para prevenir la conjugación. Este hallazgo estaba en desacuerdo con el mecanismo propuesto similar a la interferencia de ARN de la inmunidad CRISPR-Cas, aunque más tarde se encontró un sistema CRISPR-Cas que se dirige al ARN extraño en Pyrococcus furiosus. [11] [36] Un estudio de 2010 mostró que CRISPR-Cas corta ambas hebras de ADN de fago y plásmido en S. thermophilus. [39]

Cas9 Editar

Los investigadores estudiaron un sistema CRISPR más simple de Streptococcus pyogenes que se basa en la proteína Cas9. La endonucleasa Cas9 es un sistema de cuatro componentes que incluye dos moléculas pequeñas: crRNA y CRISPR RNA trans-activador (tracrRNA). [40] [41] Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier rediseñaron la endonucleasa Cas9 en un sistema de dos componentes más manejable fusionando las dos moléculas de ARN en un "ARN de guía única" que, cuando se combinaba con Cas9, podía encontrar y cortar el ADN diana especificado por el ARN guía. Esta contribución fue tan significativa que fue reconocida por el Premio Nobel de Química en 2020. Al manipular la secuencia de nucleótidos del ARN guía, el sistema artificial Cas9 podría programarse para apuntar a cualquier secuencia de ADN para la escisión. [42] Otro grupo de colaboradores que comprende Virginijus Šikšnys junto con Gasiūnas, Barrangou y Horvath mostró que Cas9 de la S. thermophilus El sistema CRISPR también se puede reprogramar para apuntar a un sitio de su elección cambiando la secuencia de su crRNA. Estos avances impulsaron los esfuerzos para editar genomas con el sistema CRISPR-Cas9 modificado. [18]

Los grupos liderados por Feng Zhang y George Church publicaron simultáneamente descripciones de la edición del genoma en cultivos de células humanas utilizando CRISPR-Cas9 por primera vez. [11] [43] [44] Desde entonces se ha utilizado en una amplia gama de organismos, incluida la levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae), [45] [46] [47] el patógeno oportunista Candida albicans, [48] [49] pez cebra (Danio rerio), [50] moscas de la fruta (Drosophila melanogaster), [51] [52] hormigas (Harpegnathos saltator [53] y Ooceraea biroi [54]), mosquitos (Aedes aegypti [55]), nematodos (Caenorhabditis elegans), [56] plantas, [57] ratones, [58] [59] monos [60] y embriones humanos. [61]

CRISPR se ha modificado para producir factores de transcripción programables que permiten a los científicos apuntar y activar o silenciar genes específicos. [62]

El sistema CRISPR-Cas9 ha demostrado realizar ediciones genéticas efectivas en cigotos tripronucleares humanos descritos por primera vez en un artículo de 2015 de los científicos chinos P. Liang e Y. Xu. El sistema realizó una escisión exitosa de la beta-hemoglobina mutante (HBB) en 28 de 54 embriones. 4 de los 28 embriones se recombinaron con éxito utilizando una plantilla de donante proporcionada por los científicos. Los científicos demostraron que durante la recombinación del ADN de la hebra escindida, la secuencia endógena homóloga HBD compite con la plantilla del donante exógeno. La reparación del ADN en embriones humanos es mucho más complicada y particular que en las células madre derivadas. [63]

Cas12a (anteriormente Cpf1) Editar

En 2015, la nucleasa Cas12a (antes conocida como Cpf1 [64]) se caracterizó en el sistema CRISPR / Cpf1 de la bacteria. Francisella novicida. [65] [66] Su nombre original, de una definición de familia de proteínas TIGRFAM construida en 2012, refleja la prevalencia de su subtipo CRISPR-Cas en el Prevotella y Francisella linajes. Cas12a mostró varias diferencias clave de Cas9, que incluyen: causar un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra en lugar del corte 'contundente' producido por Cas9, confiando en un PAM 'T rico' (que proporciona sitios de orientación alternativos a Cas9) y requiriendo solo un CRISPR RNA (crRNA) para una focalización exitosa. Por el contrario, Cas9 requiere tanto crRNA como un crRNA transactivante (tracrRNA).

Estas diferencias pueden dar a Cas12a algunas ventajas sobre Cas9. Por ejemplo, los pequeños crRNA de Cas12a son ideales para la edición del genoma multiplexado, ya que se pueden empaquetar más en un vector que los sgRNA de Cas9. Además, los salientes pegajosos 5 'que deja Cas12a se pueden usar para el ensamblaje de ADN que es mucho más específico de la diana que la clonación tradicional de enzimas de restricción. [67] Por último, Cas12a escinde el ADN de 18 a 23 pares de bases aguas abajo del sitio PAM. Esto significa que no hay interrupción de la secuencia de reconocimiento después de la reparación, por lo que Cas12a permite múltiples rondas de escisión del ADN. Por el contrario, dado que Cas9 corta solo 3 pares de bases corriente arriba del sitio PAM, la vía NHEJ da como resultado mutaciones indel que destruyen la secuencia de reconocimiento, evitando así más rondas de corte. En teoría, las rondas repetidas de escisión del ADN deberían aumentar la oportunidad de que se produzca la edición genómica deseada. [68] Una característica distintiva de Cas12a, en comparación con Cas9, es que después de cortar su objetivo, Cas12a permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssDNA de forma no discriminatoria. [69] Esta propiedad se denomina actividad de "escisión colateral" o "trans-escisión" y se ha aprovechado para el desarrollo de diversas tecnologías de diagnóstico. [70] [71]

