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¿Por qué se utiliza la hidrólisis de ATP a ADP, en lugar de la hidrólisis de ADP a AMP, para impulsar reacciones bioquímicas?

¿Por qué se utiliza la hidrólisis de ATP a ADP, en lugar de la hidrólisis de ADP a AMP, para impulsar reacciones bioquímicas?


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El ADP tiene dos grupos fosfato y puede hidrolizarse a AMP en una reacción que implica un cambio de energía libre similar al de hidrolizar ATP a ADP.

¿Por qué la última reacción, en lugar de la reacción anterior, acoplado a reacciones energéticamente desfavorables para proporcionar una reacción general con un cambio negativo en Gibbs Free Energy?


Resumen

La pregunta original fue editada - con la aprobación del cartel - de modo que en breve ahora pregunta:

¿Por qué la hidrólisis de ATP a ADP, en lugar de la hidrólisis de ADP a AMP, es la forma normal en que las células conducen reacciones que, por sí solas, implican cambios positivos en la energía libre de Gibbs?

El alcance de esto es más amplio que el que se asumió originalmente en la respuesta de @ user1136, pero también ha contribuido a esta respuesta con sus comentarios, que he incorporado en mi revisión.

Que yo sepa hay no respuesta demostrable generalmente aceptada a esta pregunta (en contraposición a enumerar las ventajas para el sistema tal como funciona hoy). Lo que haré es presentar un hipótesis eso podría explicar esta situación. La idea fundamental † de esto es que:

El uso contemporáneo de ATP en lugar de ADP en las reacciones de transferencia de energía evolucionó a partir de una preferencia por los NTP, en lugar de los NDP, como precursores de la síntesis de ARN. Esta preferencia fue el resultado del hecho de que la conversión de NTP en NMP y pirofosfato podría evitar la reversión de este (y otros) procesos sintéticos de una manera que las conversiones que liberan fosfato no pudieron.

AMP, ADP y ATP: energías libres estándar de hidrólisis

Existe un acuerdo general de que los valores de ∆G ° '(cambio de energía libre estándar a 37˚C) para la hidrólisis del enlace fosfato terminal de ATP (β-γ) y ADP (α-β) son similares. (Los siguientes son de J.L. Jain, et al.:

ATP → ADP + Pi -7,3 kcal / mol ADP → AMP + Pi -7,3 kcal / mol

Por lo tanto, hay no diferencia energética intrínseca que podría explicar el uso preferencial de ATP sobre ADP como 'donante de energía' en procesos bioquímicos, es decir, no es evidente por qué, por ejemplo:

Glucosa + ATP → Glucosa 6-fosfato + ADP

y no

Glucosa + ADP → Glucosa 6-fosfato + AMP

Y, como menciona @ user1136, hay ejemplos en los que la energía de la hidrólisis de ADP a AMP se puede utilizar para "impulsar" otras reacciones. Menciona la polinucleótido fosforilasa, a la que yo agregaría adenilato quinasa, ya que no es un proceso sintético y es pertinente para el metabolismo energético de los nucleótidos fosfatos:

ADP + ADP ⇄ AMP + ATP

La introducción de AMP en la discusión plantea la cuestión del valor de ∆G ° 'para la siguiente reacción:

ATP → AMP + PPi

Muchos textos citan un valor solo ligeramente mayor (ignorando el signo menos) que los de la liberación de fosfato (el citado cita -7.7 kcal / mol), pero una revisión de 1995 de la situación en el Journal of Biochemistry sugiere que la diferencia es en realidad mayor : -10,9 kcal / mol, en contraposición a -7,8 kcal / mol para la hidrólisis de ATP a ADP y Pi.

La relevancia de esto se considera en la siguiente sección.

Procesos biosintéticos y ATP

Me parece que el ejemplo de la polinucleótido fosforilasa es especialmente pertinente porque es un proceso biosintético en el que el nucleótido monofosfato se incorpora realmente al producto.

[AMPERIO]norte + ADP → [AMP]n + 1 + Pi

Sin embargo, esta síntesis de polinucleótidos no dependiente de la plantilla impulsada por ADP no es un modelo para la síntesis de ARN dependiente de la plantilla, una de las razones es que también puede operar en el direccion contraria como una reacción fosforolítica de exoribonucleasa 3ʹ a 5ʹ:

[AMPERIO]n + 1 + Pi → [AMP]norte + ADP

La irreversibilidad es una característica importante de la síntesis de ARN dependiente de la plantilla¶, y se cree que la clave de esto es el hecho de que el ATP es el sustrato y se escinde entre los fosfatos α y β que liberan pirofosfato en lugar de monofosfato.

[NMP]norte + NTP → [NMP]n + 1 + PPi

La razón generalmente propuesta para explicar por qué esta reacción es irreversible es que en la célula la pirofosfatasa hidroliza el pirofosfato a fosfato en una reacción exotérmica. Sin embargo, el problema en términos evolutivos es que las pirofosfatasas tendrían que evolucionar antes de que esto funcione. Sin embargo, si el ∆G ° 'para la liberación de pirofosfato tiene un valor absoluto mayor que el de la liberación de fosfato, esto en sí mismo afectaría el equilibrio de la reacción de una manera favorable a la síntesis, aunque al mayor costo efectivo de un ATP adicional. La posterior evolución de las pirofosfatasas habría servido para reforzar y potenciar la irreversibilidad.

La hipótesis

los hipótesis es ese nucleósido triLos fosfatos se desarrollaron temprano en la evolución para proporcionar un medio para hacer que la síntesis de ácidos nucleicos sea esencialmente irreversible mediante un mecanismo que genera pirofosfato. Como muestra el ejemplo de polinucleótido fosforilasa, nucleósido di-los fosfatos no lo permiten.

A priori parece que no hay ninguna razón por la que se deba preferir el ATP en lugar del ADP para acoplar reacciones bioquímicas. Sin embargo, si se acepta el argumento de que la síntesis de ATP es necesaria para la síntesis de ácidos nucleicos, no parece haber razón para tener un conjunto de reacciones que generen ADP para otros fines. La energía de hidrólisis de ATP a ADP en tales reacciones debería, en cualquier caso, ser utilizada, de lo contrario representaría una pérdida neta. ¿Por qué ir más lejos?

Puede haber sido que el ATP fue precedido en la evolución por un "donante de energía" anterior. Sin embargo, sugeriría que una vez que se desarrolló un mecanismo para sintetizar y usar ATP (y otros NTP) con fines sintéticos, fue más eficiente usarlo con fines metabólicos, desplazando en gran medida cualquier molécula donante de energía anterior.

† Nota al pie 1

He tocado esto muy tangencialmente en mi respuesta a una pregunta bastante diferente sobre ATP. Sin embargo, la idea común es que los anillos de purina y pirimidina de los NTP no tienen ningún propósito en la transferencia de energía, sino que son una reliquia de su requerimiento en la síntesis de ARN, donde los NTP no solo proporcionan energía, sino que son incorporado en el producto de ARN.

¶ Nota al pie 2

La síntesis de ARN y ADN no son los únicos procesos sintéticos en los que se adopta esta estrategia de irreversibilidad. La reacción de aminoacilación del ARNt, esencial para síntesis de proteínas es como sigue:

Aminoácido + ATP → Aminoacil-AMP + PPi

Y el primer paso en síntesis de glucógeno es la formación de UDP-glucosa:

Glucosa 1-fosfato + UTP → UDP-glucosa + PPi


Eso pueden, y un ejemplo muy famoso es la polinucleótido fosforilasa, una enzima de gran importancia histórica en la elucidación del código genético.

Dicho esto, es muy poco común, y la polinucleótido fosforilasa es el único ejemplo que conozco (pero otros usuarios pueden proporcionar ejemplos adicionales).

Ciertamente, no hay ninguna razón termodinámica por la que el enlace de "alta energía" del ADP no pueda utilizarse como fuente de energía libre.

