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Optogenética: ¿cómo funcionan las opsinas microbianas?

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Acabo de conocer el método de la optogenética y tengo problemas para comprender el genética (de los optogenteicos) parte de las cosas.

Entonces tenemos Retinal y Opsin que forman la molécula de rodopsina que sirve como un canal de iones activado por luz (que es, no hace falta decirlo, muy bueno).

¿Cuál es el proceso en el que una población celular se dirige y se implanta con estas rodopsinas?

¿Y dónde entra en escena la opsina microbiana?

Mi principal recurso, hasta ahora, fue - Optogenética - Método del año / Naturaleza.

¡Gracias!


No hay nada especial en el uso de rodopsina en comparación con hacer que una célula exprese cualquier transgén. Esta pregunta se puede leer como:

¿Cuál es el proceso en el que una población celular se dirige y se implanta con un gen de interés?

Hay muchas formas, que dependen del tipo de celda específico y de si desea hacerlo in vitro, en vivo y en qué especies, y sería muy complejo explicarlas todas en detalle aquí, por lo que me limitaré a dos enfoques que son populares a la hora de hacer optogenética en roedores: infección viral y transgénesis.

Infección viral utiliza un virus inactivado para administrar el transgén. Básicamente, diseña un fragmento de ADN con el gen de la opsina bacteriana de interés y lo coloca en un sobre viral, que es una serie de proteínas que forman el "cuerpo" del virus y que contienen su material genético.
Luego, inyecta el virus en la zona deseada (por ejemplo, en un núcleo cerebral específico) y espera a que infecte las células alrededor del sitio de inyección. Una semana después, esas células expresarán el transgén.

Por (al menos, creo) razones históricas, el primer tipo de virus utilizado para este enfoque fueron los lentivirus. Sin embargo, estos son un poco más complejos de manejar (especialmente porque requieren salas especializadas donde se puedan manejar de manera segura), por lo que los virus adenoasociados (AAV) se están volviendo cada vez más populares.

Tenga en cuenta que el virus está inactivo, es decir, no puede replicarse, solo infecta las células alrededor del sitio de infección, pero no podrá propagarse. Esto es tanto por razones de seguridad como porque desea que la infección se limite a la región específica donde inyectó el virus.

Como decía antes, en lugar de poner una opsina bacteriana puedes poner cualquier gen de interés, el procedimiento es el mismo. En cuanto a las opsinas, las dos primeras que se utilizaron fueron la canalrodopsina-2 (ChR2), un canal sensible a la luz azul y que se puede utilizar para despolarizar (= excitar) las células y la halodopsina (NpHR), una bomba de cloruro sensible a la luz amarilla que, a la inversa, hiperpolarizará (= inhibirá) las células.
Hoy en día existen decenas de variantes de estas y otras opsinas que pueden usarse para impulsar la actividad celular con luces. Muchos de estos se describen en esta revisión (¡cuidado! Bastante técnica):

Optogenética en sistemas neuronales - Yizhar et al., Neuron 2011

Transgénesis en cambio, funciona generando un animal que lleva la opsina (o cualquier otro gen) en su ADN. Esto se puede hacer de varias formas, como mediante microinyección de células madre embrionarias que transportan el transgén.

Puede encontrar una explicación bastante detallada del proceso aquí: Células transgénicas y eliminaciones genéticas, bien resumidas en esta figura (tomada por la misma página):

Generación de ratones transgénicos http://9e.devbio.com/images/ch02/wt020302-2.jpg"> Fago P1, llamado Cre recombinasa, solo en el tipo de célula de interés (nuevamente, usando un promotor específico). Cre tiene la propiedad de cortar el ADN junto a secuencias específicas de 34 pares de bases llamadas loxP (con secuenciaATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT). Esencialmente, si tienesloxP- [alguna secuencia en el medio] -loxPy Cre recombinasa está presente, cortará la secuencia en el medio, dejando solo una secuencia loxP.
Cientos de diferentes líneas de ratones que expresan Cre están disponibles comercialmente hoy en día, para dirigirse a muchos tipos de células diferentes en diferentes órganos.

