Información

¿Hay problemas para llenar los tubos de PCR al máximo?

¿Hay problemas para llenar los tubos de PCR al máximo?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estoy planeando ampliar una reacción de PCR y me pregunto si llenar los tubos de PCR hasta el volumen máximo de 200 ul sería un problema. Significaría mucho menos pipeteo ya que solo necesitaría 1/4 de los tubos.

Los protocolos típicos que he visto siempre usan 50 ul para una reacción de PCR, me pregunto si hay algún problema con volúmenes más grandes, p. diferencias en la transferencia de calor, que podrían causar problemas si aumento el volumen en un tubo.

¿Es problemático aumentar el volumen? ¿Algún aspecto específico que deba considerar?


(También demasiado larga para un comentario). Esta pregunta me recordó una anécdota contada por Arthur Kornberg sobre el enfoque de ampliación que fue adoptado por Reiji Okazaki (descubridor de los fragmentos de Okazaki).

Aquí hay una cita tomada de Por el amor de las enzimas: la odisea de un bioquímico por Arthur Kornberg

El estilo de investigación de Reiji no se extrae fácilmente de sus publicaciones, pero está vivo en mi memoria. Un ejemplo al que llamo maniobra de Okazaki. Para purificar una enzima, utilizó un paso de calentamiento: se mantuvieron 10 mililitros de la solución de enzima en un tubo de ensayo a 70 ° C durante cinco minutos; luego, las impurezas coaguladas se eliminaron por centrifugación. Cuando llegó al punto de ampliar el procedimiento a varios litros, simplemente repitió el procedimiento de calentamiento original varios cientos de veces. Me avergonzó tener que informar sobre un procedimiento tan poco sofisticado en nuestra publicación. Pero luego me di cuenta de que podía completar este paso en unas pocas horas y no veía sentido en perder un tiempo y material preciosos para aprender a calentar en un vaso de precipitados grande o en un matraz. Más tarde, cuando otro de mis estudiantes purificó una enzima con un paso de calentamiento y tuvo que escalar su procedimiento 2,000 veces de 3 mililitros a 6 litros, le recomendé la maniobra de Okazaki: agregó 3 mililitros a cada uno de los 200 tubos de ensayo para llevar a cabo el paso de calentamiento y centrifugación, repitiendo el procedimiento nueve veces. Otro estudiante que intentó calentar un gran volumen de esta enzima en un solo paso lo perdió en un coágulo espeso.


Demasiado tiempo para un comentario: yo diría que depende del PCR. Personalmente he usado volúmenes máximos de 50 ul, si necesitaba preparar volúmenes más altos, hice una mezcla que luego se distribuyó a más tubos con 50 ul máx.

El problema con los grandes volúmenes es conseguir un calentamiento y enfriamiento rápido y homogéneo. Si el exterior del tubo es más rápido, la reacción allí ya comienza, mientras que este puede no ser el caso en el medio. Esto puede provocar una desnaturalización desigual y una amplificación de su plantilla. El último es especialmente problemático cuando amplifica secuencias cortas. Allí, es posible que el tiempo de amplificación ya haya terminado y el programa de PCR continúe antes de que finalice la plantilla, lo que dará como resultado una menor cantidad de su producto completo y el enriquecimiento de versiones más cortas.

Hay otro problema que puede ocurrir en reacciones grandes: debido a los gradientes de reactividad debido a los gradientes de temperatura, creo que es posible que los reactivos (dNTP, iones de Mg) puedan formar gradientes que inhiban aún más un buen rendimiento.

Finalmente probé una cosa en una de nuestras máquinas de PCR: el tubo de PCR se coloca en el bloque de calentamiento / enfriamiento. No está completamente asentado en el bloque sino que sobresale parcialmente, por lo que si lo llena hasta su capacidad máxima, los 75-100ul superiores (aproximadamente) quedarían fuera del bloque calefactor y tendremos un problema térmico. La mezcla de reacción allí solo se calentaría debido a la convección.


Producción de reactivos de biología molecular sin purificación.

Afiliaciones Departamento de Biociencias Moleculares, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América, Centro de Sistemas y Biología Sintética, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América

Roles Análisis formal, investigación, metodología, validación, visualización, redacción: revisión y edición

Iniciativa de investigación para estudiantes de primer año de afiliación, DIY Diagnostics Stream, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América

Roles Metodología, recursos, visualización, redacción: revisión y edición

Iniciativa de investigación para estudiantes de primer año de afiliación, DIY Diagnostics Stream, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América

Roles Metodología, Recursos

Afiliaciones Departamento de Biociencias Moleculares, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América, Centro de Sistemas y Biología Sintética, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América

Roles Análisis formal, investigación, metodología, validación, redacción: revisión y edición

Afiliación Mboalab Biotech, Yaundé, Camerún

Roles Conceptualización, Análisis formal, Investigación, Metodología, Recursos, Supervisión, Validación, Visualización, Redacción - revisión y edición

Departamento de afiliación de ingeniería química y biotecnología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Roles Análisis formal, investigación, metodología, validación, redacción: revisión y edición

Affiliation Hive Biolab, Kumasi, Ghana

Afiliaciones Departamento de Biociencias Moleculares, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América, Centro de Sistemas y Biología Sintética, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América

Afiliaciones Departamento de Biociencias Moleculares, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América, Centro de Sistemas y Biología Sintética, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América

Conceptualización de roles, Análisis formal, Adquisición de fondos, Metodología, Administración de proyectos, Supervisión, Validación, Visualización, Redacción - revisión y edición

Departamento de afiliación de ingeniería química y biotecnología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Conceptualización de roles, adquisición de fondos, administración de proyectos, supervisión, redacción: revisión y edición

Afiliaciones Departamento de Biociencias Moleculares, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América, Centro de Sistemas y Biología Sintética, Universidad de Texas en Austin, Austin, Texas, Estados Unidos de América


Requisitos de muestra de TapeStation y amp Bioanalyzer

Debido a los frecuentes pedidos pendientes de reactivos de TapeStation, las muestras pueden procesarse en el bioanalizador. Puede haber un retraso en la devolución de datos mientras intentamos conservar los reactivos de TapeStation y Bioanalyzer agrupando las muestras para un procesamiento eficiente. Cuando los resultados se publiquen en Genomics Depot, un miembro del personal de Genomics Core se lo notificará por correo electrónico.