La polinucleótido fosforilasa fue descubierta en el laboratorio de Ochoa por Mairanna Grunberg-Manago. La historia cuenta (de memoria) que Ochoa fue muy despectiva cuando Grunberg-Manago le dijo que la enzima usa fosfatos de dinucleótidos, en lugar de fosfatos de trinucleótidos, y él le dijo que su conclusión era imposible. Más tarde se dio cuenta de su error y se disculpó, y la actividad biosintética de la enzima proporcionó un método simple y elegante para producir ARN cortos que se utilizaron para desentrañar el código genético.

(No tengo la fuente de la historia anterior 'a mano' (ya que estoy de vacaciones). ¿Quizás alguien pueda ayudarme con un relato más auténtico de la historia? De lo contrario, 'buscaré' la fuente original en el los dias que vienen).


ATP -> ADP es más fácil de romper que ADP -> AMP. No creo que pueda explicar por qué sin invocar las nociones de química de tercer año de los orbitales de electrones ...

Conceptualmente, el enlace fosfato terminal en el trifosfato es más inestable que el enlace terminal en el dipéptido, por lo que es más fácil romper este enlace y liberar esta energía de enlace para hacer el trabajo, y la cantidad de energía es una cantidad pequeña y útil. Romper los enlaces de alta energía es más difícil, y si la energía liberada es superior a la necesaria, puede provocar reacciones secundarias no deseadas.

El metabolismo es paso a paso para mantener la unidad de energía en el nivel apropiado.


¿Por qué el ATP libera energía cuando se convierte en ADP?

Cuando la celda necesita energía hacer trabajo, ATP pierde su tercer grupo fosfato, liberando energía almacenado en el enlace que la celda puede utilizar para hacer el trabajo. Ahora ha vuelto a ser ADP y está listo para almacenar el energía de la respiración uniéndose con un tercer grupo fosfato.

Asimismo, ¿por qué es incorrecto decir que el enlace fosfoéster del ATP libera una gran cantidad de energía cuando el ATP se convierte en ADP? Con esto en mente, explique por qué es Es incorrecto decir que el enlace fosfoéster del ATP libera una gran cantidad de energía cuando el ATP se convierte en ADP.. No, el energía no sale de la enlace fosfoéster cuando está roto. Más bien el energía es liberado cuando las partes de la molécula de agua se agregan a ADP.

De esta manera, ¿qué proceso proporciona la energía utilizada para producir ATP a partir de ADP?

La hidrólisis de ATP para producir ADP es una reacción reversible y por lo tanto ADP usa el extra energía con en la celda para convertir de nuevo a ADP. Este extra energía proviene de la descomposición de los alimentos.

¿El ATP es más estable que el ADP?

Esto hace ATP una molécula relativamente inestable porque querrá ceder sus grupos fosfato, cuando se le dé la oportunidad, para convertirse en un mas estable molécula. Estabilización de resonancia de ADP y de PI es mas grande que la de ATP. Las moléculas de oxígeno del ADP están compartiendo electrones. Esto estabiliza el ADP.


20.1: ATP: la moneda energética universal

El trifosfato de adenosina (ATP), un nucleótido compuesto por adenina, ribosa y tres grupos fosfato, es quizás el más importante de los llamados compuestos ricos en energía en una célula. Su concentración en la célula varía de 0,5 a 2,5 mg / ml de líquido celular.

Compuestos ricos en energía son sustancias que tienen características estructurales particulares que conducen a una liberación de energía después de la hidrólisis. Como resultado, estos compuestos pueden suministrar energía para procesos bioquímicos que requieren energía. La característica estructural importante en el ATP es el enlace de anhídrido de ácido fosfórico o pirofosfato:

El enlace pirofosfato, simbolizado por un garabato (

), se hidroliza cuando el ATP se convierte en difosfato de adenosina (ADP). En esta reacción de hidrólisis, los productos contienen menos energía que los reactivos, hay una liberación de energía (& gt 7 kcal / mol). Una razón de la cantidad de energía liberada es que la hidrólisis alivia las repulsiones electrón-electrón experimentadas por los grupos fosfato cargados negativamente cuando se unen entre sí (Figura 20.1.1).

Figura ( PageIndex <1> ): Hidrólisis de ATP para formar ADP

Se libera energía porque los productos (ADP e ion fosfato) tienen menos energía que los reactivos [ATP y agua (H2O)].

La ecuación general para la hidrólisis de ATP es la siguiente:

[ATP + H_2O y rarr ADP + P_i + 7.4 kcal / mol ]

Si la hidrólisis de ATP libera energía, su síntesis (a partir de ADP) requiere energía. En la célula, el ATP es producido por aquellos procesos que aportan energía al organismo (absorción de la energía radiante del sol en las plantas verdes y descomposición de los alimentos en los animales), y es hidrolizado por aquellos procesos que requieren energía (la síntesis de carbohidratos , lípidos, proteínas, transmisión de impulsos nerviosos, contracciones musculares). De hecho, el ATP es el principal medio de intercambio de energía en los sistemas biológicos. Muchos científicos lo llaman la moneda energética de las células.

(P_i ) es el símbolo de los aniones de fosfato inorgánico (H_2PO_4 ^ & minus ) y (HPO_4 ^ <2 & minus> ).

El ATP no es el único compuesto de alta energía necesario para el metabolismo. Varios otros se enumeran en la Tabla ( PageIndex <1> ). Sin embargo, observe que la energía liberada cuando se hidroliza el ATP está aproximadamente a medio camino entre las de los compuestos de fosfato de alta y baja energía. Esto significa que la hidrólisis de ATP puede proporcionar energía para la fosforilación de los compuestos debajo de él en la tabla. Por ejemplo, la hidrólisis de ATP proporciona suficiente energía para la fosforilación de glucosa para formar glucosa 1-fosfato. Del mismo modo, la hidrólisis de compuestos, como el fosfato de creatina, que aparecen encima El ATP en la tabla puede proporcionar la energía necesaria para resintetizar el ATP del ADP.


Acoplamiento de ATP y energía

¿Exactamente cuánta energía libre (& # 8710G) se libera con la hidrólisis de ATP, y cómo se usa esa energía libre para realizar el trabajo celular? El & # 8710G calculado para la hidrólisis de un mol de ATP en ADP y PI es & menos7,3 kcal / mol (& menos 30,5 kJ / mol). Sin embargo, esto solo es cierto en condiciones estándar, y el & # 8710G para la hidrólisis de un mol de ATP en una célula viva es casi el doble del valor en condiciones estándar: 14 kcal / mol (& menos 57 kJ / mol).

El ATP es una molécula muy inestable. A menos que se use rápidamente para realizar un trabajo, el ATP se disocia espontáneamente en ADP + PIy la energía libre liberada durante este proceso se pierde en forma de calor. Para aprovechar la energía dentro de los enlaces de ATP, las células utilizan una estrategia llamada acoplamiento de energía.

Las células acoplan la reacción exergónica de la hidrólisis del ATP con las reacciones endergónicas de los procesos celulares. Por ejemplo, durante las reacciones metabólicas celulares, o la síntesis y descomposición de nutrientes, ciertas moléculas deben alterarse levemente en su conformación para convertirse en sustratos para el siguiente paso en la serie de reacciones. En los primeros pasos de la respiración celular, la glucosa se descompone mediante el proceso de glucólisis. El ATP es necesario para la fosforilación de la glucosa, lo que crea un intermedio de alta energía pero inestable. Esta reacción de fosforilación provoca un cambio conformacional que permite que las enzimas conviertan la molécula de glucosa fosforilada en el azúcar fructosa fosforilada. La fructosa es un intermedio necesario para que la glucólisis avance. En este ejemplo, la reacción exergónica de la hidrólisis del ATP se acopla con la reacción endergónica de convertir la glucosa para su uso en la vía metabólica.


DISCUSIÓN

En este estudio, una enzima multimérica que utiliza acetona soluble ha sido purificada y caracterizada a partir de Xanthobacter cepa Py2. La función fisiológica de la acetona carboxilasa es convertir la acetona, una molécula orgánica tóxica y recalcitrante, en acetoacetato, que es un metabolito central que puede sufrir más transformaciones metabólicas por vías bioquímicas convencionales y bien caracterizadas.