Cas13 (anteriormente C2c2) Editar

En 2016, la nucleasa Cas13a (antes conocida como C2c2) de la bacteria Leptotrichia shahii Fue caracterizado. Cas13 es una endonucleasa de ARN guiada por ARN, lo que significa que no escinde el ADN, sino solo el ARN monocatenario. Cas13 es guiado por su crRNA a un objetivo de ssRNA y se une y escinde el objetivo. De manera similar a Cas12a, el Cas13 permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssRNA de forma no discriminatoria. [72] Esta propiedad de escisión colateral se ha aprovechado para el desarrollo de diversas tecnologías de diagnóstico. [73] [74] [75]

Repeticiones y espaciadores Editar

La matriz CRISPR se compone de una secuencia líder rica en AT seguida de repeticiones cortas que están separadas por espaciadores únicos. [76] Las repeticiones CRISPR típicamente varían en tamaño de 28 a 37 pares de bases (bps), aunque puede haber tan solo 23 bp y hasta 55 bp. [77] Algunos muestran simetría de díadas, lo que implica la formación de una estructura secundaria como un tallo-bucle ('horquilla') en el ARN, mientras que otros están diseñados para no estar estructurados. El tamaño de los espaciadores en diferentes matrices CRISPR es típicamente de 32 a 38 pb (rango de 21 a 72 pb). [77] Pueden aparecer rápidamente nuevos espaciadores como parte de la respuesta inmunitaria a la infección por fagos. [78] Por lo general, hay menos de 50 unidades de la secuencia espaciadora repetida en una matriz CRISPR. [77]

Estructuras de ARN CRISPR Editar

Genes cas y subtipos de CRISPR Editar

Pequeños racimos de cas los genes a menudo se encuentran junto a las matrices de espaciadores repetidos CRISPR. Colectivamente los 93 cas los genes se agrupan en 35 familias basándose en la similitud de secuencia de las proteínas codificadas. 11 de las 35 familias forman el cas core, que incluye las familias de proteínas Cas1 a Cas9. Un locus CRISPR-Cas completo tiene al menos un gen que pertenece al cas centro. [79]

Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases. Los sistemas de clase 1 utilizan un complejo de múltiples proteínas Cas para degradar los ácidos nucleicos extraños. Los sistemas de clase 2 utilizan una única proteína Cas grande para el mismo propósito. La clase 1 se divide en los tipos I, III y IV, la clase 2 se divide en los tipos II, V y VI. [80] Los 6 tipos de sistemas se dividen en 19 subtipos. [81] Cada tipo y la mayoría de los subtipos se caracterizan por un "gen característico" que se encuentra casi exclusivamente en la categoría. La clasificación también se basa en el complemento de cas genes que están presentes. La mayoría de los sistemas CRISPR-Cas tienen una proteína Cas1. La filogenia de las proteínas Cas1 generalmente concuerda con el sistema de clasificación. [79] Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas, lo que sugiere que son compatibles y pueden compartir componentes. [82] [83] La distribución esporádica de los subtipos CRISPR / Cas sugiere que el sistema CRISPR / Cas está sujeto a la transferencia horizontal de genes durante la evolución microbiana.

La inmunidad CRISPR-Cas es un proceso natural de bacterias y arqueas. [98] CRISPR-Cas previene la infección por bacteriófagos, la conjugación y la transformación natural al degradar los ácidos nucleicos extraños que ingresan a la célula. [36]

Adquisición de espaciadores Editar

Cuando un bacteriófago invade un microbio, la primera etapa de la respuesta inmune es capturar el ADN del fago e insertarlo en un locus CRISPR en forma de espaciador. Cas1 y Cas2 se encuentran en ambos tipos de sistemas inmunológicos CRISPR-Cas, lo que indica que están involucrados en la adquisición de espaciadores. Los estudios de mutación confirmaron esta hipótesis, mostrando que la eliminación de cas1 o cas2 detuvo la adquisición del espaciador, sin afectar la respuesta inmune CRISPR. [99] [100] [101] [102] [103]

Se han caracterizado múltiples proteínas Cas1 y se han resuelto sus estructuras. [104] [105] [106] Las proteínas Cas1 tienen diversas secuencias de aminoácidos. Sin embargo, sus estructuras cristalinas son similares y todas las proteínas Cas1 purificadas son nucleasas / integrasas dependientes de metales que se unen al ADN de manera independiente de la secuencia. [82] Se han caracterizado proteínas Cas2 representativas y poseen actividad endoribonucleasa específica (monocatenario) ssRNA- [107] o (bicatenario) dsDNA- [108] [109].

En el sistema I-E de E. coli Cas1 y Cas2 forman un complejo donde un dímero Cas2 une dos dímeros Cas1. [110] En este complejo, Cas2 desempeña un papel de andamiaje no enzimático, [110] uniendo fragmentos bicatenarios de ADN invasor, mientras que Cas1 une los flancos monocatenarios del ADN y cataliza su integración en matrices CRISPR. [111] [112] [113] Por lo general, se agregan nuevos espaciadores al comienzo de CRISPR junto a la secuencia líder, lo que crea un registro cronológico de las infecciones virales. [114] En E. coli una proteína similar a una histona llamada factor de integración del huésped (IHF), que se une a la secuencia líder, es responsable de la precisión de esta integración. [115] IHF también mejora la eficiencia de integración en el sistema de tipo I-F de Pectobacterium atrosepticum. [116] pero en otros sistemas pueden ser necesarios diferentes factores de hospedaje [117]