Se suspenderá el precio normal de las ejecuciones de Bioanalyzer, y el costo por muestra seguirá el precio del análisis de TapeStation. Las muestras de ARN totales se analizarán por $ 9 cada una. El ADN fragmentado, los productos de PCR de ADNdc y las bibliotecas preparadas con un tamaño & lt1000 pb se procesarán por $ 9 cada una. El ADN fragmentado, los productos de PCR de dsDNA y las bibliotecas preparadas con un tamaño de hasta 1000 pb o superior (por ejemplo, bibliotecas de ADNc o ATAC-seq) se procesarán por $ 13 cada una.

Tenga en cuenta que las muestras de ARN total de la planta se pueden analizar con la configuración eucariota no vegetal, lo que afectará el cálculo automático de la puntuación RIN. El Genomics Core tendrá esto en cuenta al evaluar la calidad de las muestras que se envían para la preparación de la biblioteca.

Póngase en contacto con [email protected] si tiene alguna pregunta sobre el análisis de TapeStation / Bioanalyzer.

El Genomics Core tiene una TapeStation Agilent 4200 y un Bioanalizador Agilent 2100. Ambos instrumentos utilizan electroforesis automatizada para evaluar la calidad y cantidad de ADN y ARN.

El Genomics Core tiene una TapeStation Agilent 4200 y un Bioanalizador Agilent 2100. Ambos instrumentos utilizan electroforesis automatizada para evaluar la calidad y cantidad de ADN y ARN. Con estos instrumentos, Genomics Core puede proporcionar análisis de ARN total, bibliotecas preparadas, productos de PCR de ADNdc, ADN fragmentado y ADN genómico de alto peso molecular.

Todas las muestras se procesarán en TapeStation, a menos que se solicite lo contrario. La única excepción es el ARN total que se enviará para la preparación de bibliotecas de ARN pequeño o micro ARN. Estas muestras se analizarán en el bioanalizador porque es más sensible a las especies de ARN pequeño y micro ARN.

El análisis de 4200 TapeStation se realiza en un ScreenTape que tiene carriles direccionables individualmente, donde se procesa 1 muestra por carril. Esto permite el análisis de 1 o más muestras a la vez. El análisis de TapeStation se vende por muestra.

El análisis del Bioanalizador 2100 se realiza en un chip que contiene 11 pozos, lo que permite el análisis de 1 a 11 muestras. Con el bioanalizador, se utilizan reactivos para 11 muestras incluso si se analizan menos de 11 muestras. Por lo tanto, el análisis de Bioanalyzer se vende por chip (de 1 a 11 muestras).

Las concentraciones de la muestra deben medirse mediante un método fluorimétrico, como Qubit o PicoGreen.

La siguiente tabla describe las especificaciones para enviar muestras al Genomics Core para su análisis en TapeStation o Bioanalyzer.


Análisis de ácidos nucleicos en el laboratorio clínico.

Métodos de enriquecimiento basados ​​en amplificación

Los métodos NGS basados ​​en amplicones utilizan la PCR para generar las bibliotecas de secuenciación y son ideales para secuenciar solo ROI específicas (figura 13.11A). Son ideales cuando se analizan tejidos archivados que tienen material limitado y se basan en conjuntos de cebadores cuidadosamente diseñados para evitar o minimizar la amplificación de pseudogenes (o regiones genómicas con alta homología de secuencia con el ROI). Actualmente se utilizan al menos cuatro métodos de preparación de bibliotecas basados ​​en amplicones para la preparación y el enriquecimiento de secuencias diana de interés: PCR multiplex, PCR de un solo plex, captura dirigida seguida de PCR multiplex y PCR multiplex anclada [46,48]. Las estrategias de enriquecimiento basadas en amplicones pueden lograr una cobertura del 100% de una región con poca secuencia fuera del objetivo, ya que las coordenadas de inicio y parada de cada amplicón están predeterminadas. Sin embargo, una limitación del enriquecimiento de la diana basado en la amplificación es su susceptibilidad a la pérdida de alelos, lo que puede dar lugar a llamadas falsas negativas. El abandono del alelo se produce cuando la variante se localiza en el sitio de unión del cebador, lo que conduce a una amplificación fallida y un sesgo alélico [49].

Figura 13.11. Representación esquemática de las diferencias entre (A) la preparación de la biblioteca basada en amplicones y (B) la preparación de la biblioteca basada en la hibridación.


PROTOCOLO DE APOYO 1

DETERMINACIÓN DE LAS TEMPERATURAS DE FUSIÓN A PARTIR DEL AJUSTE NO LINEAL DE LOS DATOS DE DENATURACIÓN TÉRMICA

Este protocolo de soporte describe los pasos necesarios para completar el ajuste no lineal básico de las curvas de desnaturalización térmica para derivar las temperaturas de fusión (Figura 3). Un método alternativo para estimar las temperaturas de fusión implica calcular la primera derivada de la emisión de fluorescencia con respecto a la temperatura, como se muestra en la Figura 3c (que no se cubre en esta unidad).

Datos y análisis típicos del ensayo de cambio térmico. (A) Un perfil de desnaturalización térmica típico de una proteína recombinante. La baja fluorescencia a temperatura ambiente indica una proteína bien plegada. La emisión de fluorescencia aumenta con el aumento de la temperatura, dando lugar a una curva sigmoidea que representa el despliegue cooperativo de la proteína. La agregación post-pico de proteína: complejos de colorante conduce a la extinción de la señal de fluorescencia. (B) El procesamiento automatizado de las curvas de desnaturalización térmica trunca el conjunto de datos para eliminar la extinción posterior al pico. Las curvas sigmoideas resultantes se someten a un ajuste no lineal a una ecuación de Boltzmann para identificar la temperatura de fusión, o Tmetro, que ocurre en el punto medio del desarrollo de la transición. La línea gris representa el ajuste no lineal de la curva de fluorescencia a la ecuación de Boltzmann. (C) Alternativamente, el Tmetro se identifica fácilmente trazando la primera derivada de la emisión de fluorescencia en función de la temperatura (& # x02212dF / dT). Aquí el Tmetro se representa como la parte más baja de la curva.