La acetona carboxilasa exhibió un requisito obligatorio de ATP como cofactor. La carboxilación de acetona es un proceso termodinámicamente desfavorable (ΔG ° ′ para la carboxilación de acetona con bicarbonato es +17.1 kJ / mol), y la hidrólisis de ATP a ADP (ΔG ° ′ = −31 kJ / mol) teóricamente proporcionaría suficiente energía para impulsar el reacción de carboxilación. Curiosamente, durante el curso de la carboxilación de acetona, se forman AMP y fosfato inorgánico como productos de la hidrólisis de ATP (Fig.3A) según Eq. 4: 4 Por tanto, la carboxilación de acetona requiere la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster α – β y β – γ de una sola molécula de ATP.

Es razonable especular que la hidrólisis de ATP juega un papel en la activación de acetona para CO2 adición a través de una o más reacciones de transferencia de grupo. Posiblemente, un grupo fosforilo o pirofosforilo se transfiere directamente a acetona, o mediante la mediación de un intermedio de enzima fosforilo o pirofosforilo. La carboxilación de acetona presumiblemente implica un ataque nucleofílico del carbanión de acetona en CO2 (o bicarbonato). El carbanión podría formarse mediante la abstracción de la base general de un protón, pero sería difícil de generar y muy inestable debido al alto pK.a del grupo metilo. El carbanión podría estabilizarse mediante tautomerización ceto a enol, y el tautómero enol podría estabilizarse adicionalmente mediante la transferencia de un grupo fosforilo (u otro) del ATP al átomo de oxígeno del enolato. Ataque nucleofílico del enol sobre CO2 (o bicarbonato) con la hidrólisis concomitante del enlace oxígeno-fosfato daría como resultado la formación de acetoacetato.

Este esquema de reacción hipotético tiene similitudes con reacciones bien caracterizadas que involucran a los intermedios glicolíticos piruvato y fosfo.enolpiruvato (24-26). La conversión de piruvato a fosfoenolel piruvato es catalizado por fosfoenolpiruvato sintasa, que fosforila el tautómero enol del piruvato a expensas de dos enlaces fosfoanhídrido de alta energía como se muestra en la Ec. 5 (24, 26): 5 Se requiere la hidrólisis de dos enlaces fosfoanhídrido para impulsar la fosforilación del piruvato, que es una reacción ascendente en relación con una hidrólisis de ATP simple (ΔG ° ′ para fosfoenolla hidrólisis de piruvato es -61,9 kJ / mol). Con base en las mismas consideraciones termodinámicas, la hidrólisis de dos enlaces fosfoanhídrido puede ser necesaria para la generación de fosfoenolacetona u otro intermedio de acetona activada también.

Si la transferencia de grupo de ATP a acetona ocurre como parte del mecanismo catalítico, parecería que el intermedio no es estable, ya que no se observó un agotamiento detectable de acetona en los ensayos realizados en ausencia de CO2 (Fig. 3B). En estos ensayos, la acetona estimuló la hidrólisis de ATP por aproximadamente 20 veces más que los ensayos realizados en ausencia de acetona, lo que sugiere que se está produciendo una reacción de ATP con acetona. Posiblemente, el intermedio de acetona activado simplemente se descompone en acetona si el CO2 no está disponible para una reacción posterior para formar acetoacetato. Alternativamente, la acetona puede inducir un cambio conformacional que activa la actividad ATPasa de la enzima.

Es interesante que tanto el ADP como el AMP se acumularon como productos significativos de la hidrólisis de ATP dependiente de acetona en ausencia de CO2 (Fig. 3). El ADP también se detectó como un producto de hidrólisis menor en ensayos realizados en presencia de CO2 (Figura 2). Estos resultados demuestran que la acetona carboxilasa puede catalizar la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster α-β y β-γ del ATP. Posiblemente, la hidrólisis del ATP se produce por la ruptura secuencial de los enlaces fosfodiéster β-γ y α-β del ATP con la generación de un intermedio de ADP en lugar de por una ruptura inicial del enlace α-β, que generaría AMP y pirofosfato (o un intermedio pirofosforilado) como los primeros productos de hidrólisis. La acetona carboxilasa no mostró ninguna actividad pirofosfatasa y no pudimos detectar el pirofosfato como intermedio en las reacciones de carboxilación en estado estacionario (Figuras 2 y 3).Estos resultados argumentan en contra del pirofosfato como intermediario en la reacción. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de un grupo pirofosforilo unido de forma estrecha o covalente como intermedio en la secuencia de reacción. Es evidente que la elucidación de los detalles mecanicistas de la carboxilación de acetona y las funciones que desempeña la hidrólisis de ATP en esta reacción requerirá la aplicación de una variedad de herramientas cinéticas, mecanicistas y espectroscópicas.

Schink y colaboradores (5, 10, 11, 27, 28) han estudiado el metabolismo de la acetona en varias bacterias anaeróbicas y han obtenido en vivo y in vitro datos que apoyan la existencia de CO2-vías dependientes en las que la acetona se carboxila a acetoacetato o un derivado de acetoacetilo (por ejemplo, acetoacetil-CoA). Se estudió en extractos de células la actividad enzimática que se cree que es responsable de la carboxilación de acetona en un desnitrificante denominado cepa BunN. La carboxilación de acetona no se pudo reconstituir en extractos celulares en ausencia o presencia de ATP y otros cofactores (9, 12). Los extractos celulares de la cepa BunN catalizaron dos reacciones que se cree que son relevantes para la carboxilación de acetona: la descarboxilación de acetoacetato dependiente de ADP y el intercambio de 14 CO dependiente de ADP.2 en el átomo de carbono carboxilato de acetoacetato (9, 12). En particular, estas actividades enzimáticas faltaban o estaban muy reducidas en extractos celulares preparados a partir de células cultivadas con otras fuentes de carbono, lo que proporciona evidencia de que están asociadas con la enzima carboxilante de acetona (9, 12).

Recientemente, Birks y Kelly (13) demostraron actividad acetona carboxilasa en extractos celulares preparados a partir de cultivos de acetona Rhodobacter capsulatus. Esta actividad requirió ATP y fue estimulada por CoA o acetil-CoA (estos cofactores no tuvieron efecto sobre la actividad de la acetona carboxilasa en Xanthobacter Py2). Los niveles de actividad observados para R. capsulatus extractos fueron mucho más bajos (200 a 1000 veces) que los observados en extractos de células de Xanthobacter Py2 y, como señalaron los autores, demasiado bajo para ser de importancia fisiológica (13). Posiblemente, un componente adicional no requerido por el Xanthobacter el sistema es limitante en el ensayo y / o la enzima es mucho menos estable in vitro. Pueden aplicarse escenarios similares a la cepa BunN y otros anaerobios para los que no se puede reconstituir la carboxilación de acetona. in vitro.

En resumen, este artículo proporciona la primera purificación y caracterización de una enzima catabólica que metaboliza la acetona. La identificación y caracterización de esta enzima llena un vacío de larga data en nuestra comprensión del ciclo microbiano de la acetona. Las propiedades de la acetona carboxilasa informadas en este estudio inicial sugieren un nuevo mecanismo de carboxilación de acetona dependiente de ATP que promete revelar nuevos conocimientos sobre las estrategias biológicas para agregar CO2 a sustratos orgánicos.


3.1: Las leyes de la termodinámica

  • Contribuido por E. V. Wong
  • Axolotl Academica Publishing (Biología) en Axolotl Academica Publishing

Dos conceptos fundamentales gobiernan la energía en lo que se refiere a los organismos vivos: la Primera Ley de la Termodinámica establece que la energía total en un sistema cerrado no se pierde ni se gana, sino que solo se transforma. La Segunda Ley de la Termodinámica establece que la entropía aumenta constantemente en un sistema cerrado.