Motivos adyacentes al protospacer Editar

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que se escindieron como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que no se seleccionaron al azar, sino que se encontraron adyacentes a secuencias de ADN cortas (3-5 pb) denominadas motivos adyacentes protoespaciadores (PAM). El análisis de los sistemas CRISPR-Cas mostró que los PAM son importantes para los sistemas de tipo I y II, pero no para los de tipo III durante la adquisición. [32] [118] [119] [120] [121] [122] En los sistemas tipo I y tipo II, los protoespaciadores se extirpan en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador cortado utilizando un mecanismo de regla, manteniendo así la regularidad del tamaño del espaciador en la matriz CRISPR. [123] [124] La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar vinculada evolutivamente a Cas1 y la secuencia líder. [122] [125]

Se agregan nuevos espaciadores a una matriz CRISPR de manera direccional, [30] ocurriendo preferentemente, [78] [118] [119] [126] [127] pero no exclusivamente, adyacentes [121] [124] a la secuencia líder. Análisis del sistema tipo I-E de E. coli demostró que se copia la primera repetición directa adyacente a la secuencia líder, con el espaciador recién adquirido insertado entre la primera y la segunda repeticiones directas. [102] [123]

La secuencia de PAM parece ser importante durante la inserción del espaciador en sistemas de tipo I-E. Esa secuencia contiene un nucleótido final fuertemente conservado (nt) adyacente al primer nt del protoespaciador. Este nt se convierte en la base final en la primera repetición directa. [103] [128] [129] Esto sugiere que la maquinaria de adquisición del espaciador genera voladizos monocatenarios en la penúltima posición de la repetición directa y en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo, no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen compartir este mecanismo ya que las PAM en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final. [125] Es probable que en esos sistemas, se genere un extremo romo al final de la repetición directa y el protoespaciador durante la adquisición.

Variantes de inserción Editar

Análisis de Sulfolobus solfataricus Los CRISPR revelaron más complejidades en el modelo canónico de inserción de espaciadores, ya que uno de sus seis loci CRISPR insertó nuevos espaciadores al azar a lo largo de su matriz CRISPR, en lugar de insertarlos más cerca de la secuencia líder. [124]

Varios CRISPR contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno fue descubierto en el sistema de tipo I-E de E. coli. Se detectó una mejora significativa en la adquisición del espaciador donde los espaciadores ya apuntan al fago, incluso los desajustes con el protoespaciador. Este "cebado" requiere que las proteínas Cas involucradas tanto en la adquisición como en la interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores recién adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma hebra que el espaciador de cebado. [103] [128] [129] Esta observación llevó a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición se desliza a lo largo del ADN extraño después de cebar para encontrar un nuevo protoespaciador. [129]

Biogénesis editar

CRISPR-RNA (crRNA), que luego guía la nucleasa Cas hacia el objetivo durante el paso de interferencia, debe generarse a partir de la secuencia CRISPR. El crRNA se transcribe inicialmente como parte de una única transcripción larga que abarca gran parte de la matriz CRISPR. [28] Esta transcripción es luego escindida por proteínas Cas para formar crRNA. El mecanismo para producir crRNAs difiere entre los sistemas CRISPR / Cas. En los sistemas tipo I-E y tipo I-F, las proteínas Cas6e y Cas6f, respectivamente, reconocen los bucles de tallo [130] [131] [132] creados por el emparejamiento de repeticiones idénticas que flanquean el crRNA. [133] Estas proteínas Cas escinden la transcripción más larga en el borde de la región pareada, dejando un solo crRNA junto con un pequeño remanente de la región de repetición pareada.

Los sistemas de tipo III también usan Cas6, sin embargo, sus repeticiones no producen bucles de vástago. En cambio, la escisión se produce por la transcripción más larga que envuelve el Cas6 para permitir la escisión justo aguas arriba de la secuencia repetida. [134] [135] [136]

Los sistemas de tipo II carecen del gen Cas6 y en su lugar utilizan RNaseIII para la escisión. Los sistemas funcionales de tipo II codifican un ARN extrapequeño que es complementario a la secuencia repetida, conocido como ARNcr trans-activador (tracrRNA). [40] La transcripción del tracrRNA y el transcrito primario de CRISPR da como resultado el apareamiento de bases y la formación de dsRNA en la secuencia repetida, que posteriormente es el objetivo de RNaseIII para producir crRNA. A diferencia de los otros dos sistemas, el crRNA no contiene el espaciador completo, que en su lugar está truncado en un extremo. [91]

Los ARNr se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Los ARNr no muestran preferencia entre las cadenas codificantes y no codificantes, lo que es indicativo de un sistema de dirección de ADN guiado por ARN. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] El complejo tipo I-E (comúnmente conocido como Cascade) requiere cinco proteínas Cas unidas a un solo crRNA. [140] [141]

Interferencia Editar

Durante la etapa de interferencia en los sistemas de tipo I, la secuencia de PAM se reconoce en la hebra complementaria de crRNA y se requiere junto con la hibridación de crRNA. En los sistemas de tipo I, el apareamiento de bases correcto entre el crRNA y el protoespaciador señala un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II se basan en una única proteína multifuncional, Cas9, para el paso de interferencia. [91] Cas9 requiere que tanto el crRNA como el tracrRNA funcionen y escinde el ADN utilizando sus dominios de endonucleasa duales HNH y RuvC / RNaseH. El emparejamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago es necesario en los sistemas de tipo II. Sin embargo, el PAM se reconoce en la misma hebra que el crRNA (la hebra opuesta a los sistemas de tipo I).