Materiales

Software de Excel (Microsoft Office, Microsoft, Inc.)

Software de gráficos (por ejemplo, GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software, Inc.)

Truncar la fluorescencia posterior al pico

Abra el archivo csv que contiene datos de fluorescencia sin procesar del instrumento de PCR en tiempo real en Excel. Los datos deben estar en formato de columna donde cada columna representa una condición de solución diferente y cada fila proporciona la emisión de fluorescencia a una temperatura diferente de 25 & # x000b0C a 95 & # x000b0C. Agregue etiquetas con las condiciones de la solución a las columnas de datos, si lo desea. Etiquete la hoja como & # x02018Raw Data & # x02019.

Cree una nueva hoja dentro del cuaderno de Excel. Copie los datos sin procesar y las etiquetas en la nueva hoja. Etiquete la hoja como & # x02018Truncated Data & # x02019.

Cree una nueva macro & # x02018deleteaftermax & # x02019 en Excel ingresando el texto en el Archivo Suplementario 1 con formato intacto. Ejecute la macro & # x02018deleteaftermax & # x02019 en el conjunto de datos truncado siguiendo los protocolos estándar de Excel.

Esta macro encuentra el valor numérico máximo dentro de una columna de datos y borra todos los puntos de datos dos filas después de este máximo.

Ajuste no lineal de datos de fluorescencia truncados

Abra un programa de software de gráficos que pueda realizar un ajuste no lineal (por ejemplo, GraphPad Prism). Copie los datos truncados en un nuevo archivo para su análisis.

Realice un ajuste no lineal del conjunto de datos truncado a una curva sigmoidal de Boltzmann con la siguiente ecuación:

donde Y = emisión de fluorescencia en unidades arbitrarias X = temperatura Inferior = fluorescencia de línea base a baja temperatura Superior = fluorescencia máxima en la parte superior del conjunto de datos truncado Pendiente = describe la pendiente de la curva, con valores más grandes que denotan curvas menos profundas y Tmetro = temperatura de fusión de la proteína.

Al eliminar la extinción de fluorescencia posterior al pico con la macro en el paso anterior, el ajuste no lineal con la ecuación sigmoidal de Boltzmann proporciona mejores ajustes para la Tmetro basado en mejores estimaciones de fluorescencia máxima.

El software de gráficos proporcionará valores de ajuste para cada uno de los parámetros de la ecuación, así como errores estándar y los intervalos de confianza del 95% para el análisis de datos.

Las curvas de desnaturalización térmica que se ajustan a los perfiles ideales (fluorescencia de línea base baja, transición sigmoidea durante la desnaturalización, etc.) generalmente dan Tmetro encaja con errores estándar & # x02264 0.3 & # x000b0C.

Trama Tmetros en función de las condiciones de la solución o realizar análisis posteriores para examinar el desplazamiento térmico en función de las condiciones cambiantes de la solución en relación con un tampón estándar (es decir, calcular el cambio en la temperatura de fusión, & # x00394Tmetro).

Es útil definir una condición de solución de línea de base (una condición de tampón usada previamente) como la T de línea de basemetro y examinar la Tmetro de las condiciones de la solución en relación con este Tmetro.


Coronavirus: miles de pruebas de laboratorio no resultan claras, lo que aumenta la posibilidad de retrasos perjudiciales

Los expertos en salud pública advierten que un cambio lento en el diagnóstico de pacientes con COVID-19 podría socavar los esfuerzos de rastreo de contactos.

Miércoles 27 de mayo de 2020 10:25, Reino Unido

Miles de pruebas de coronavirus realizadas en el principal laboratorio de pruebas del gobierno no producen un resultado claro, puede revelar Sky News, lo que obliga a las personas a esperar días mientras se vuelven a realizar las pruebas.

Sky News ha sabido que el 4% de las pruebas de hisopo realizadas en el principal laboratorio de pruebas del gobierno en Milton Keynes se declaran "poco claras" debido a las limitaciones en el proceso de pruebas químicas.

Las pruebas también pueden fallar en producir un resultado claro si no se administran correctamente, si hay un retraso en su transporte al laboratorio o si hay problemas con el etiquetado, los códigos de barras o el empaque.

Rastreador de coronavirus en el Reino Unido: cuántos casos hay en su área

No se sabe cuántas pruebas en total no son concluyentes, pero el primer ministro Boris Johnson ha prometido aumentar la capacidad de prueba en la red de pruebas a 200.000 por día para fin de mes.

Esto significa que al menos 8.000 pruebas al día podrían resultar poco claras, o 56.000 a la semana.

Los científicos dijeron que los resultados poco claros eran una parte normal del proceso de prueba, pero los expertos en salud pública advirtieron que los retrasos en la entrega de los resultados a las personas podrían socavar el sistema de prueba, seguimiento y localización del gobierno, que se espera que se lance la próxima semana.

Cuando una prueba no produce un resultado claro, se pide a las personas que la repitan. Se les envía un mensaje de texto que dice:

Más sobre Covid-19

COVID-19: Boris Johnson dice que 2021 será un año 'difícil' para los viajes internacionales 'pase lo que pase' con el coronavirus

COVID-19: Nicola Sturgeon acusa a Andy Burnham de 'generar disputa' con ella por la prohibición de viajar al Gran Manchester

COVID-19: Boris Johnson dice que se ve bien para el 19 de julio, pero no descarta más cierres en el invierno

Billy Gilmour: el centrocampista escocés se perderá el último partido de la fase de grupos de la Eurocopa 2020 contra Croacia después de una prueba de COVID positiva

COVID-19: El gobierno busca eliminar las reglas de autoaislamiento de 10 días para las personas que han recibido dos golpes, dice Matt Hancock

COVID-19: Es improbable que se levanten las restricciones restantes en Inglaterra a principios del 5 de julio: ministro

"Tu COVID-19 la prueba ha vuelto INCIERTA. Busque una prueba repetida a través de la ruta que utilizó anteriormente ".