Más específicamente, la Primera Ley establece que la energía no se puede crear ni destruir: solo puede cambiar de forma. Por lo tanto, a través de todos y cada uno de los procesos, la energía total del universo o de cualquier otro sistema cerrado es constante. En un sistema termodinámico simple, esto significa que la energía se transforma mediante la transferencia de energía térmica (es decir, el calentamiento y enfriamiento de una sustancia) o mediante la producción de trabajo mecánico (es decir, movimiento). En términos biológicos y químicos, esta idea se puede extender a otras formas de energía como la energía química almacenada en los enlaces entre los átomos de una molécula, o la energía luminosa que puede ser absorbida por las hojas de las plantas.

El trabajo, en este caso, no implica necesariamente un mecanismo complicado. De hecho, cada molécula realiza un trabajo en la simple expansión de una masa caliente de moléculas gaseosas (como se visualiza mediante la expansión de un globo calentado, por ejemplo). Esto se expresa matemáticamente como la relación termodinámica fundamental:

donde (E ) es la energía interna del sistema, (T ) es la temperatura, (S ) es la entropía, (p ) es la presión y (V ) es el volumen.

A diferencia de la Primera Ley, que se aplica incluso a las partículas dentro de un sistema, la Segunda Ley es una ley estadística y se aplica generalmente a los sistemas macroscópicos. Sin embargo, no excluye variaciones a pequeña escala en la dirección de la entropía a lo largo del tiempo. De hecho, el teorema de fluctuación (propuesto en 1993 por Evans et al, y demostrado por Wang et al en 2002) establece que a medida que aumenta el tiempo o el tamaño del sistema, la probabilidad de un cambio negativo en la entropía (es decir, va en contra de la Segunda Ley) disminuye exponencialmente. Entonces, en escalas de tiempo muy pequeñas, existe una probabilidad real de que puedan existir fluctuaciones de entropía contra la Segunda Ley.

La Segunda Ley dicta que la entropía siempre busca aumentar con el tiempo. La entropía es simplemente una palabra elegante para el caos o el desorden. El estado final o de equilibrio teórico es aquel en el que la entropía se maximiza y no hay orden para nada en el universo o sistema cerrado. Los procesos espontáneos, aquellos que ocurren sin influencia externa, son siempre procesos que convierten el orden en desorden. Sin embargo, esto no excluye la imposición del orden en un sistema. Examinando la forma matemática estándar de la Segunda Ley:

muestra que la entropía puede disminuir dentro de un sistema siempre que haya un aumento de igual o mayor magnitud en la entropía de los alrededores del sistema.

La frase "en un sistema cerrado" es un componente clave de estas leyes, y es con la idea encapsulada en esa frase que la vida puede ser posible. Pensemos en una célula típica: a lo largo de su vida, construye innumerables moléculas complejas: enormes proteínas y ácidos nucleicos formados a partir de una mezcla de pequeños aminoácidos o nucleótidos, respectivamente. En su superficie, este ejemplo podría parecer un contraejemplo de la segunda ley: pasar claramente de una mezcla de varias moléculas pequeñas a una molécula más grande con componentes enlazados y ordenados parecería ser una disminución en la entropía (o un aumento en el orden). . ¿Cómo es esto posible con respecto a la segunda ley? Lo es, porque la segunda ley se aplica solo a los sistemas cerrados. Es decir, un sistema que ni gana ni pierde materia ni energía.

El & ldquouniverso & rdquo es un sistema cerrado por definición porque no hay nada fuera de él.

Una célula viva no es un sistema cerrado: tiene entradas y salidas. Sin embargo, la segunda ley sigue siendo útil si reconocemos que la única forma de evitarla es mediante la entrada de energía. Si una célula no puede absorber alimentos (entrada de materia y energía en el sistema), muere, porque la segunda ley requiere que todo eventualmente se descomponga en colecciones más aleatorias / caóticas de componentes más pequeños. El orden requerido para mantener la vida (piense en todas las diferentes moléculas complejas que se mencionaron en el capítulo anterior) es fenomenal. Lo mismo se aplica al nivel del organismo (Figura ( PageIndex <1> )) - sin un aporte de energía (en forma de moléculas alimenticias para los animales o en forma de luz para las plantas), el organismo morirá y posteriormente se descomponen.

Figura ( PageIndex <1> ). En el panel superior, que muestra un sistema abierto en el que hay entradas de materia y energía (en forma de comida), la caja está abierta y se puede intercambiar aire, introducir comida, etc., lo que permite que el ratón crezca. Sin embargo, en el panel inferior, que muestra un sistema cerrado, el ratón no tiene acceso inmediato a más oxígeno del que está en la caja, ni tiene acceso a los alimentos. Sin estas entradas, la segunda ley entra en vigor y el ratón muere y se descompone en muchas moléculas más pequeñas.

Crear moléculas a partir de átomos cuesta energía porque toma una colección desordenada de átomos y los fuerza, a través de enlaces químicos, a posiciones ordenadas y no aleatorias. Asimismo, existe un coste energético para la formación de macromoléculas a partir de moléculas más pequeñas. Al imponer orden en el sistema, debe haber una entrada de energía asociada. Esto sucede en todos los niveles del sistema: átomos a moléculas, moléculas pequeñas a macromoléculas, grupos de moléculas a orgánulos, etc.

A medida que la reacción de polimerización reduce la entropía, requiere energía generada (generalmente) por la descomposición del ATP en AMP y PPi, que es una reacción que aumenta la entropía.

¿A dónde va esa energía? Termina en los enlaces que mantienen las moléculas o macromoléculas en su estado ordenado. Cuando tal enlace se rompe y una molécula se convierte de nuevo en una colección de átomos, se libera energía. La energía en un enlace químico es, por lo tanto, energía potencial: es energía almacenada que, cuando se libera, tiene la capacidad de realizar un trabajo. Este término, si recuerda la física de su escuela secundaria, generalmente se aprende junto con la energía cinética, que es la energía que se usa en el proceso de hacer trabajo (es decir, mover un objeto de un lugar a otro). El ejemplo clásico es la roca en la cima de una colina: tiene energía potencial porque está elevada y podría potencialmente descender. A medida que cae, tiene energía cinética a medida que se mueve. De manera similar, en una célula, la energía potencial en un enlace químico se puede liberar y luego usar para procesos como juntar moléculas más pequeñas en moléculas más grandes, o hacer que un motor molecular gire o se doble, acciones que podrían conducir al bombeo de protones o al contracción de las células musculares, respectivamente.

Volviendo a la segunda ley, esencialmente exige que la descomposición de las moléculas libera energía y que la producción de nuevas moléculas (yendo en contra de la tendencia natural al desorden) requiere energía. Cada molécula tiene una energía intrínseca y, por lo tanto, siempre que una molécula esté involucrada en una reacción química, habrá un cambio en la energía de la (s) molécula (s) resultante (s). Parte de este cambio en la energía del sistema se podrá utilizar para realizar un trabajo, y esa energía se conoce como la energía libre de la reacción. El resto se desprende en forma de calor.

La ecuación de Gibbs describe esta relación como

donde & DeltaG es el cambio de energía libre, & DeltaH es el cambio de entalpía (aproximadamente equivalente al calor), T es la temperatura a la que tiene lugar la reacción y & DeltaS es el cambio de entropía. Por convención, la liberación de energía libre es un número negativo, mientras que el requisito de entrada de energía se denota con un número positivo. Generalmente, una reacción química en la que & DeltaG & lt 0 es una reacción espontánea (también llamada reacción exergónica), mientras que una reacción química en la que & DeltaG & gt 0 no es espontánea (o endergónica). Cuando & DeltaG = 0, el sistema está en equilibrio. & DeltaG también se puede expresar con respecto a la concentración de productos y reactivos:

Los términos entre corchetes denotan concentraciones, & DeltaG & deg es la energía libre estándar para la reacción (como se lleva a cabo con una concentración 1M de cada reactivo, a 298K y a 1 atm de presión), R es la constante de gas (1.985 cal K -1 mol -1 ), y T es la temperatura en Kelvin. En un sistema más simple en el que solo hay dos reactivos y dos productos:

la ecuación para el cambio de energía libre se convierte en

Esto es importante para nosotros como biólogos celulares porque, aunque las células no son muy adecuadas para regular reacciones químicas variando la temperatura o la presión de las condiciones de reacción, pueden alterar con relativa facilidad las concentraciones de sustratos y productos. De hecho, al hacerlo, incluso es posible impulsar una reacción no espontánea (& DeltaG & gt 0) de forma espontánea (& DeltaG & lt 0) ya sea aumentando la concentración de sustrato (posiblemente transportándolos a la célula) o disminuyendo la concentración de producto ( ya sea secretándolos de la célula o usándolos como sustratos para una reacción química diferente).