Los sistemas de tipo III, como el tipo I, requieren seis o siete proteínas Cas que se unen a los crRNA. [142] [143] Los sistemas de tipo III analizados de S. solfataricus y P. furiosus ambos se dirigen al ARNm de los fagos en lugar del genoma del ADN del fago, [83] [143] lo que puede hacer que estos sistemas sean únicamente capaces de dirigirse a genomas de fagos basados ​​en ARN. [82] También se encontró que los sistemas de tipo III se dirigen al ADN además del ARN utilizando una proteína Cas diferente en el complejo, Cas10. [144] Se demostró que la escisión del ADN depende de la transcripción. [145]

El mecanismo para distinguir el ADN propio del extraño durante la interferencia está integrado en los ARNcr y, por lo tanto, es probable que sea común a los tres sistemas. A lo largo del proceso de maduración distintivo de cada tipo principal, todos los crRNA contienen una secuencia espaciadora y una parte de la repetición en uno o ambos extremos. Es la secuencia de repetición parcial la que evita que el sistema CRISPR-Cas se dirija al cromosoma, ya que el emparejamiento de bases más allá de la secuencia espaciadora se señala a sí mismo y evita la escisión del ADN. [146] Las enzimas CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción de tipo V.

Se cree que los genes cas en los módulos adaptador y efector del sistema CRISPR-Cas han evolucionado a partir de dos módulos ancestrales diferentes. Un elemento similar a un transposón llamado casposón que codifica la integrasa similar a Cas1 y potencialmente otros componentes del módulo de adaptación se insertó junto al módulo efector ancestral, que probablemente funcionó como un sistema inmunológico innato independiente. [147] Los genes cas1 y cas2 altamente conservados del módulo adaptador evolucionaron a partir del módulo ancestral, mientras que una variedad de genes cas efectores de clase 1 evolucionaron a partir del módulo efector ancestral. [148] La evolución de estos diversos genes cas del módulo efector de clase 1 fue guiada por varios mecanismos, como los eventos de duplicación. [149] Por otro lado, cada tipo de módulo efector de clase 2 surgió a partir de inserciones independientes posteriores de elementos genéticos móviles. [150] Estos elementos genéticos móviles tomaron el lugar de los módulos efectores de genes múltiples para crear módulos efectores de un solo gen que producen proteínas grandes que realizan todas las tareas necesarias del módulo efector. [150] Las regiones espaciadoras de los sistemas CRISPR-Cas se toman directamente de elementos genéticos móviles extraños y, por lo tanto, su evolución a largo plazo es difícil de rastrear. [151] Se ha descubierto que la evolución no aleatoria de estas regiones espaciadoras depende en gran medida del medio ambiente y de los elementos genéticos móviles extraños que contiene. [152]

CRISPR / Cas puede inmunizar bacterias contra ciertos fagos y así detener la transmisión. Por esta razón, Koonin describió CRISPR / Cas como un mecanismo de herencia lamarckiano. [153] Sin embargo, esto fue discutido por un crítico que señaló: "Debemos recordar [a Lamarck] por el bien que él contribuyó a la ciencia, no por cosas que se parecen a su teoría solo superficialmente. De hecho, pensar en CRISPR y otros fenómenos como solo lamarckianos oscurece la forma simple y elegante en que realmente funciona la evolución ". [154] Pero a medida que se han realizado estudios más recientes, se ha hecho evidente que las regiones espaciadoras adquiridas de los sistemas CRISPR-Cas son de hecho una forma de evolución lamarckiana porque son mutaciones genéticas que se adquieren y luego se transmiten. [155] Por otro lado, la evolución de la maquinaria del gen Cas que facilita el sistema evoluciona a través de la evolución darwiniana clásica. [155]

Coevolución editar

El análisis de las secuencias CRISPR reveló la coevolución de los genomas del huésped y del virus. [156] Las proteínas Cas9 están altamente enriquecidas en bacterias patógenas y comensales. La regulación génica mediada por CRISPR / Cas puede contribuir a la regulación de genes bacterianos endógenos, particularmente durante la interacción con huéspedes eucariotas. Por ejemplo, Francisella novicida utiliza un ARN único, pequeño, asociado a CRISPR / Cas (scaRNA) para reprimir una transcripción endógena que codifica una lipoproteína bacteriana que es fundamental para F. novicida para amortiguar la respuesta del huésped y promover la virulencia. [157]

El modelo básico de la evolución de CRISPR son los espaciadores recién incorporados que impulsan a los fagos a mutar sus genomas para evitar la respuesta inmune bacteriana, creando diversidad tanto en las poblaciones de fagos como de hospedadores. Para resistir una infección por fagos, la secuencia del espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen del fago diana. Los fagos pueden seguir infectando a sus huéspedes si se producen mutaciones puntuales en el espaciador. [146] Se requiere un rigor similar en PAM o la cepa bacteriana permanece sensible a los fagos. [119] [146]

Tarifas Editar

Un estudio de 124 S. thermophilus Las cepas mostraron que el 26% de todos los espaciadores eran únicos y que diferentes loci CRISPR mostraban diferentes tasas de adquisición de espaciadores. [118] Algunos loci CRISPR evolucionan más rápidamente que otros, lo que permitió determinar las relaciones filogenéticas de las cepas. Un análisis genómico comparativo mostró que E. coli y S. enterica evolucionar mucho más lentamente que S. thermophilus. Las cepas de este último que divergieron hace 250 mil años todavía contenían el mismo complemento espaciador. [158]