Luego se les aconseja que se aíslen por sí mismos si continúan teniendo síntomas.

Un científico que asesoraba al gobierno sobre su aplicación de rastreo de contactos dijo que los retrasos en el diagnóstico dificultaban el rastreo de contactos.

"Para que el rastreo de contactos funcione, tiene que ser rápido", dijo David Bonsall, investigador del Big Data Institute de Oxford.

"No tiene sentido el rastreo de contactos si está rastreando personas y encontrando individuos después de que hayan infectado a otros, debe ponerse al día con el virus.

"Es el virus el que determina la rapidez con la que se deben realizar las pruebas y, de hecho, debe ser muy rápido".

Cuando Sky News habló con personas que habían recibido resultados de pruebas poco claros, dijeron que el sistema podría ser terriblemente lento.

"Me dijeron que recibiría mis resultados en cinco días, pero en realidad les tomó 16 días decirme que los resultados no estaban claros", dijo Chris Dunne.

"Dijeron que debería hacerme la prueba de nuevo, pero lo vi como bastante inútil porque dice que el mejor momento para hacerme la prueba es dentro de los tres días posteriores a la aparición de los síntomas".

Kelly, que no dio su nombre completo, dijo que le había tomado "dos semanas" a su madre obtener el resultado de su prueba, que no resultó claro.

"En ese tiempo tuvimos que llamar a los paramédicos dos veces y la segunda vez fue admitida en el hospital de Whiston para recibir tratamiento", dijo.

"Se le hizo la prueba allí, dos veces, pero el médico advirtió que probablemente sería negativo, ya que lo fue el día 12 de sus síntomas".

Matt Waller, que trabaja en North Cumbria University Hospitals NHS Trust, recibió un resultado de prueba poco claro 11 días después de su prueba, que tomó porque su pareja tenía síntomas de COVID.

"Me puso un poco ansioso porque en ese momento había trabajado un puñado de turnos en dos departamentos de A&E en mi confianza viendo pacientes y trabajando junto al personal que se consideraría en riesgo", dijo.

"Todavía estaba asintomático, pero decidí ponerme en contacto con mi departamento de salud ocupacional. Acordaron hacerme un hisopo sobre la base de la prueba no concluyente. Me tomaron un hisopo este lunes y el resultado fue negativo el 19. Todo se sintió muy inconsistente".

Un portavoz del Departamento de Salud y Atención Social le dijo a Sky News:

"Tenemos plena confianza en la confiabilidad de nuestras pruebas y nuestros científicos altamente capacitados hacen todo lo posible para asegurarse de que los resultados no concluyentes sean extremadamente raros. Los resultados de las pruebas no concluyentes ocurren con las pruebas para cualquier virus".

"Más de 1.8 millones de personas ya se han sometido a pruebas y la gran mayoría no ha tenido problemas con los resultados de sus pruebas", agregaron.

Rupert Beale, un científico del Crick Institute de Londres que realiza pruebas de COVID-19, dijo que era normal que cualquier proceso de prueba produjera resultados poco claros.

"Por lo general, significa que había una carga viral muy baja o que no había carga viral y no se podía notar la diferencia entre ellos", dijo.

"Realmente se trata de los límites del proceso de prueba".

Cuando se le preguntó si el consejo del gobierno de aislarse a sí mismo si los síntomas continuaban era sensato, el Dr. Beale dijo que "parece muy razonable".

"Todos los laboratorios son increíblemente buenos para detectar una gran cantidad de virus y, en cierto modo, eso es lo importante para limitar la propagación".


PRINCIPIOS Y APLICACIONES EN MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

La capacidad de identificar con precisión los microorganismos es fundamental para todos los aspectos de la epidemiología y el diagnóstico de hongos. En fitopatología, la identificación temprana de agentes causantes de enfermedades es esencial para el reconocimiento de patógenos (60). En los últimos diez años, se han realizado avances en el diagnóstico molecular de hongos a través de la tecnología de PCR. A diferencia de los métodos convencionales, las muestras pueden analizarse directamente mediante PCR y aislarse sin necesidad de cultivos. La técnica es rápida y muy específica. Puede usarse para detectar trazas de ADN fúngico de muestras ambientales antes de que ocurran los síntomas. Por lo tanto, permite la implementación de métodos de control temprano de enfermedades. La PCR se puede realizar de forma rutinaria y no requiere habilidades especializadas para interpretar los resultados. La tecnología también puede ofrecer datos cuantitativos más precisos, proporcionando información adicional necesaria para la toma de decisiones y la evaluación de la eficacia de los agentes fúngicos en el control biológico. Desde su introducción a mediados de la década de 1980, la PCR se ha convertido en la piedra angular de la tecnología del ADN y ha despejado el camino para la creación de innumerables tecnologías asociadas. Es notable por su capacidad para detectar cantidades de ADN amplificado a partir de una o pocas secuencias originales. La PCR convencional no es cuantitativa, sino cualitativa. Se ha utilizado para detectar, monitorear e identificar hongos a partir de un conjunto completo de muestras ambientales y es el núcleo del diagnóstico molecular de hongos (4).

PCR fluorescente en el lugar utiliza cebadores o sondas marcados con fluorescencia para detectar y localizar hongos en muestras ambientales fijas después de la semipermeabilización (102). La fluorescencia de los cebadores o sondas se detecta utilizando un microscopio confocal. Esta técnica permite la detección directa del organismo en la muestra. También muestra la distribución espacial, las interacciones con el huésped y otros organismos. Bago, Piche, Simon (5) de ocasión en el lugar PCR para detectar y localizar infecciones causadas por hongos micorrizas arbusculares. El alcance de la PCR es infinito (5). Puede usarse para investigar una sola especie o comunidades enteras (22,35,80).