Ahora, solo necesita una construcción que le permita expresar la opsina de una manera dependiente de Cre. Esto es lo que hizo el grupo de Hongkui Zeng, y se informó en este documento:
Una caja de herramientas de ratones transgénicos optogenéticos dependientes de Cre para la activación y el silenciamiento inducidos por la luz. - Madisen y col., Nat. Neurosci. 2012

Sin entrar en demasiados detalles, la idea es flanquear un Secuencia de STOP con dos sitios loxP. Esto bloqueará la transcripción (eso es lo que hace una secuencia STOP) a menos que Cre-recombinasa esté presente.

Esencialmente:


Fuente: yo mismo, con licencia CC-by-sa, no dudes en reutilizarlo

Tenga en cuenta que en el esquema, ROSA26 es un promotor ubicuo, es decir, un promotor utilizado por todas las células, por lo que en este caso la especificidad viene dada por la expresión de Cre recombinasa y no por el promotor de esta construcción. Además, se inserta un reportero fluorescente (por ejemplo, GFP) para poder visualizar dónde se expresa la opsina.

Al criar estos ratones con la (s) línea (s) Cre de su elección, puede expresar las opsinas en el tipo de célula de su interés.


Fronteras en los circuitos neuronales

Las afiliaciones del editor y los revisores son las últimas proporcionadas en sus perfiles de investigación de Loop y pueden no reflejar su situación en el momento de la revisión.



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Resumen de la charla

La optogenética es una combinación de genética y óptica para lograr una ganancia o pérdida de función de eventos bioquímicos como los potenciales de acción en una neurona o tejido en particular. Los genes de opsina codifican proteínas que reciben luz y dan lugar al flujo de iones. Esta charla ofrece una introducción a la optogenética seguida de ejemplos de cómo se utiliza la optogenética para estudiar el cerebro.

Preguntas

  1. ¿Cuáles de las siguientes afirmaciones son verdaderas sobre las opsinas (seleccione todas las opciones que correspondan)?
    1. Activado por la luz
    2. Dar lugar al flujo de iones
    3. Activado por iones
    4. Puede inhibir las células
    1. Describe la longitud de onda de la luz necesaria para activar la opsina.
    2. Describe la constante de tiempo de desactivación de la opsina después de que se apaga la luz.
    3. Describe la constante de tiempo de activación de la opsina después de que se aplica la luz.
    4. Describe la cantidad de opsinas que se necesitan expresar en una célula para lograr la activación.

    Respuestas

    1. A, B, D
    2. La optogenética puede aumentar la precisión y la especificidad en la excitación y la inhibición. Se pueden enviar estas señales a una sola célula o tejido si se desea. La misma célula / tejido se puede encender y apagar y controlar temporalmente para controlar los eventos bioquímicos.
    3. B
    4. Dado que τ apagado es la constante de tiempo de desactivación de la opsina después de que se apaga la luz, un τ apagado prolongado significa que la celda permanecerá activada después de que se retire la luz. Esto es útil porque se pueden usar varios pulsos de luz de bajo nivel para activar o inhibir la opsina en lugar de un pulso de luz de mayor intensidad. La activación / inhibición puede ocurrir sin que se entregue luz continuamente y, por lo tanto, es menos invasiva porque la opsina permanecerá activada incluso cuando se retire la fuente de luz, ya que la activación es persistente. Estos canales se pueden apagar con un fotón de luz diferente (por ejemplo, encendido con luz azul, apagado con luz verde). Por último, se puede capturar la actividad nativa de la célula después de que se activa en lugar de prescribir un patrón de picos.

    Proteínas de membrana: producción y caracterización funcional

    Martha E. Sommer,. Patrick Scheerer, en Métodos en enzimología, 2015

    3.1.1 Cristalización de opsina libre de ligando y complejos opsina-péptido

    Las membranas de opsina congeladas (por ejemplo, 1,5 mg en 200 μl) se descongelan, se resuspenden y se centrifugan para eliminar el tampón de almacenamiento (4 ° C). A continuación, el sedimento se resuspende con