El análisis metagenómico de dos biopelículas de drenaje ácido de minas mostró que uno de los CRISPR analizados contenía deleciones extensas y adiciones de espaciadores en comparación con el otro biofilm, lo que sugiere una mayor actividad / prevalencia de fagos en una comunidad que en la otra. [78] En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que del 7 al 22% de los espaciadores se compartieron durante 17 meses dentro de un individuo, mientras que menos del 2% se compartieron entre los individuos. [127]

Desde el mismo entorno, se rastreó una única cepa utilizando cebadores de PCR específicos para su sistema CRISPR. Los resultados de nivel amplio de presencia / ausencia de espaciador mostraron una diversidad significativa. Sin embargo, este CRISPR agregó 3 espaciadores durante 17 meses, [127] lo que sugiere que incluso en un entorno con una diversidad CRISPR significativa, algunos loci evolucionan lentamente.

Los CRISPR se analizaron a partir de los metagenomas producidos para el proyecto del microbioma humano. [159] Aunque la mayoría eran específicos del sitio del cuerpo, algunos dentro de un sitio del cuerpo se comparten ampliamente entre las personas. Uno de estos loci se originó a partir de especies de estreptococos y contenía aproximadamente 15.000 espaciadores, el 50% de los cuales eran únicos. Al igual que en los estudios específicos de la cavidad bucal, algunos mostraron poca evolución a lo largo del tiempo. [159]

La evolución de CRISPR se estudió en quimiostatos utilizando S. thermophilus para examinar directamente las tasas de adquisición del espaciador. En una semana, S. thermophilus las cepas adquirieron hasta tres espaciadores cuando se desafiaron con un solo fago. [160] Durante el mismo intervalo, el fago desarrolló polimorfismos de un solo nucleótido que se fijaron en la población, lo que sugiere que el direccionamiento había impedido la replicación del fago en ausencia de estas mutaciones. [160]

Otro S. thermophilus El experimento demostró que los fagos pueden infectar y replicarse en huéspedes que solo tienen un espaciador de direccionamiento. Otro mostró que los huéspedes sensibles pueden existir en entornos con altos títulos de fagos. [161] Los estudios de quimiostato y de observación sugieren muchos matices para CRISPR y la (co) evolución de fagos.

Los CRISPR se distribuyen ampliamente entre bacterias y arqueas [87] y muestran algunas similitudes de secuencia. [133] Su característica más notable son sus espaciadores repetidos y repeticiones directas. Esta característica hace que los CRISPR sean fácilmente identificables en secuencias largas de ADN, ya que el número de repeticiones disminuye la probabilidad de una coincidencia falsa positiva. [162]

El análisis de CRISPR en datos metagenómicos es más desafiante, ya que los loci CRISPR normalmente no se ensamblan, debido a su naturaleza repetitiva oa través de la variación de tensión, lo que confunde los algoritmos de ensamblaje. Cuando hay muchos genomas de referencia disponibles, se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar matrices CRISPR y analizar el contenido del espaciador. [118] [127] [163] [164] [165] [166] Sin embargo, este enfoque proporciona información solo para CRISPR específicamente dirigidos y para organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para diseñar cebadores confiables de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se pueden usar cebadores específicos de repetición degenerados para amplificar espaciadores CRISPR directamente a partir de muestras ambientales Los amplicones que contienen dos o tres espaciadores se pueden ensamblar computacionalmente para reconstruir matrices CRISPR largas. [166]

La alternativa es extraer y reconstruir matrices CRISPR a partir de datos metagenómicos de escopeta. Esto es computacionalmente más difícil, particularmente con tecnologías de secuenciación de segunda generación (por ejemplo, 454, Illumina), ya que las longitudes de lectura cortas evitan que aparezcan más de dos o tres unidades repetidas en una sola lectura. La identificación CRISPR en lecturas sin procesar se ha logrado utilizando únicamente de novo identification [167] or by using direct repeat sequences in partially assembled CRISPR arrays from contigs (overlapping DNA segments that together represent a consensus region of DNA) [159] and direct repeat sequences from published genomes [168] as a hook for identifying direct repeats in individual reads.

Another way for bacteria to defend against phage infection is by having chromosomal islands. A subtype of chromosomal islands called phage-inducible chromosomal island (PICI) is excised from a bacterial chromosome upon phage infection and can inhibit phage replication. [169] PICIs are induced, excised, replicated and finally packaged into small capsids by certain staphylococcal temperate phages. PICIs use several mechanisms to block phage reproduction. In first mechanism PICI-encoded Ppi differentially blocks phage maturation by binding or interacting specifically with phage TerS, hence blocks phage TerS/TerL complex formation responsible for phage DNA packaging. In second mechanism PICI CpmAB redirect the phage capsid morphogenetic protein to make 95% of SaPI-sized capsid and phage DNA can package only 1/3rd of their genome in these small capsid and hence become nonviable phage. [170] The third mechanism involves two proteins, PtiA and PtiB, that target the LtrC, which is responsible for the production of virion and lysis proteins. This interference mechanism is modulated by a modulatory protein, PtiM, binds to one of the interference-mediating proteins, PtiA, and hence achieving the required level of interference. [171]

One study showed that lytic ICP1 phage, which specifically targets Vibrio cholerae serogroup O1, has acquired a CRISPR/Cas system that targets a V. cholera PICI-like element. The system has 2 CRISPR loci and 9 Cas genes. It seems to be homologous to the I-F system found in Yersinia pestis. Moreover, like the bacterial CRISPR/Cas system, ICP1 CRISPR/Cas can acquire new sequences, which allows phage and host to co-evolve. [172]