Pneumocystis jiroveci (un hongo previamente denominado Pneumocystis carinii) puede causar neumonía grave en pacientes infectados por el VIH o inmunosuprimidos, pero su detección se limita a la microscopía de muestras en el tracto respiratorio. Microscopía para la detección de P. jiroveci generalmente implica el uso de tintes. La inmunofluorescencia es más sensible que estas tinciones, pero es más cara y requiere instalaciones especializadas. La PCR es más sensible, especialmente en pacientes no infectados por el VIH, y por tanto puede ser de considerable utilidad (36). La especificidad de la PCR es limitada, pero como este microorganismo es un comensal omnipresente, puede detectarse mediante PCR en ausencia de la enfermedad (37).

Otro ejemplo del uso de la tecnología de PCR en micología es la detección de infección por Aspergilo ssp. en pacientes con neutropenia. Esta enfermedad es notoriamente difícil de diagnosticar debido a la poca sensibilidad del método de cultivo y la dificultad de encontrar muestras histopatológicas en individuos con recuentos plaquetarios bajos. El tratamiento temprano es esencial para lograr los mejores resultados. La PCR puede reducir el tiempo necesario para el diagnóstico específico (111). La PCR en tiempo real se ha utilizado con éxito para cuantificar el número de patógenos (7,13,21,112), ayudando así en las decisiones sobre cómo tratar las enfermedades fúngicas y evaluar los efectos de los hongos (57).

El diagnóstico parasitológico puede ser asistido por métodos moleculares. Muchos parásitos no se pueden cultivar en el laboratorio y el diagnóstico se basa principalmente en la serología y la microscopía relativamente menos sensible. La microscopía sigue siendo un apoyo para el diagnóstico de la malaria, pero debido a su mayor sensibilidad, la PCR puede diagnosticar esta enfermedad incluso en situaciones difíciles. Las especies de Plasmodium también se pueden detectar en diferentes infecciones, lo que puede dificultar el discernimiento microscópico (99)


Utilice sus habilidades de laboratorio en NHS Test and Trace Lighthouse Laboratories

Prueba y rastreo del NHS está ampliando su red de laboratorios en el esfuerzo continuo contra COVID-19. A medida que el Reino Unido entra en los meses de invierno, es fundamental seguir aumentando la capacidad de los laboratorios. Ellos se han puesto en contacto con la Sociedad Británica de Inmunología para solicitar ayuda de personas con habilidades de laboratorio para aumentar el programa de pruebas durante la pandemia de COVID-19. Hay una serie de roles desde puestos junior, incluidos estudiantes con alguna experiencia previa en laboratorio, hasta puestos superiores con experiencia en gestión de laboratorio.

Buscan personas que:

  • tener experiencia en administración de laboratorio y / o ser un BMS registrado en HCPC
  • tener experiencia trabajando en un entorno de laboratorio (académico, clínico o industrial), independientemente del nivel
  • Tener un título o título de posgrado en una disciplina biológica.
  • Técnicos, postdoctorados y estudiantes de posgrado con experiencia en biología molecular, para unirse a los laboratorios de faro existentes en Milton Keynes, Cambridge, Manchester, Newport, Charnwood y Glasgow. Necesitan más de 400 técnicos de inmediato, preferiblemente familiarizados con las técnicas de ensayo de PCR (qRT-PCR y ePCR)
  • o es un estudiante actual con alguna experiencia previa en laboratorio, particularmente en virología, microbiología o ciencias biomédicas y está buscando un empleo a tiempo parcial. Los requisitos mínimos son experiencia en pipeteo y operación dentro de gabinetes de bioseguridad.

Las vacantes están disponibles de forma temporal, permanente, a tiempo completo o parcial, y se consideran tanto colocaciones a corto plazo (a partir de 1 mes) como puestos a más largo plazo (hasta 18 meses).

Ayúdenos a difundir las noticias de estas vacantes transmitiéndolas a otras personas, grupos o redes con calificaciones y habilidades relevantes.

Puede inscribirse en el Programa Nacional de Pruebas aquí. Hay roles en todo el Reino Unido que pueden ser de interés para una amplia gama de personas con diversos grados de habilidades y calificaciones. Los roles están disponibles de forma temporal, permanente a tiempo parcial y a tiempo completo.


Introducción a la secuenciación del ADN para el urólogo en ejercicio

¿Se ha preguntado alguna vez qué le sucede exactamente a la muestra de un paciente cuando desaparece en el éter de un laboratorio? De repente, un informe lleno de resultados aparece mágicamente en el archivo de su paciente, pero ¿qué sucede durante ese período desconocido? La respuesta es: mucho. Esa muestra atraviesa un complejo viaje molecular.

Este artículo lo guiará a través de la historia de la secuenciación genética y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde se encuentran hoy, tocará los microarrays, explicará la terminología estándar y las preguntas que plantean esos términos, además de describir el flujo de trabajo del laboratorio clínico.

Secuenciación de ADN y Sanger

En el mundo de las pruebas moleculares de hoy, hay 2 aplicaciones muy comunes: secuenciación y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR). El primer método de secuenciación, conocido como secuenciación de Sanger, fue fundado por Frederick Sanger, PhD,
1 de 2 personas gana un premio Nobel dos veces en la misma categoría. Se le considera un pionero de la secuenciación del ADN por su trabajo con Walter Gilbert, PhD. 1 Antes de su trabajo, la mayor parte de la investigación se realizó sobre el ARN, que es monocatenario y se manipulaba fácilmente con enzimas RNasa que cortan secuencias de nucleótidos muy específicas.

Con su descubrimiento del ADN, Watson y Crick notaron que los nucleótidos forman los componentes básicos y que la adenina se une a la timina y la citosina se une a la guanina para formar un par de bases (pb). Estos nucleótidos se denominan desoxinucleótidos, lo que significa que les falta un grupo hidroxilo. En la secuenciación, para interrogar y "leer" los genes y el ADN de interés, se leen e identifican los pares de bases. La secuenciación de Sanger decidió lanzar una llave inglesa en una pequeña porción de esos nucleótidos y convertirlos en didesoxinucleótidos, eliminando otro grupo hidroxilo. Cuando se agregan esos didesoxinucleótidos, la secuenciación se detiene inmediatamente. Imagina que estás construyendo una torre de Lego con piezas de tamaño regular de 2 por 4 pero mezcladas en aproximadamente un 10% de piezas planas e irregulares donde no hay protuberancias en la parte superior para agregar más piezas. Así es como funcionan los didesoxinucleótidos. Impiden que tu torre de Lego crezca.