Los cambios en la concentración de sustrato o producto para impulsar una reacción no espontánea son un ejemplo de la idea más general de reacciones de acoplamiento para impulsar reacciones energéticamente desfavorables. Las reacciones endergónicas se pueden acoplar a las reacciones exergónicas como una serie de reacciones que, en última instancia, pueden seguir adelante. El único requisito es que el cambio total de energía libre debe ser negativo (& DeltaG & lt 0). Entonces, asumiendo condiciones estándar (& DeltaG = & DeltaG & deg & rsquo), si tenemos una reacción con un cambio de energía libre de +5 kcal / mol, no es espontánea. Sin embargo, si acoplamos esta reacción, a la hidrólisis de ATP, por ejemplo, ambas reacciones continuarán porque el cambio de energía libre estándar de la hidrólisis de ATP a ADP y fosfato es un exergónico -7,3 kcal / mol. La suma de los dos valores de & DeltaG es -2,3 kcal / mol, lo que significa que la serie de reacciones acopladas es espontánea.

De hecho, el ATP es la energía y la cantidad de energía más común en las células precisamente porque el cambio de energía libre de -7,3 kcal / mol de su hidrólisis es suficiente para ser útil para impulsar muchas reacciones endergónicas por acoplamiento, pero es menos costoso (energéticamente) de hacer. que otros compuestos que potencialmente podrían liberar aún más energía (por ejemplo, fosfoenolpiruvato, PEP). Además, gran parte de las -14,8 kcal / mol (& DeltaG & deg & rsquo) de la hidrólisis de PEP se desperdiciaría porque relativamente pocas reacciones endergónicas son tan desfavorables como para necesitar tanta energía libre.

¿Por qué el ATP es diferente de otros pequeños compuestos fosforilados? ¿Cómo es posible que el enlace gamma-fosfoanhídrido (el más distal) del ATP pueda producir tanta energía cuando la hidrólisis del glicerol-3-fosfato produce menos de un tercio de la energía libre? El más obvio es la repulsión electrostática. Aunque se mantienen unidos por los enlaces covalentes, hay muchas cargas negativas en un espacio pequeño (cada fosfato lleva aproximadamente 4 cargas negativas). La eliminación de uno de los fosfatos reduce significativamente la repulsión electrostática. Teniendo en cuenta que la DG se calcula a partir del equilibrio tanto de reactivos como de productos, también vemos que los productos de la hidrólisis de ATP, ATP y fosfato, son muy estables por resonancia (tanto ADP como Pi tienen mayor estabilización de resonancia) y estabilización por hidratación. . La mayor estabilidad de los productos significa un mayor cambio de energía libre.

Incluso cuando una reacción es energéticamente favorable (& DeltaG & lt 0), puede que no ocurra sin un poco de & ldquopush & rdquo, químicamente hablando. El & ldquopush & rdquo es algo llamado energía de activacióny supera la estabilidad termodinámica. Considere la glucosa, por ejemplo. Este azúcar simple es la principal fuente de energía para todas las células y la energía inherente a sus enlaces se libera a medida que se descompone en dióxido de carbono y agua. Dado que esta es una molécula grande que se descompone en otras más pequeñas, la entropía aumenta, por lo que se libera energía de la reacción, y técnicamente es una reacción espontánea. Sin embargo, si consideramos un poco de glucosa en un plato en la mesa del laboratorio, claramente no se descompondrá espontáneamente a menos que agreguemos calor. Una vez que agregamos suficiente energía térmica, podemos eliminar la fuente de energía, pero el azúcar continuará descomponiéndose por oxidación (quemado) a CO.2 y H2O.

Figura ( PageIndex <2> ). Los catalizadores reducen la barrera de energía de activación para las reacciones químicas sin alterar el cambio de energía libre para esa reacción.

Dicho de otra manera, los reactivos deben llevarse a un estado de energía inestable, conocido como estado de transición (como se muestra en el pico de los gráficos en la Figura ( PageIndex <2> )). Esta barrera de requerimiento de energía para la ocurrencia de una reacción espontánea favorecida termodinámicamente se llama energía de activación. En las células, el requisito de energía de activación significa que la mayoría de las reacciones químicas ocurrirían muy lentamente o con poca frecuencia para permitir todos los procesos que mantienen vivas a las células porque la energía requerida probablemente provendría de la posibilidad de que dos reactivos chocan entre sí con suficiente energía, generalmente lo que significa que deben calentarse. Una vez más, las células generalmente no pueden encender algún mechero Bunsen microscópico para generar la energía de activación necesaria, debe haber otra forma. De hecho, las células superan el problema de la energía de activación mediante el uso de catalizadores para sus reacciones químicas. En términos generales, un catalizador es una sustancia química que aumenta la velocidad de una reacción, puede interactuar transitoriamente con los reactivos, pero no es alterada permanentemente por ellos. El catalizador se puede reutilizar porque es el mismo antes de que comience la reacción y después de que se complete la reacción. Desde un punto de vista termodinámico, reduce la energía de activación de la reacción, pero no cambia el & DeltaG. Por lo tanto, no puede hacer que se produzca una reacción no espontánea, solo puede hacer que una reacción ya espontánea ocurra más rápidamente o con más frecuencia.


Corrección de pruebas

Los pares de bases no coincidentes en el ADN son el resultado de una incorporación errónea de las polimerasas. El reconocimiento y la reparación de pares de bases mal emparejados en el ADN es esencial y el fracaso de este proceso es una de las principales causas de inestabilidad del genoma y, por tanto, del cáncer (Modrich y Lahue, 1996). Los homólogos de la familia de proteínas MutHLS se encuentran en casi todos los organismos y son necesarios para la reparación de errores de apareamiento. La proteína MutS reconoce el desajuste y controla la actividad de las otras proteínas. MutS es una ATPasa y la evidencia reciente sugiere que la hidrólisis de ATP es utilizada por la proteína tanto para verificar los desajustes como para activar el inicio del proceso de reparación por las proteínas MutH y MutL (Junop et al., 2001). Se propone que el mecanismo sea una forma de corrección de la falta de coincidencia de modo que la activación solo se produzca si el ATP y un par de bases no coincidente se unen simultáneamente. Además, se ha demostrado que los dos sitios de ATPasa en MutS son asimétricos a pesar de ser químicamente idénticos (Lamers et al., 2003) y que la alternancia de la hidrólisis de ATP entre estos sitios controla el tiempo de los diferentes pasos en la reparación del desajuste.

Curiosamente, la proteína MutL también es una ATPasa, pero en este caso la hidrólisis de ATP sirve como un interruptor para controlar la activación de la actividad de la endonucleasa MutH (Hall y Matson, 1999).


7.1 Energía en sistemas vivos

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Discutir la importancia de los electrones en la transferencia de energía en los sistemas vivos.
  • Explicar cómo las células utilizan el ATP como fuente de energía.

La producción de energía dentro de una célula implica muchas vías químicas coordinadas. La mayoría de estas vías son combinaciones de reacciones de oxidación y reducción, que ocurren al mismo tiempo. Una reacción de oxidación quita un electrón de un átomo en un compuesto, y la adición de este electrón a otro compuesto es una reacción de reducción. Debido a que la oxidación y la reducción generalmente ocurren juntas, estos pares de reacciones se denominan reacciones de oxidación y reducción o reacciones redox.