Certain archaeal viruses were shown to carry mini-CRISPR arrays containing one or two spacers. It has been shown that spacers within the virus-borne CRISPR arrays target other viruses and plasmids, suggesting that mini-CRISPR arrays represent a mechanism of heterotypic superinfection exclusion and participate in interviral conflicts. [166]

CRISPR gene editing Edit

CRISPR technology has been applied in the food and farming industries to engineer probiotic cultures and to immunize industrial cultures (for yogurt, for instance) against infections. It is also being used in crops to enhance yield, drought tolerance and nutritional value. [173]

By the end of 2014 some 1000 research papers had been published that mentioned CRISPR. [174] [175] The technology had been used to functionally inactivate genes in human cell lines and cells, to study Candida albicans, to modify yeasts used to make biofuels and to genetically modify crop strains. [175] Hsu and his colleagues state that the ability to manipulate the genetic sequences allows for reverse engineering that can positively affect biofuel production [176] CRISPR can also be used to change mosquitos so they cannot transmit diseases such as malaria. [177] CRISPR-based approaches utilizing Cas12a have recently been utilized in the successful modification of a broad number of plant species. [178]

In July 2019, CRISPR was used to experimentally treat a patient with a genetic disorder. The patient was a 34-year-old woman with sickle cell disease. [179]

In February 2020, progress was made on HIV treatments with 60-80% of the DNA removed in mice and some being completely free from the virus after edits involving both LASER ART, a new anti-retroviral therapy, and CRISPR. [180]

In March 2020, CRISPR-modified virus was injected into a patient's eye in an attempt to treat Leber congenital amaurosis. [181]

In the future, CRISPR gene editing could potentially be used to create new species or revive extinct species from closely related ones. [182]

CRISPR-based re-evaluations of claims for gene-disease relationships have led to the discovery of potentially important anomalies. [183]

CRISPR as diagnostic tool Edit

CRISPR associated nucleases have shown to be useful as a tool for molecular testing due to their ability to specifically target nucleic acid sequences in a high background of non-target sequences. In 2016, the Cas9 nuclease was used to deplete unwanted nucleotide sequences in next-generation sequencing libraries while requiring only 250 picograms of initial RNA input. [184] Beginning in 2017, CRISPR associated nucleases were also used for direct diagnostic testing of nucleic acids, down to single molecule sensitivity. [185] [186]

By coupling CRISPR-based diagnostics to additional enzymatic processes, the detection of molecules beyond nucleic acids is possible. One example of a coupled technology is SHERLOCK-based Profiling of IN vitro Transcription (SPRINT). SPRINT can be used to detect a variety of substances, such as metabolites in patient samples or contaminants in environmental samples, with high throughput or with portable point-of-care devices. [187] CRISPR/Cas platforms are also being explored for detection [188] [189] [190] [191] [192] and inactivation of SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19. [193]


Virología

Nuestros editores revisarán lo que ha enviado y determinarán si deben revisar el artículo.

Virología, branch of microbiology that deals with the study of viruses.

Although diseases caused by viruses have been known since the 1700s and cures for many were (somewhat later) effected, the causative agent was not closely examined until 1892, when a Russian bacteriologist, D. Ivanovski, observed that the causative agent (later proved to be a virus) of tobacco mosaic disease could pass through a porcelain filter impermeable to bacteria. Modern virology began when two bacteriologists, Frederick William Twort in 1915 and Félix d’Hérelle in 1917, independently discovered the existence of bacteriophages (viruses that infect bacteria).

Direct visualization of viruses became possible after the electron microscope was introduced about 1940. In 1935 tobacco mosaic virus became the first virus to be crystallized in 1955 the poliomyelitis virus was crystallized. (A virus “crystal” consists of several thousand viruses and, because of its purity, is well suited for chemical studies.) Virology is a discipline of immediate interest because many human diseases, including smallpox, influenza, the common cold, and AIDS, as well as a host of economically important plant and animal diseases, are caused by viruses.


Gestation

Nuestros editores revisarán lo que ha enviado y determinarán si deben revisar el artículo.

Gestation, in mammals, the time between conception and birth, during which the embryo or fetus is developing in the uterus. This definition raises occasional difficulties because in some species (e.g., monkeys and man) the exact time of conception may not be known. In these cases the beginning of gestation is usually dated from some well-defined point in the reproductive cycle (e.g., the beginning of the previous menstrual period).

The length of gestation varies from species to species. The shortest known gestation is that of the Virginian opossum, about 12 days, and the longest that of the Indian elephant, about 22 months. In the course of evolution the duration of gestation has become adapted to the needs of the species. The degree of ultimate growth is a factor, smaller animals usually having shorter periods of gestation than larger ones. Exceptions are the guinea pig and related South American rodents, in which gestation is prolonged (averaging 68 days for the guinea pig and 111 days for the chinchilla). The young of these species are born in a state of greater maturity than are those of the rat with its period of 22 days. Another factor is that, in many species with restricted breeding seasons, gestation is adjusted so that birth coincides with the period when food is most abundant. Thus the horse, a spring breeder with 11 months’ gestation, has its young the following spring, as does the sheep, a fall breeder with a five months’ gestation. Animals that live in the open tend to have longer gestations and to bear young that have reached a state of greater maturity than do animals that can conceal their young in underground burrows or in caves. Marsupials generally have short gestations—e.g., 40 days for the largest kangaroos. The young, born in an extremely immature state, transfer to the pouch in which gestation may be said to continue.