La secuenciación de Sanger fue tan revolucionaria e importante en ese momento, y durante los siguientes 20 años, se usó en el Proyecto Genoma Humano. 2 Al superponer las secuencias, el genoma humano se construyó entre 500 y 600 pb a la vez, siendo la secuenciación de Sanger un aspecto crítico de todo el proyecto. El método todavía se utiliza hasta el día de hoy para obtener resultados de secuenciación muy rápidos y económicos y porciones del genoma difíciles de secuenciar.

Secuenciación de próxima generación

Como ocurre con cualquier tecnología, las empresas buscan mejorar la velocidad, la precisión y el costo de un ensayo. Ha habido algunas iteraciones del siguiente paso más allá de Sanger, pero el que se ha vuelto dominante se llama secuenciación de próxima generación (NGS), anteriormente conocida como secuenciación masivamente paralela. Hoy en día, existen 2 versiones de secuenciación: lecturas cortas (Illumina) y lecturas largas (Pacific Biosciences y Oxford Nanopore). Las lecturas cortas alcanzan los 600 pb juntas en una sola ejecución, mientras que las lecturas largas pueden ir más allá de los 10.000 pb a la vez, con algunas lecturas de millones de pb. Para poner esto en perspectiva, el BRCA2 La proteína tiene aproximadamente 3000 aminoácidos de longitud. Por definición, un aminoácido está codificado por 3 pares de bases y cada base tiene 2 nucleótidos. Por lo tanto, hay más de 9000 pb (18000 nucleótidos) en el BRCA2 gene.

NGS de lectura corta utiliza una celda de flujo para hibridar trozos cortos de ADN, replicar ese ADN y luego copiarlo una y otra vez, a veces cientos de veces. Cada nucleótido es fluorescente y se activará al leerlo, lo que permitirá que ese nucleótido se agregue a la secuencia. ¿Recuerda Lite-Brites cuando era niño? Pondría pequeñas piezas en un tablero negro con agujeros, y las piezas brillarían posteriormente. Imagínese tener 1 Lite-Brite como plantilla e intentar copiar la misma imagen cientos de veces, y cada vez que agrega una pieza, se ilumina con un color específico asignado a esa luz, o en este caso, nucleótido. En el camino, constantemente comete un error en el mismo lugar exacto. Debido a que la consistencia de esa luz es incorrecta, eso no es solo un error. En cambio, eso se convierte en una posibilidad de diagnóstico interesante porque esa muestra de paciente tiene una mutación.

Hay 2 formas comunes de usar NGS de lectura corta: secuenciación del genoma completo (WGS) y secuenciación dirigida, también conocida como secuenciación de amplicones o secuenciación de panel. WGS se refiere simplemente a eso: secuenciar todo el genoma a un cierto nivel de cobertura, que es la frecuencia con la que lee un par de bases en comparación con el genoma de referencia. Most of the time, 30 times coverage, meaning each base pair on average was read 30 times, is sufficient for nondisease applications. Gene panel sequencing looks at a specific subset of known disease genes, at a much greater coverage, up to 1000 times but mostly 500 to 600 times. For example, a provider may want to run a gene panel on a patient with a history of colorectal cancer to determine whether there is a hereditary component. Genes included in this panel would include MSH1, PMS2, MLH2, MSH6, EpCAM, all of which are associated with Lynch syndrome, as well as APC y MUTYH, which are associated with other syndromic patterns where colorectal cancers are common. 3 Prostate cancer–specific panels will often include BRCA1, BRCA2, ATM, CHEK2, PALB2, HOXB13, y otros.

Long reads act a little differently from short reads. Instead of creating many short copies on a chip, long reads use a very large circular sequence of DNA and continuously run it through a mechanism, such as a protein pore, to consistently read the same DNA over and over. Comparatively, this is like copying a Lego tower repeatedly using the same colors in the same order vs riding a Ferris wheel and having the operator check each cab every time it passes the bottom. Long reads will catch the same errors as short reads, but also provide some structural variant support and help getting through more difficult areas to read. This allows for some deeper understanding of possible disease states and their proximity to other possible issues.

Quantitative PCR

Kary Mullis, PhD, was a chemist at Cetus Corporation. One night while driving around Mendocino County with his girlfriend, also a chemist at Cetus, he recognized that DNA base pairs were constant in their pairing, and had a random thought to match/hybridize short pieces of DNA that were complementary to long pieces of DNA plus DNA polymerase. This matching added nucleotides to a piece of DNA. 4 This allowed a short piece of DNA to be amplified repeatedly using different temperatures, creating billions of copies over many cycles, which would then be studied on an agarose gel (Figure 1). Hence, PCR was invented. Mullis was awarded the Nobel Prize in 1993 for this groundbreaking invention, which led to so many discoveries in science. Around the same time, Higuchi et al discovered that increasing amounts of DNA could be directly studied using a fluorescent marker without the need for agarose gel. 5 And voilà! qPCR was invented.

In order to use qPCR in diagnostics, the clinic has to know which specific gene is of interest, as the primers have to flank the target sequence to be amplified. The high specificity of this type of assay is both a blessing and a hindrance. It’s a blessing because the clinic can answer a diagnostic question with high confidence but a hindrance because it may miss other possible disease states that are outside the targeted region. Most of the time, a sample will be split up to run multiple different assays at the same time to cover a wider array of diseases. qPCR is also very commonly used to get to the heart of urinary tract infections (UTIs) and their persistent nature. Many companies are offering qPCR diagnostics for UTIs, prostatitis, and more. 6 Most of the time, those companies will also offer an NGS panel in addition to cover all diagnostic bases.