    1,3 ml de tampón de solubilización (20 mMETRO BTP, pH 7,5, 0,7–1,5% norte-octil-β- d -glucopiranósido (OG) y 0,02% norte-dodecilo-β- d -maltopiranósido (DDM), o OG solo) y se incuban a 4 ° C durante 2-4 h. Luego, la suspensión se centrifuga a 156.400 × gramo durante 10 min a 4 ° C en una ultracentrífuga de mesa para separar la opsina soluble de la materia insoluble. La concentración de opsina se determina por absorbancia (ɛ280 nm = 0,0812 μMETRO - 1 cm - 1 Surya et al., 1995). La cristalización de opsina libre de ligando o del complejo Ops * -GαCT1 se lleva a cabo mediante el método de matriz dispersa (Jancarik & amp Kim, 1991) usando kits de cribado de Hampton Research, Jens Bioscience o QIAGEN. Las condiciones prometedoras se examinan sistemáticamente alterando la concentración de proteínas, los agentes de precipitación, la temperatura y el pH. Los cristales de opsina sin ligando optimizados se cultivan mediante el método de difusión de vapor de gota colgante a 4 ° C utilizando placas Linbro de 24 pocillos. Cada gota colgante se prepara en un cubreobjetos siliconizado mezclando volúmenes iguales (2 μl cada uno) de opsina solubilizada (5 mg / ml) y solución de depósito. La solución del reservorio contiene 2.8–3.4 METRO sulfato de amonio en 0.1 METRO MES o 0.1 METRO tampón de acetato de sodio, pH 5,0–6,0. Los cristales de opsina incoloros suelen aparecer en 2 a 3 días y siguen creciendo durante 5 días. Los cristales completamente desarrollados suelen tener unas dimensiones máximas de (0,2 mm × 0,2 mm × 0,3 mm Fig. 1 A). Cuando 11-cis-retinal se empapa en el cristal, se observa un cambio de color a rojo (gris oscuro en la versión impresa) (Fig.1 B), que desaparece después de la iluminación con luz brillante, lo que indica que la rodopsina se puede regenerar a partir de la opsina en estos cristales . Para la cristalización de opsina en complejo con péptido, se agrega GαCT1 o ArrFL-1 a opsina solubilizada en una proporción molar de 4: 1 o 12: 1, respectivamente, y la cristalización se lleva a cabo como se describe anteriormente (Fig.1 C y F) .

    Figura 1 . Cristales de diferentes formas funcionales de rodopsina. (A) Cristal incoloro de Ops * sin ligando a pH bajo. (B) Cristal rojo (gris oscuro en la versión impresa) de Ops * empapado con 11-cis-de retina. (C) Cristal incoloro de Ops * sin ligando en complejo con péptido GαCT1. (D) Cristales amarillos (grises en la versión impresa) de Meta II con todo empapadotrans-de retina. (E) Cristal amarillo (gris en la versión impresa) de Meta II en complejo con péptido GαCT2 y con todo empapadotrans-de retina. (F) Cristal incoloro de Ops * sin ligando en complejo con ArrFL-1.


    ¿Cómo funciona la optogenética?

    La optogenética comenzó con el descubrimiento de opsinas, como ChR2. Las opsinas son canales fotosensibles que provocan la despolarización o hiperpolarización de neuronas a través de mecanismos como la entrada de iones o cascadas de señalización de proteínas (Kim et al. 2017).

    Las opsinas son sensibles a longitudes de onda de luz específicas, lo que conduce a la activación o inhibición de la actividad neuronal. Por ejemplo, luz azul (

    470 nm) activa ChR2, provocando un influjo de iones Na + y, a su vez, despolarizando la neurona (Boyden et al. 2005). Con la expresión viral y los modelos animales transgénicos, los investigadores pueden apuntar sondas optogenéticas a poblaciones de neuronas definidas genéticamente y a través de proyecciones de todo el cerebro (Kim et al. 2017).

    Las colaboraciones multidisciplinarias entre neurocientíficos, biólogos e ingenieros han llevado a la expansión de la caja de herramientas optogenéticas. Se han descubierto opsinas para activar o desactivar neuronas a diferentes velocidades y con diferentes longitudes de onda de luz (ver Tabla 1). Por ejemplo, se descubrió que la halordopsina, una opsina inhibidora, apaga las neuronas, y se desarrollaron opsinas activadas por rojo, como JAWS, para penetrar más profundamente en el cerebro (Kim et al. 2017).