Embryos of some species experience an arrest in development that greatly prolongs gestation. This is especially true of the fur-bearing carnivores the martens and weasels. Embryos of the European badger and American marten, which breed in July and August, develop for a few days, then lie dormant in the uterus, being implanted in January. Birth occurs in March. Of the total gestation period of 250 days, growth occurs during only 50. Delayed implantation also occurs in mice and other small rodents that become pregnant while they are still suckling a litter.

Either a single factor or a great number of minor factors, all culminating at or near one date, determine the length of gestation. Several minor variations are known: in man, gestation for males is three to four days longer than that for females and in cattle, bulls are carried about one day longer than heifers. In both species gestation of twins is five to six days less than for singlets. In animals such as the rabbit or pig, which bear many young at a time, gestation is shorter for larger litters than for smaller ones. Heredity also influences gestation in cattle the mean gestation period for Holstein-Friesians is 279 days for Brown Swiss, 290 days other breeds fall between these extremes. When hybrids are produced by crossing two species with different gestation periods, the hybrid is carried for a period lying somewhere between those of the two parents and tending toward the mother’s species. Thus a mare carries a mule foal (fathered by a jackass) about 10 days longer than the normal period for the horse (about 337 days). For human gestation, ver pregnancy.


Early cloning experiments

Reproductive cloning was originally carried out by artificial “twinning,” or embryo splitting, which was first performed on a salamander embryo in the early 1900s by German embryologist Hans Spemann. Later, Spemann, who was awarded the Nobel Prize for Physiology or Medicine (1935) for his research on embryonic development, theorized about another cloning procedure known as nuclear transfer. This procedure was performed in 1952 by American scientists Robert W. Briggs and Thomas J. King, who used DNA from embryonic cells of the frog Rana pipiens to generate cloned tadpoles. In 1958 British biologist John Bertrand Gurdon successfully carried out nuclear transfer using DNA from adult intestinal cells of African clawed frogs (Xenopus laevis). Gurdon was awarded a share of the 2012 Nobel Prize in Physiology or Medicine for this breakthrough.

Advancements in the field of molecular biology led to the development of techniques that allowed scientists to manipulate cells and to detect chemical markers that signal changes within cells. With the advent of recombinant DNA technology in the 1970s, it became possible for scientists to create transgenic clones—clones with genomes containing pieces of DNA from other organisms. Beginning in the 1980s mammals such as sheep were cloned from early and partially differentiated embryonic cells. In 1996 British developmental biologist Ian Wilmut generated a cloned sheep, named Dolly, by means of nuclear transfer involving an enucleated embryo and a differentiated cell nucleus. This technique, which was later refined and became known as somatic cell nuclear transfer (SCNT), represented an extraordinary advance in the science of cloning, because it resulted in the creation of a genetically identical clone of an already grown sheep. It also indicated that it was possible for the DNA in differentiated somatic (body) cells to revert to an undifferentiated embryonic stage, thereby reestablishing pluripotency—the potential of an embryonic cell to grow into any one of the numerous different types of mature body cells that make up a complete organism. The realization that the DNA of somatic cells could be reprogrammed to a pluripotent state significantly impacted research into therapeutic cloning and the development of stem cell therapies.

Soon after the generation of Dolly, a number of other animals were cloned by SCNT, including pigs, goats, rats, mice, dogs, horses, and mules. Despite those successes, the birth of a viable SCNT primate clone would not come to fruition until 2018, and scientists used other cloning processes in the meantime. In 2001 a team of scientists cloned a rhesus monkey through a process called embryonic cell nuclear transfer, which is similar to SCNT except that it uses DNA from an undifferentiated embryo. In 2007 macaque monkey embryos were cloned by SCNT, but those clones lived only to the blastocyst stage of embryonic development. It was more than 10 years later, after improvements to SCNT had been made, that scientists announced the live birth of two clones of the crab-eating macaque (Macaca fascicularis), the first primate clones using the SCNT process. (SCNT has been carried out with very limited success in humans, in part because of problems with human egg cells resulting from the mother’s age and environmental factors.)


Supporting information

S1 Fig. Cloning of MoSMP30 into Vector pET28 a (+).

Agaroge gel images showing (A) the PCR amplified product of MoSMP30 gene, band size 879 bp, (B) confirmation of MoSMP30 gene cloning in pJET1.2 vector by restriction digestion, (C) preparation of vector by restriction digestion of the pET28 a (+) plasmid, and (D) confirmation of MoSMP30 gene cloning in pET28a vector by restriction digestion.

S2 Fig. Cloning of HuSMP30 into pET28 a (+) vector.

Agarose gel images showing (A) restriction digested HuSMP30 product with the restriction enzymes Nde1 y Xho1, (B) vector preparation by the restriction digestion of the pET28 a (+) plasmid, band size

5289 bp, and (C) confirmation of HuSMP30 gene cloning in pET28a vector by restriction digestion.

S3 Fig. SDS-PAGE of MoSMP30 and HuSMP30 proteins from mi. coli (BL21) strain after Coomassie brilliant blue (CBB) staining.

HuSMP30 gene was inserted into pET28a vector and transformed into mi. coli (BL21) cells. The protein concentrations were estimated by the using BCA method, and an equal amounts of proteins both from supernatants and pellets were resolved on 12% SDS-PAGE. Induced supernatant, induced pellet, un-induced supernatant, un-induced pellet, and standard protein marker were loaded in lanes 1, 2, 3, 4 and M respectively. The box indicates the induction of (A) MoSMP30 and (B) HuSMP30 proteins.