Microarrays

Microarrays are small chips with imprinted specific DNA targets of interest (Figura 2). The test is run with a reference sample, often labeled with a green fluorescent dye, and the targeted DNA sample, labeled with a red fluorescent dye. Both are then hybridized to the chip, and a comparative analysis is done. If the targeted DNA is expressed at a higher rate, that small area will glow red. If the control DNA is expressed higher (or decreased expression in the target DNA), it will glow green. Finally, if expressed in equal amounts, essentially no mutation, the square will glow yellow. 8 The sensitivity is generally low, but the ability to study many targets at once is a highlight. Microarrays are a common technique of many companies that offer testing for determining cultural heritage. Those companies will study up to 700,000 targets at 1 time. However, microarrays are slowly declining because of the greater adoption of NGS assays. These direct-to-consumer companies are really fun and interesting for those who are seeking information about their ancestry but should not be used for cancer risk assessment.

What happens to a sample in the clinical lab?

When a patient has a sample sent for molecular testing, whether it’s tissue, urine, blood, or saliva, that specimen is immediately tagged with a number specific to that patient. The sample is transported to the lab with the appropriate storage. The lab receives the sample and inputs it into their system, also called accessioning. Then, the molecular journey is as follows:

Nucleic acid isolation: convert RNA to DNA if needed

una. Sonication or enzyme digestion to create uniform DNA segments

B. Enrich the target DNA if needed, as target enrichment and amplicon generation workflows used in gene panels

C. Barcode ligation: also known as multiplexing, which is adding unique markers per patient sample so they can be mixed together, then parsed upon software analysis

D. Adapter ligation: allows the DNA to bind to the flow cell

Sequence the DNA: 0.5 days to several days, depending on sequencing type and instrument used

Bioinformatics: Results are parsed and analyzed.

Report generated: Details around the disease state are provided, and sometimes potential treatment scenarios depending on the software’s FDA approvals

What does a clinical laboratory look for in their tests?

Although you’ve learned about generic methods and workflows, labs look for specific issues using molecular methods that cause various disease states. In this section, I’ll lay out a few of the more common terms in the lexicon of genomic testing.

Single-nucleotide polymorphism (SNP). As the name implies and by definition, this occurs when a single nucleotide change is identified in a particular gene and present in 1% of the population. This SNP results in a gene mutation but may or may not cause an alteration of downstream protein function, depending on whether the change affects the specific amino acid in which it is coding. There is significant interest in looking at a panel of SNPs to determine risk assessment for breast and prostate cancer.

Copy number variation. This is a duplication or deletion of a sequence of nucleotides, not just a single nucleotide like an SNP. Most genes in the human genome have 2 alleles, 1 each inherited from your mother and father. In rare instances, short sequences can be replicated many times. Por ejemplo, el HTT gene codes for the protein huntingtin. In this case, the trinucleotide CAG can be repeated 36 times or more. The result is abnormal protein production, which can then lead to Huntington disease. 7

In other cases, entire genes can be repeated or deleted, causing overexpression or underexpression, as in the case of α-amylase 1 and its overexpression because of dietary differences. 8 The largest example of this is the trisomy issues that cause Down syndrome.

Gene fusions. Fusions occurs when 2 genes fuse during replication, causing a pseudogene that creates expression issues. One of the earliest discovered examples of this is a reciprocal translocation where the ABL1 gene of chromosome 9 is translocated and fuses to the BCR gene on chromosome 22, causing a BCR-ABL1 gene (the Philadelphia chromosome), which induces chronic myeloid leukemia.9 This is difficult to detect using molecular testing because there are various fusion loci on each gene, but it can be done with proper techniques, such as digital PCR and NGS.

This partial list of 3 common issues is just a sample of what a molecular lab can discover. Some tests are more involved than others from a workflow and difficulty perspective, whereas others are fairly straightforward. The most challenging part for a lab is to discern the ability of a specific assay type to get the proper answer because some answers are much more difficult to come by.

Conclusiones

The world of clinical diagnostics is changing. The development of targeted therapies is increasingly more specific to various molecular changes that are therapeutic resistance drivers. The development of companion diagnostics so patients can receive these new agents is mandatory. In addition, the ability to detect and potentially mitigate disease at a much earlier stage before systemic/metastatic disease has clear upside potential. Therefore, embracing and understanding these new and emerging molecular techniques will improve your patient outcomes and enhance your practice.

Wright has been involved in biotech and clinical sales and marketing for nearly 20 years. He has a Master’s in molecular biology from Washington University in St. Louis and an MBA in strategy and operations from Boston University. He has worked for companies such as Thermo Fisher and Illumina and has started multiple companies outside of the biotech world.


Relevance to cell biology

Most predicted effects of macromolecular crowding, confinement, and adsorption on macromolecular isomerization equilibria and association equilibria and rates have been confirmed qualitatively (and in favorable cases quantitatively) in vitro ‡ , but are such effects similarly important in a living cell? On the basis of results obtained from partitioning and size-exclusion experiments conducted with concentrated cell lysates, Zimmerman and Trach estimated that excluded volume effects in the cytoplasm of E. coli are comparable to those obtained in a 35% solution of a ∼70 kDa globular protein, such as bovine serum albumin or hemoglobin (Zimmerman and Trach, 1991). Although this estimate might provide a useful starting point, it is clear that the answer is far more complex and elusive. Any cell is extremely large relative to any particular macromolecule of interest and is likely to contain several micro-environments, within each of which a particular macromolecule X will be subject to a different set of background interactions. For example, the cytoplasm of even an organism as simple as E. coli contains at least three such micro-environments: the immediate vicinity of the inner plasma membrane, within which X will encounter a high local concentration of membrane phospholipids and proteins the interior and immediate vicinity of the nucleoid, within which X will encounter an extremely high local concentration of DNA and the remaining cytoplasm, within which X will be subject primarily to the influence of other soluble proteins. One would expect the relative contributions of macromolecular crowding, confinement and adsorption to macromolecular reactivity to be rather different within each of these three micro-compartments. That complexity acknowledged, it is nevertheless true that large and unambiguous background effects have indeed been observed within certain specialized, simplified cells.

Predicted effects of macromolecular confinement on association equilibria have not yet been tested.