    Construcción optogenéticaLongitud de onda de excitaciónFunción
    ChR2470 nmActivación
    GtACR2470 nmInhibición
    ArchT540 nmInhibición
    C1v1560 nmActivación
    NpHr590 nmInhibición
    BRAZOS590 nmActivación
    Chrimson590 nmActivación
    ALCANZAR620 nmActivación
    MANDÍBULAS620 nmInhibición


    Entregando tu opsina

    El método estándar de administración de opsina es la inyección local de un constructo viral adenoasociado (AAV) mediante cirugía estereotáxica (ver videos a continuación). El laboratorio de Deisseroth ha desarrollado muchas de estas construcciones de AAV con varios promotores y otras manipulaciones genéticas para ayudar a restringir la expresión a un subtipo neuronal específico. Sin embargo, la longitud del promotor que puede usarse en una construcción de AAV está limitada a sólo unos pocos kb, por lo que la obtención de especificidad neuronal a través de la expresión dirigida por el promotor sola es extremadamente limitada. Por lo tanto, los promotores neuronales genéricos de alta expresión, como la sinapsina o camKIIα, impulsan la mayoría de las construcciones. Como alternativa, algunas construcciones se han diseñado con un marco de lectura abierto inverso (DIO) de doble flujo. Tras la coexpresión con cre recombinasa (ya sea de una línea de ratón o co-inyección viral), la opsina se invierte en la dirección correcta y se expresa (bajo el control de un promotor genérico). Una opsina DIO permite la especificidad del tipo de célula dependiente del promotor de la recombinasa cre sin dejar de aprovechar la expresión robusta a través del promotor en la construcción de AAV.


    Descarboxilación selectiva inducida por dos fotones de los ácidos aspártico D85 y D212 en bacteriorrodopsina

    El interés por las opsinas microbianas se debe a sus propiedades fotofísicas, que son superiores a la mayoría de los tintes orgánicos. Las rodopsinas microbianas como la bacteriorrodopsina (BR) de Halobacterium salinarum tienen una sección transversal asombrosamente alta para la absorción de dos fotones (TPA), que es de gran interés para aplicaciones tecnológicas como el almacenamiento de datos. La irradiación de BR con pulsos de láser intensos a 532 nm conduce a la formación de un fotoproducto batocrómico, que se convierte en una especie fotoquímica que se absorbe en el rango de los rayos ultravioleta. Como se demostró anteriormente, las conversiones fotoquímicas son inducidas por TPA resonante. Sin embargo, la base molecular de estas conversiones seguía sin resolverse. En este trabajo utilizamos espectroscopía de masas para demostrar que el TPA de BR conduce a la descarboxilación selectiva de dos ácidos aspárticos en la vecindad del cromóforo retiniano. Estas conversiones fotoquímicas son la base del almacenamiento permanente de datos de dos fotones en BR y son de importancia crítica para la aplicación de opsinas microbianas en optogenética.

    Palabras clave: bacteriorrodopsina canalrodopsina almacenamiento de datos optogenética membrana púrpura retina dos fotones.


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    Diseño atomístico de herramientas optogenéticas de desplazamiento azul basadas en opsina microbiana. / Kato, Hideaki E. Kamiya, Motoshi Sugo, Seiya Ito, Jumpei Taniguchi, Reiya Orito, Ayaka Hirata, Kunio Inutsuka, Ayumu Yamanaka, Akihiro Maturana, Andrés D. Ishitani, Ryuichiro Sudo, Yuki Hayashi, Shigehiko Nureki, Osamu.

    Resultado de la investigación: Contribución a la revista ›Artículo› revisión por pares

    T1 - Diseño atomístico de herramientas optogenéticas de desplazamiento al azul basadas en opsina microbiana

    N1 - Información de financiación: Agradecemos a A. Kurabayashi y Sawako Tabuchi por el apoyo técnico, y a los miembros del personal de la línea de luz en BL32XU de SPring-8 (Hyogo, Japón) por la ayuda técnica durante la recopilación de datos. También agradecemos a Keiichi Inoue por su ayuda con los experimentos AR3. Este trabajo fue apoyado financieramente por subvenciones del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón a S.H. (25104004 y 25291034), a Y.S. (23687019) y a O.N. (24227004), el Programa de Promoción de Investigaciones Básicas y Aplicadas para las Innovaciones en la Industria Bio-orientada y el Programa de Promoción de la Investigación en Ciencia y Tecnología para la Agricultura, Silvicultura, Pesca e Industria Alimentaria a S.H. Algunos cálculos se realizaron en el Centro de Investigación de Ciencias Computacionales, Okazaki, Japón. Copyright del editor: © 2015 Macmillan Publishers Limited. Reservados todos los derechos.