S4 Fig. Purification of soluble proteins by Ni-NTA affinity chromatography.

Purification of soluble fractions of proteins and the samples collected during several elution steps were analysed by 12% SDS-PAGE gel which shows (A) elutution fractions (E1, E2, E3, E4 and E5) collected for MoSMP30 and (B) elutution fractions (E1, E2 and E3) collected for HuSMP30.

S5 Fig. Inclusion body (IB) preparation from the insoluble fractions.

12% SDS-PAGE image showing (A) the samples collected during the subsequent purification steps 1, 2, 3, 4, 5 and 6 of IBs purification for MoSMP30. Lane 7 and 9 contain dissolved inclusion body protein and protein marker (ladder) respectively and (B) the samples collected during the subsequent purification steps 1, 2, 3, 4, 5 and 6 of IBs purification for HuSMP30. Protein marker (ladder) and dissolved inclusion body proteins were loaded in lane 7 and 9 respectively.

S6 Fig. UV-VIS titration shown for HuSMP30 with Ca 2+ .

For the calculation of metal binding affinity (Kd values) with different metals, UV-VIS data were acquired at 250-500nm wavelengths. Concentration dependent shift in the delta absorbance was observed at 333nm.

S7 Fig. Calculation of Kd values for MoSMP30.

Kd values were estimated for each of the metals by fitted to Hill equation with a non-linear curve at growth/Sigmoid model using Origin Pro software. The Y-axis represents the delta A333nm and X-axis represents the different metal concentrations.

S8 Fig. Calculation of Kd values for HuSMP30.

Kd values were estimated for each of the metals by fitted to Hill equation with a non-linear curve at growth/Sigmoid model using Origin Pro software. The Y-axis represents the delta A333nm and X-axis represents the different metal concentrations.

S9 Fig. Enzyme kinetics by Lineweaver-Burk plots for the hydrolysis of GTBL.

Double reciprocal plots for the calculation of kinetic parameters (Km and Vmax) were showing concentration dependent incraese in the hydrolysis of GTBL in the presence of (A) Ca 2+ by MoSMP30, (B) Ca 2+ by HoSMP30, (C) Co 2+ by MoSMP30 and (D) Zn 2+ by HuSMP30. Y-axis showing the reciprocal reaction velocity (OD/min), and X-axis showing the reciprocal substrate concentrations (mM). The error bar shows the standard error of the mean (SEM) calculated from triplicate experiments.

S10 Fig. Enzyme kinetics by Lineweaver Burk Plots for the OP (Demeton-S) hydrolysis.

Double reciprocal plots for the calculation of kinetic parameters (Km and Vmax) in the presence of Ca 2+ and Zn 2+ were able to show the activity. MoSMP30 showing increased rate of reaction with increasing conentration of the Demeton-S in the presence of (A) Ca 2+ & (C) Zn 2+ . Similarily, HuSMP30 showing activity with (B) Ca 2+ & (D) Zn 2+ . Y-axis showing the reciprocal reaction velocity (OD/min), and X-axis showing the reciprocal substrate concentrations (mM). The error bar shows the standard error of the mean (SEM) calculated from triplicate experiments.


Genérico

A content marketing guide is generic , your business needs are very much concrete.

IKEA tackles the generic -ness problem by making a vast range of different products, and periodically updating long-running bestsellers.

For example, you can use generic keywords to describe your business, your product, and your services.

Instead, its goal is to shore up the US supply of generic drugs.

Metformin is a widely-used generic drug for mitigating liver sugar production in Type 2 diabetes patients.

And with sildenafil citrate going generic in three years, Pfizer will soon lose sole ownership over the Viagra formula.

But here we are at a generic hotel suite in downtown Toronto.

But everything in Abbudin feels willfully generic , as if even the tiniest hint of specificity might give offense.

We could have made the production a bit more 2010s by steering it in a more generic direction.

Ketorolac, a generic , is considered a relatively nontoxic drug.

Mangold is here, then, a generic term, standing for other plants equally with the beet.

Illiger (1811:83) proposed Tamias as the generic name of the chipmunk of eastern North America.

We have also some portraits of Miss Vaughan, who is aggressive and good to look at but this is not the generic distinction.

We shall first distinguish them by the two generic names of Sapajous and Sagoins.

The word guma, like aubo, appears to be a generic term for water, or potable liquids.


Protein binding: what does it mean?

Protein binding can enhance or detract from a drug's performance. As a general rule, agents that are minimally protein bound penetrate tissue better than those that are highly bound, but they are excreted much faster. Among drugs that are less than 80-85 percent protein bound, differences appear to be of slight clinical importance. Agents that are highly protein bound may, however, differ markedly from those that are minimally bound in terms of tissue penetration and half-life. Drugs may bind to a wide variety of plasma proteins, including albumin. If the percentage of protein-bound drug is greater when measured in human blood than in a simple albumin solution, the clinician should suspect that the agent may be bound in vivo to one of these "minority" plasma proteins. The concentration of several plasma proteins can be altered by many factors, including stress, surgery, liver or kidney dysfunction, and pregnancy. In such circumstances, free drug concentrations are a more accurate index of clinical effect than are total concentrations. Formulary committees must grasp the clinical significance of qualitative and quantitative differences in protein binding when evaluating competing agents.


Ver el vídeo: Propiedades de los Metales (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Eadric

    Que palabras tan necesarias... Genial, notable pensamiento

  2. Daishakar

    Me parece que esto ya se ha comentado.



Escribe un mensaje