(A) Dependence of the solubility of deoxy HbS upon dextran concentration (Bookchin et al., 1999). A 1.75-fold increase in dextran concentration results in a greater than four-fold increase in the equilibrium tendency of deoxy HbS to polymerize. (B) Time course of assembly of HIV capsid protein in the absence (•) and presence (▪) of 100 g/l Ficoll 70 (del Alamo, 2005). The half-time for assembly of the protein is decreased ten-fold in the presence of Ficoll. (C) Temperature dependence of the ellipticity of α-lactalbumin in bulk solution (▴) and encapsulated in hydrated silica sol-gel glass (○). The confined protein behaves normally at low temperature, but exhibits only partial unfolding even at temperatures approaching 100°C. Figure reproduced with permission from Eggers and Valentine (Eggers and Valentine, 2001). (D) Time dependence of adsorption of several unrelated proteins to a supported phospholipid bilayer (symbols and solid curves) (Fernandez and Berry, 2003). The dotted curves indicate the time dependence that would be expected in the absence of interaction between adsorbed proteins. The enhanced steepness of the experimentally observed curves (solid) relative to the reference curves (dotted) indicates self-association resulting in clustering of the adsorbed proteins (Minton, 2001b).

(A) Dependence of the solubility of deoxy HbS upon dextran concentration (Bookchin et al., 1999). A 1.75-fold increase in dextran concentration results in a greater than four-fold increase in the equilibrium tendency of deoxy HbS to polymerize. (B) Time course of assembly of HIV capsid protein in the absence (•) and presence (▪) of 100 g/l Ficoll 70 (del Alamo, 2005). The half-time for assembly of the protein is decreased ten-fold in the presence of Ficoll. (C) Temperature dependence of the ellipticity of α-lactalbumin in bulk solution (▴) and encapsulated in hydrated silica sol-gel glass (○). The confined protein behaves normally at low temperature, but exhibits only partial unfolding even at temperatures approaching 100°C. Figure reproduced with permission from Eggers and Valentine (Eggers and Valentine, 2001). (D) Time dependence of adsorption of several unrelated proteins to a supported phospholipid bilayer (symbols and solid curves) (Fernandez and Berry, 2003). The dotted curves indicate the time dependence that would be expected in the absence of interaction between adsorbed proteins. The enhanced steepness of the experimentally observed curves (solid) relative to the reference curves (dotted) indicates self-association resulting in clustering of the adsorbed proteins (Minton, 2001b).

The interior of an erythrocyte is essentially a highly concentrated solution of hemoglobin. The affinity of erythrocytes containing sickle cell hemoglobin (HbS) for oxygen depends significantly upon the intracellular hemoglobin concentration, because oxygen binding is linked to the polymerization of HbS (May and Huehns, 1975). The concentration dependence of oxygen affinity may be quantitatively accounted for if, and only if, steric repulsion between hemoglobin molecules is taken into account (Minton, 1976). Ferrone has recently reviewed a large body of work demonstrating that the extensively characterized kinetics of cell sickling subsequent to deoxygenation may be well accounted for by models that take into account the substantial effect of macromolecular crowding within erythrocytes upon the thermodynamic activity (effective concentration) of monomers and each oligomer in the hemolyzate (Ferrone, 2004). By means of cleverly designed experiments, volume regulatory mechanisms in dog erythrocytes were shown to respond nonspecifically to changes in the intracellular concentration of macromolecules rather than changes in volume per se (Colclasure and Parker, 1992).

The interior of an eye lens cell consists essentially of a solution of a small number of crystallins at very high concentration (total protein concentration >500 g/l). These proteins are not translated postnatally. Thus, the crystallin molecules that an animal is born with must remain structurally intact over much of its lifetime to preserve lens transparency. The thermal stability of these proteins increases with concentration (Steadman et al., 1989), and the extraordinary thermal stability of an intact lens has been attributed in part to the stabilizing effects of macromolecular crowding inside the lens cell (Bloemendal et al., 2004).

Excluded volume theory predicts that at the high levels of fractional occupancy characterizing almost all biological fluid media, even small changes in cellular hydration will result in disproportionately large changes in the reactivity of a broad spectrum of macromolecular reactants. This prediction is consistent with and may account for the following general observations: (1) Relatively modest changes of cellular volume in animal cells are associated with changes in a wide variety of diverse intracellular processes, such as the polymerization/depolymerization of cytoskeletal filaments or the activation/deactivation of membrane ion channels, that are much too large to be accounted for on the basis of simple mass action (reviewed by Lang et al., 1998). (2) Complex and very diverse systems for maintaining the concentrations of cellular contents within narrow limits have evolved within all life forms, be they bacterial, plant or animal (Somero et al., 1992). (3) The age-related onset of a variety of protein-aggregation-linked diseases (Koo et al., 1999) correlates with significant loss of cellular and tissue hydration in the elderly and concomitant increases in the volume excluded to protein (Parameswaran et al., 1995 Hatters et al., 2002).

During the last few years several experimental techniques have been developed that enable certain aspects of the behavior of selected macromolecules – typically labeled and/or overexpressed – to be monitored within living cells (e.g. Ghaemmaghami and Oas, 2001 Ignatova and Gierasch, 2004 McNulty et al., 2006). It is hoped that techniques like these, or others yet to be devised, can be used to investigate the influence of background interactions upon the behavior of the selected species within their native environments. However, one must be extremely cautious about interpreting the results of such experiments. In particular, it is necessary to design and carry out control experiments that clearly indicate whether or not the processes of labeling and/or overexpression result in abnormal distribution of the selected protein within the cell, induction of artifactual associations, or disruption of the normal background interactions that one is attempting to investigate.

This Commentary bears as its title the provocative question “How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes?” When one can specify the composition of the local environment of a particular reaction at a specific intracellular location and at a particular time point in the cell cycle, studies such as those cited here will help to provide answers to the equally interesting and perhaps more biological question “By how much do biochemical reactions within cells differ from those in test tubes?”



Comentarios:

  1. Talib

    Puedo recomendarle que visite el sitio web con una gran cantidad de artículos sobre el tema de interés para usted.

  2. Tygokree

    ¿Y tiene análogo?

  3. Dedric

    Interesante incluso para un contador))))))

  4. Faurr

    veremos

  5. Ellard

    Creo que estás cometiendo un error. Puedo defender mi posición. Envíeme un correo electrónico a PM.



Escribe un mensaje