Electrones y Energía

La eliminación de un electrón de una molécula (oxidándola) da como resultado una disminución de la energía potencial en el compuesto oxidado. Sin embargo, el electrón (a veces como parte de un átomo de hidrógeno) no permanece suelto en el citoplasma de una célula.Más bien, el electrón se desplaza a un segundo compuesto, reduciendo el segundo compuesto. El desplazamiento de un electrón de un compuesto a otro elimina algo de energía potencial del primer compuesto (el compuesto oxidado) y aumenta la energía potencial del segundo compuesto (el compuesto reducido). La transferencia de electrones entre moléculas es importante porque la mayor parte de la energía almacenada en los átomos y utilizada para las funciones de la pila de combustible está en forma de electrones de alta energía. La transferencia de energía en forma de electrones de alta energía permite que la célula transfiera y use energía de manera incremental, en paquetes pequeños en lugar de en una sola explosión destructiva. Este capítulo se centra en la extracción de energía de los alimentos; verá que a medida que sigue la ruta de las transferencias, está rastreando la ruta de los electrones que se mueven a través de las rutas metabólicas.

Portadores de electrones

En los sistemas vivos, una pequeña clase de compuestos funciona como lanzaderas de electrones: se unen y transportan electrones de alta energía entre compuestos en vías bioquímicas. Los principales portadores de electrones que consideraremos se derivan del grupo de vitamina B y son derivados de nucleótidos. Estos compuestos pueden reducirse fácilmente (es decir, aceptan electrones) u oxidarse (pierden electrones). El dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) (Figura 7.2) se deriva de la vitamina B3, niacina. NAD + es la forma oxidada de la molécula NADH es la forma reducida de la molécula después de haber aceptado dos electrones y un protón (que juntos son el equivalente de un átomo de hidrógeno con un electrón extra). Tenga en cuenta que si un compuesto tiene una "H", generalmente se reduce (por ejemplo, NADH es la forma reducida de NAD).

NAD + puede aceptar electrones de una molécula orgánica de acuerdo con la ecuación general:

Cuando se agregan electrones a un compuesto, se reduce. Un compuesto que reduce a otro se llama agente reductor. En la ecuación anterior, RH es un agente reductor y NAD + se reduce a NADH. Cuando se eliminan electrones de un compuesto, esta oxidado. Un compuesto que oxida a otro se llama agente oxidante. En la ecuación anterior, NAD + es un agente oxidante y RH se oxida a R.

De manera similar, el dinucleótido de flavina y adenina (FAD +) se deriva de la vitamina B2, también llamada riboflavina. Su forma reducida es FADH2. Una segunda variación de NAD, NADP, contiene un grupo fosfato adicional. Tanto el NAD + como el FAD + se utilizan ampliamente en la extracción de energía de los azúcares, y el NADP desempeña un papel importante en las reacciones anabólicas y la fotosíntesis en las plantas.

ATP en sistemas vivos

Una célula viva no puede almacenar cantidades significativas de energía libre. El exceso de energía libre daría como resultado un aumento de calor en la celda, lo que daría como resultado un movimiento térmico excesivo que podría dañar y luego destruir la celda. Más bien, una celda debe poder manejar esa energía de una manera que le permita almacenar energía de manera segura y liberarla para usarla solo cuando sea necesario. Las células vivas logran esto mediante el uso del compuesto trifosfato de adenosina (ATP). El ATP a menudo se denomina "moneda de energía" de la celda y, como moneda, este compuesto versátil se puede utilizar para satisfacer cualquier necesidad de energía de la celda. ¿Cómo? Funciona de manera similar a una batería recargable.

Cuando el ATP se degrada, normalmente mediante la eliminación de su grupo fosfato terminal, se libera energía. La energía se usa para hacer un trabajo por la célula, generalmente cuando el fosfato liberado se une a otra molécula, activándola. Por ejemplo, en el trabajo mecánico de la contracción muscular, el ATP suministra la energía para mover las proteínas del músculo contráctil. Recuerde el trabajo de transporte activo de la bomba de sodio-potasio en las membranas celulares. El ATP altera la estructura de la proteína integral que funciona como bomba, cambiando su afinidad por el sodio y el potasio. De esta manera, la celda realiza un trabajo, bombeando iones contra sus gradientes electroquímicos.

Estructura y función de ATP

En el corazón del ATP hay una molécula de monofosfato de adenosina (AMP), que está compuesta por una molécula de adenina unida a una molécula de ribosa y a un solo grupo fosfato (Figura 7.3). La ribosa es un azúcar de cinco carbonos que se encuentra en el ARN y el AMP es uno de los nucleótidos del ARN. La adición de un segundo grupo fosfato a esta molécula central da como resultado la formación de adenosina. difosfato (ADP) la adición de un tercer grupo fosfato forma adenosina trifosfato (ATP).

La adición de un grupo fosfato a una molécula requiere energía. Los grupos fosfato están cargados negativamente y, por lo tanto, se repelen entre sí cuando están dispuestos en serie, como lo están en ADP y ATP. Esta repulsión hace que las moléculas de ADP y ATP sean inherentemente inestables. La liberación de uno o dos grupos fosfato del ATP, un proceso llamado desfosforilación, libera energía.

Energía de ATP

La hidrólisis es el proceso de romper macromoléculas complejas. Durante la hidrólisis, el agua se divide o se lisa y el átomo de hidrógeno resultante (H +) y un grupo hidroxilo (OH -), o hidróxido, se agregan a la molécula más grande. La hidrólisis de ATP produce ADP, junto con un ion fosfato inorgánico (PI) y la liberación de energía libre. Para llevar a cabo los procesos de vida, el ATP se descompone continuamente en ADP y, como una batería recargable, el ADP se regenera continuamente en ATP mediante la reinserción de un tercer grupo fosfato. El agua, que se descompuso en su átomo de hidrógeno y su grupo hidroxilo (hidróxido) durante la hidrólisis del ATP, se regenera cuando se agrega un tercer fosfato a la molécula de ADP, reformando el ATP.

Obviamente, se debe infundir energía en el sistema para regenerar ATP. ¿De dónde viene esta energía? En casi todos los seres vivos de la Tierra, la energía proviene del metabolismo de la glucosa, fructosa o galactosa, todos isómeros con la fórmula química C6H12O6 pero diferentes configuraciones moleculares. De esta manera, el ATP es un vínculo directo entre el conjunto limitado de vías exergónicas del catabolismo de la glucosa y la multitud de vías endergónicas que alimentan a las células vivas.

Fosforilación

Recuerde que, en algunas reacciones químicas, las enzimas pueden unirse a varios sustratos que reaccionan entre sí en la enzima, formando un complejo intermedio. Un complejo intermedio es una estructura temporal y permite que uno de los sustratos (como el ATP) y los reactivos reaccionen más fácilmente entre sí en reacciones que involucran ATP, el ATP es uno de los sustratos y el ADP es un producto. Durante una reacción química endergónica, el ATP forma un complejo intermedio con el sustrato y la enzima en la reacción. Este complejo intermedio permite que el ATP transfiera su tercer grupo fosfato, con su energía, al sustrato, un proceso llamado fosforilación. La fosforilación se refiere a la adición del fosfato (

PAG). Esto se ilustra mediante la siguiente reacción genérica, en la que A y B representan dos sustratos diferentes:

Cuando el complejo intermedio se rompe, la energía se utiliza para modificar el sustrato y convertirlo en un producto de la reacción. La molécula de ADP y un ion fosfato libre se liberan en el medio y están disponibles para su reciclaje a través del metabolismo celular.

Fosforilación del sustrato

El ATP se genera a través de dos mecanismos durante la descomposición de la glucosa. Se generan algunas moléculas de ATP (es decir, se regeneran a partir de ADP) como resultado directo de las reacciones químicas que ocurren en las vías catabólicas. Se elimina un grupo fosfato de un reactivo intermedio en la vía y la energía libre de la reacción se usa para agregar el tercer fosfato a una molécula de ADP disponible, produciendo ATP (Figura 7.4). Este método muy directo de fosforilación se denomina fosforilación a nivel de sustrato.