    N2 - Las opsinas microbianas con un cromóforo unido funcionan como transportadores de iones fotosensibles y se han empleado en optogenética para el control óptico de la actividad neuronal. La ingeniería molecular se ha utilizado para crear variantes de color para el aumento funcional de herramientas optogenéticas, pero estaba limitada por la complejidad de las interacciones proteína-cromóforo. Aquí informamos el desarrollo de variantes de color desplazadas al azul mediante un diseño racional a resolución atómica, logrado a través de simulaciones moleculares híbridas precisas, electrofisiología y cristalografía de rayos X. Los modelos de simulación molecular y la estructura cristalina revelan los cambios conformacionales diseñados con precisión del cromóforo inducidos por mutaciones combinatorias que encogen su sistema π-conjugado que, junto con la sintonización electrostática, producen grandes cambios al azul de los espectros de absorción en un máximo de 100 nm, mientras se mantiene actividades de transporte de iones fotosensibles. El principio de diseño que elaboramos es aplicable a otras opsinas microbianas y aclara el mecanismo molecular subyacente de los espectros de acción desplazados hacia el azul de las opsinas microbianas aisladas recientemente de fuentes naturales.

    AB - Las opsinas microbianas con un cromóforo unido funcionan como transportadores de iones fotosensibles y se han empleado en optogenética para el control óptico de la actividad neuronal. La ingeniería molecular se ha utilizado para crear variantes de color para el aumento funcional de herramientas optogenéticas, pero estaba limitada por la complejidad de las interacciones proteína-cromóforo. Aquí informamos el desarrollo de variantes de color desplazadas al azul mediante un diseño racional a resolución atómica, logrado a través de simulaciones moleculares híbridas precisas, electrofisiología y cristalografía de rayos X. Los modelos de simulación molecular y la estructura cristalina revelan los cambios conformacionales diseñados con precisión del cromóforo inducidos por mutaciones combinatorias que encogen su sistema π-conjugado que, junto con la sintonización electrostática, producen grandes cambios al azul de los espectros de absorción en un máximo de 100 nm, mientras se mantiene actividades de transporte de iones fotosensibles. El principio de diseño que elaboramos es aplicable a otras opsinas microbianas y aclara el mecanismo molecular subyacente de los espectros de acción desplazados hacia el azul de las opsinas microbianas aisladas recientemente de fuentes naturales.


    Registro de respuesta y entrega de luz

    Las tecnologías optimizadas para la entrega de luz y el registro de respuestas son vitales para la optogenética, dado el breve período de tiempo en el que ocurren las respuestas en las neuronas. Para experimentos optogenéticos en vivo, la luz se emite mediante un cable de fibra óptica o una fuente de luz de estado sólido a través de un dispositivo implantado o una ventana incrustada (Zorzos et al., 2010). Las longitudes de onda que pueden penetrar más profundamente en los tejidos son ideales para que los investigadores puedan estudiar incluso los tipos de células que se encuentran en las profundidades de los tejidos. Por ejemplo, las modificaciones recientes a la opsina NpHR han permitido su capacidad para responder a la luz roja / roja lejana (Zhang et al., 2008).

    Las respuestas de las células simuladas con luz se registran con optrodes que permiten lecturas rápidas de señales eléctricas (Nakamura et al., 2013). Es de gran importancia que estos optrodos puedan registrar señales eléctricas tan rápido como se emite la luz, hasta el milisegundo, para garantizar que las escalas de tiempo de la respuesta se capturen con precisión.

    A medida que más investigadores comienzan a jugar con la optogenética, la caja de herramientas crece y evoluciona. Esperamos nuevos y emocionantes hallazgos en neurociencia y más allá que continuarán emergiendo de la oscuridad.