Fosforilación oxidativa

Sin embargo, la mayor parte del ATP generado durante el catabolismo de la glucosa se deriva de un proceso mucho más complejo, la quimiosmosis, que tiene lugar en las mitocondrias (figura 7.5) dentro de una célula eucariota o en la membrana plasmática de una célula procariota. La quimiosmosis, un proceso de producción de ATP en el metabolismo celular, se utiliza para generar el 90 por ciento del ATP producido durante el catabolismo de la glucosa y también es el método utilizado en las reacciones lumínicas de la fotosíntesis para aprovechar la energía de la luz solar. La producción de ATP mediante el proceso de quimiosmosis se denomina fosforilación oxidativa debido a la participación del oxígeno en el proceso.

Conexión profesional

Médico especialista en enfermedades mitocondriales

¿Qué sucede cuando las reacciones críticas de la respiración celular no se desarrollan correctamente? Esto puede ocurrir en enfermedades mitocondriales, que son trastornos genéticos del metabolismo. Los trastornos mitocondriales pueden surgir de mutaciones en el ADN nuclear o mitocondrial y dan como resultado la producción de menos energía de lo normal en las células del cuerpo. En la diabetes tipo 2, por ejemplo, la eficiencia de oxidación del NADH se reduce, lo que afecta la fosforilación oxidativa pero no los otros pasos de la respiración. Los síntomas de las enfermedades mitocondriales pueden incluir debilidad muscular, falta de coordinación, episodios similares a un accidente cerebrovascular y pérdida de la visión y la audición. La mayoría de las personas afectadas se diagnostican en la infancia, aunque existen algunas enfermedades de inicio en la edad adulta. La identificación y el tratamiento de los trastornos mitocondriales es un campo médico especializado. La preparación educativa para esta profesión requiere una educación universitaria, seguida de una escuela de medicina con especialización en genética médica. Los genetistas médicos pueden ser certificados por la Junta Americana de Genética Médica y luego asociarse con organizaciones profesionales dedicadas al estudio de enfermedades mitocondriales, como la Sociedad de Medicina Mitocondrial y la Sociedad de Trastornos Metabólicos Heredados.


¿Cómo acopla el ATP las reacciones endergónicas y exergónicas?

La pregunta es un poco engañosa: el ATP consigue que las reacciones endergónicas funcionen porque

  1. es una reacción exergónica sí mismo, y
  2. eso parejas sí mismo a la reacción endergónica, de modo que la reacción general es exergónica.

Hay muchos otros ejemplos de la acción del ATP, pero en casi todos los casos una sustancia está fosforilada. Como siempre, este intermedio fosforilado es más reactivo que el reactivo original, por lo que lo que una vez fue una reacción endergónica se vuelve exerónico por el acoplamiento de la reacción original con la hidrólisis de ATP.

Fuente: "Biology", séptima edición, Campbell & amp Reece

6 comentarios:

mi profesor usó este sitio :)
¡Explicado mejor que él!

Explicación excelente, simple y directa. Lo había leído muchas veces antes, pero nunca encontré la explicación de cómo el fosfato hace que el producto intermedio sea menos estable. ¡Gracias!

Tengo una pregunta.
Sé que ha respondido con bastante profundidad la pregunta de cómo se usa el ATP en estas reacciones, pero esperaba obtener una intuición aún más profunda para la respuesta.

Según mi conocimiento actual, digamos que un reactivo, R1, se une a un fosfato y reacciona con otro reactivo, R2, para hacer R2-R1-P

Me parece que esto, en sí mismo, no explica * realmente * por qué tener ese fosfato hace que la reacción sea más favorable. Pero, si va a plantear que hay otro paso en la reacción, en el que el producto se rompe de la siguiente manera:

R1-Pi + R2 - & gt R2-R1-Pi - & gt R2-R1 + Pi

Ahora tendría sentido que tener Pi adjunto a R1 lo hiciera más reactivo: debido a que el producto en el primer paso se descompuso rápidamente en R2-R1 y Pi, de acuerdo con el principio de Le Chatalier, la reacción se dirige hacia la derecha, por lo tanto, ser & # 39favorizados & # 39 y producir más producto.

Ahora, no estoy seguro de si así es como funciona realmente, pero ¿tiene alguna idea sobre mi forma de entender esto?

Perdón por un comentario muy largo.

MUY buena publicación describió fácilmente en unos pocos párrafos lo que no pude reconstruir después de leer quince páginas de mi texto. Gracias.

Doy a continuación mi lógica de ATP impulsando una reacción endergónica. Se explica en los libros de texto como energía de Gibbs negativa de la reacción general. Esta explicación tiene un problema. La energía de Gibbs es una función del estado. Por lo tanto, la reacción general si se toma como la suma de las dos reacciones, la endergónica y la hidrólisis del ATP, no tendría sentido, ya que implica que la reacción endergónica tiene lugar.

En un P, T dado, hay una relación de equilibrio entre el número de moléculas de producto y las moléculas de reactivo. Es posible que desee verlo como un producto que se forma continuamente y se descompone en reactivos, siendo ambos estadísticamente una función del número de colisiones entre moléculas. Si agrega más reactivos en una reacción exergónica, el número de moléculas de producto aumenta y la tasa inversa aumenta, hasta que finalmente se alcanza una proporción en la que ambas tasas se equilibran.
En equilibrio en condiciones fisiológicas, hay mucho más ADP que ATP. Por lo tanto, cuando se agrega ATP, se hidroliza a ADP y Pi. En una reacción endergónica, los productos son menos que reactivos. Añadimos ATP y obtenemos ADP y un nuevo producto, el reactivo fosfrilado. Esta reacción es exergónica, pero no tan exergónica como la hidrólisis de ATP. La descomposición del reactivo fosforilado en Pi y producto final también es exergónica. Por lo tanto, tenemos una mayor proporción general de producto final a reactivo. Pagamos un precio en términos de mayor concentración de ATP a ADP, en un equilibrio cuando hay un producto endergónico en la mezcla.


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

EcoPI tiene un ciclo de ATPasa de dos fases en un oligodúplex similar al observado con EcoP15I, pero con diferentes eficiencias aparentes en el acoplamiento de ATP

Para explorar si la interacción EcoP15I-ADN era inusual en la generación de un perfil de ATPasa de fase dual, primero investigamos la actividad de EcoPI en un sustrato oligodúplex con la misma secuencia de ADN ascendente y descendente (Figura 2A). EcoPI es homólogo a EcoP15I, las subunidades Res (que contienen los dominios de nucleasa y similares a helicasa) comparten una identidad del 90%, mientras que las subunidades Mod (que contienen los dominios de reconocimiento de la diana de ADN y metiltransferasa) comparten una identidad del & gt60% (la mayoría de las diferencias se encuentran entre el reconocimiento del objetivo). Dominios - TRDs) (12). A pesar de las similitudes a nivel de secuencia, nosotros y otros hemos notado algunas diferencias en las propiedades de las enzimas (9, 13-16). Analizamos EcoPI usando ensayos de flujo detenido de resolución de milisegundos previamente aplicados a EcoP15I (4): la actividad de ATPasa se midió usando una proteína de unión a fosfato fluorescente, los cambios en la conformación de la proteína se monitorearon usando fluorescencia de triptófano (Materiales y métodos). La unión y disociación de EcoP15I de su oligodúplex se midió previamente usando un ensayo de anisotropía de fluorescencia (4). Desafortunadamente, no pudimos obtener un cambio de señal medible con este ensayo usando EcoPI.