    Lectura adicional:

    Deisseroth, K. Optogenética: controlar el cerebro con luz. Científico americano. 20 de octubre de 2010

    Yizhar, O., Fenno, L., Zhang, F., Hegemann, P., Deisseroth, K. (2011) Opsinas microbianas: una familia de herramientas de un solo componente para el control óptico de la actividad neuronal. En Helmchen, F., Konnerth, A., Yuste, R., editores. Imágenes en neurociencia: un manual de laboratorio. Cold Spring Harbor, Nueva York: Laboratorio de Cold Spring Harbor. 200 pp41_52.

    Karl Deisseroth, K. (2011) Optogenética. Métodos de la naturaleza. 8, 26-29. doi: 10.1038 / nmeth.f.324

    James Butler, J. Optogenética: iluminando el cerebro. Horizontes de Biosceince. 5, hzr020. doi: 10.1093 / biohorizons / hzr020

    Referencias:

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    Cómo los científicos están usando la tecnología

    Muchos laboratorios ahora están utilizando estas herramientas optogenéticas para impulsar o silenciar neuronas específicas dentro del cerebro, para descubrir cómo contribuyen al comportamiento o para determinar cómo contribuyen a los síntomas de los trastornos neuronales o las formas de superar los trastornos neuronales. Trabajando con distribuidores sin fines de lucro de virus, ADN y ratones transgénicos, nuestro grupo en el MIT ha distribuido estos reactivos a aproximadamente 500 grupos de investigación en todo el mundo. Como uno de los muchos ejemplos, los grupos han utilizado estas herramientas para activar y silenciar un pequeño grupo de neuronas, las neuronas hipocretina / orexina en el hipotálamo, en lo profundo del cerebro de ratones vivos, lo que demuestra que cuando se impulsan, resultan en el despertar de los ratones. 19 y cuando se silencian, hacen que los ratones se duerman. 20 Este tipo de estudio permite a los científicos identificar el papel causal que desempeñan neuronas específicas en el cerebro, revelando los principios de cómo funciona el cerebro. Además, la tecnología identifica células que podrían servir como objetivos de fármacos específicos para el desarrollo farmacéutico. Por ejemplo, es posible que los fármacos que modulan selectivamente esta población de células puedan ser útiles en el campo de la terapia de trastornos del sueño. En los últimos años, se han publicado estudios que identifican neuronas o vías involucradas con recompensa, ansiedad, lesión de la médula espinal y muchos otros comportamientos y trastornos cerebrales, revelando ambos principios del funcionamiento básico del cerebro, así como nuevos objetivos para los medicamentos o electrodos. utilizarse en el tratamiento de trastornos cerebrales.

    Algunos grupos también han propuesto que estas tecnologías podrían utilizarse directamente como tecnologías terapéuticas. Por ejemplo, muchas formas de ceguera humana implican la pérdida de fotorreceptores, células sensibles a la luz en la retina (el componente neural del ojo que recibe y procesa imágenes). Ningún fármaco clásico de molécula pequeña puede reemplazar los fotorreceptores perdidos. Sin embargo, tomando estas proteínas sensibles a la luz y entregándolas a las células restantes del ojo mediante una terapia génica, 15,21 es posible permitir que otras células recapitulen la función de recepción de imágenes perdida que normalmente realizan los fotorreceptores. Los ratones previamente ciegos, cuando se tratan con tales vectores de terapia génica, pueden hacer un uso cognitivo de la información visual, incluso resolviendo laberintos con su sentido de la visión restaurado. 22 La reciente demostración segura del uso de estas moléculas en el cerebro de primates no humanos puede, si se confirma mediante pruebas de seguridad continuas, ser un buen augurio para las terapias basadas en herramientas optogenéticas. 23 Los grupos ya han comenzado a explorar el uso del control óptico de precisión temporal para tratar, en modelos animales, otras enfermedades como la diabetes, el Parkinson y el dolor crónico.

    La capacidad de ingresar información con precisión en células específicas incrustadas dentro del sistema nervioso está abriendo la capacidad de determinar con precisión qué células hacen contribuciones críticas a los procesos relacionados con el comportamiento y los trastornos. Este conjunto de conocimientos revelará nuevos objetivos para el tratamiento clínico de los trastornos cerebrales, y la tecnología en sí puede eventualmente encontrar uso como un bloque de construcción de un nuevo conjunto de prótesis de control neural ultraprecisas.


    Ver el vídeo: Seminario de Facultad: Biología espacial de redes genéticas sintéticas.. (Agosto 2022).