Las reacciones de ATPasa se iniciaron mezclando rápidamente un complejo EcoPI-oligodúplex saturado preincubado con ATP y heparina (esta última como una trampa para capturar enzimas disociadas y así crear condiciones cinéticas de recambio único con respecto a la unión del ADN). El atrapamiento incompleto y la reagrupación del ADN dan como resultado una tasa de estado estable lineal que debe corregirse antes de un análisis adicional (Figura complementaria S1B). La cinética se puede deconvolucionar en una fase de ráfaga rápida y una fase de ráfaga exponencial más lenta (Materiales y métodos). El perfil de liberación de fosfato corregido muestra una clara evidencia de dos fases cinéticas análogas a las vistas previamente con EcoP15I (Figura 2B). Las amplitudes de la primera y segunda ráfagas (cuánto ATP se consume durante esos estados) podrían estimarse a partir de la intersección ordenada y la amplitud de la fase exponencial, respectivamente (ecuación (1), figura complementaria S1C). La constante de velocidad dio una medida de la vida útil del estado (antes de que cambie al deslizamiento del ADN). Por lo tanto, se podría estimar una tasa de ATPasa lineal para la segunda fase en función de la vida útil y el número de ATP consumidos durante la vida (ecuación (2)). Tenga en cuenta que la tasa observada en realidad está decayendo a medida que la enzima se disocia de su sitio de reconocimiento. La tasa de ATPasa de la primera fase se estimó mediante un ajuste lineal (Figura complementaria S1D).

La frecuencia y la amplitud de la primera fase de ráfaga de EcoPI fueron muy similares a los valores observados con EcoP15I (Figura 2C). También encontramos que la cinética del cambio de conformación de EcoPI medida por la fluorescencia de triptófano (Figura 2D) mostró una estrecha correspondencia con la cinética de la primera ráfaga (Figura 2E), como se ve para EcoP15I (4). Sin embargo, la cinética de las segundas fases fue bastante diferente, con EcoPI consumiendo un tercio de ATP a una velocidad cinco veces menor.

Demostramos previamente para EcoP15I que la tasa de la segunda fase de ráfaga exponencial correspondía a la disociación limitante de la tasa del ADN (que dado el rápido deslizamiento 1D y la longitud corta del ADN correspondía al tiempo para escapar del sitio) (4). Aunque no pudimos medir la cinética de disociación de EcoPI directamente, podríamos usar la segunda fase de ráfaga exponencial del perfil de ATPasa de EcoPI para inferir que la vida útil en el sitio es ∼11.5 s, que es casi el doble que la de EcoP15I (Figura 2C) . Esto es sorprendente ya que los resultados anteriores sugieren que EcoPI se une más débilmente que EcoP15I (9). La disociación más lenta podría deberse a la tasa de ATPasa observada más lenta. No obstante, la diferencia entre EcoPI y EcoP15I en el número de ATP consumidos en la segunda fase de explosión implicaría que esta etapa del proceso no requiere un número fijo de pasos de hidrólisis de ATP acoplados.

La cinética de la hidrólisis de ATP por EcoP15I está influenciada por la proximidad de los extremos del ADN al sitio

En los experimentos anteriores de EcoP15I, elegimos usar un sustrato oligodúplex corto (Figura 1A) para poder comparar fácilmente los datos de fluorescencia de ATPasa y triptófano con un ensayo de disociación de ADN basado en anisotropía (4). Para examinar si la longitud del ADN estaba afectando la actividad enzimática observada, medimos la cinética de la ATPasa EcoP15I usando ADN lineal más largo (Figura 3A), donde el sitio estaba ubicado centralmente (206 / 206_P15I), o en posiciones distales donde el ADN corriente arriba la longitud (6 / 206_P15I) o la longitud del ADN corriente abajo (206 / 38_P15I) coincidían con las del oligodúplex (6 / 38_EcoP15I, Figura 1A). Además, probamos un sustrato de ADN utilizado posteriormente en el ensayo SPR (89 / 206Bio_P15I - ver más abajo). Los extremos del ADN se dejaron libres de obstáculos de proteínas (es decir, "sin tapón"), de modo que las enzimas deslizantes pudieran disociarse y ser atrapadas por la heparina, dando así una cinética de ráfaga de rotación única.

Cinética de EcoP15I ATPasa utilizando sustratos de ADN más largos. (A) Dibujos animados del oligodúplex y sustratos de ADN más largos. La biotina se representa como un círculo rojo. (B) Los complejos EcoP15I-ADN preformados (25 nM) como se indica se mezclaron rápidamente con ATP 4 mM y heparina 200 µM, y se midió la liberación de fosfato (Materiales y métodos). Se evitó la unión al ADN mediante una trampa de heparina. (C) Ajuste de los perfiles de ATPasa no corregidos a Eq. (3) (gráficos superiores) y las diferencias residuales entre los datos experimentales y los ajustes (gráficos inferiores). Tenga en cuenta que los gráficos de residuos se presentan con una base de tiempo logarítmica para mostrar claramente las desviaciones a lo largo de tres décadas. (D) Constantes cinéticas determinadas para los sustratos de ADN más largos.Los valores cinéticos para la primera y la segunda fase de ráfaga de los perfiles 206 / 38_P15I y 6 / 206_P15I se determinaron usando deconvolución como en la Figura 2. La cinética de la segunda fase no se pudo deconvolucionar fácilmente para 89 / 206Bio_P15I o 206 / 206_P15I (nd = no determinado) . Los números de ATP consumidos se determinaron utilizando la Ec. (3). Las tasas de ATPasa se determinaron usando un ajuste lineal (no mostrado). Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon a partir de tres repeticiones.

Cinética de EcoP15I ATPasa utilizando sustratos de ADN más largos. (A) Dibujos animados del oligodúplex y sustratos de ADN más largos. La biotina se representa como un círculo rojo. (B) Los complejos EcoP15I-ADN preformados (25 nM) como se indica se mezclaron rápidamente con ATP 4 mM y heparina 200 µM, y se midió la liberación de fosfato (Materiales y métodos). Se evitó la unión al ADN mediante una trampa de heparina. (C) Ajuste de los perfiles de ATPasa no corregidos a Eq. (3) (gráficos superiores) y las diferencias residuales entre los datos experimentales y los ajustes (gráficos inferiores). Tenga en cuenta que los gráficos de residuos se presentan con una base de tiempo logarítmica para mostrar claramente las desviaciones a lo largo de tres décadas. (D) Constantes cinéticas determinadas para los sustratos de ADN más largos. Los valores cinéticos para la primera y la segunda fase de ráfaga de los perfiles 206 / 38_P15I y 6 / 206_P15I se determinaron usando deconvolución como en la Figura 2. La cinética de la segunda fase no se pudo deconvolucionar fácilmente para 89 / 206Bio_P15I o 206 / 206_P15I (nd = no determinado) . Los números de ATP consumidos se determinaron utilizando la Ec. (3). Las tasas de ATPasa se determinaron usando un ajuste lineal (no mostrado). Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon a partir de tres repeticiones.

Los perfiles de liberación de fosfato muestran claramente que los extremos proximales del ADN afectan la cinética de la ATPasa (Figura 3B-D). El perfil para 206 / 38_P15I fue claramente bifásico y similar al observado con 6 / 38_P15I (4), aunque con diferencias aparentes en tasas / amplitudes (Figuras 2C y 3D). En contraste, tanto 206 / 206_P15I como 89 / 206Bio_P15I mostraron perfiles de reacción de ATPasa que diferían en apariencia de los perfiles bifásicos claros de 6 / 38_P15I y 206 / 38_P15I. El ADN de 6 / 206_P15I mostró un perfil intermedio, donde una segunda fase era notablemente más pequeña que con 206 / 38_P15I pero aún más visiblemente presente que el ADN con sitios más centralizados. Por lo tanto, parecía que la ubicación de los extremos de ADN tanto hacia arriba como hacia abajo del sitio EcoP15I en el oligodúplex podría influir en la forma de los perfiles de ATPasa observados.

Para 6 / 206_P15I y 206 / 38_P15I, donde el perfil de reacción podría dividirse claramente en dos fases, pudimos aplicar el mismo proceso de deconvolución anterior (Materiales y métodos). Sin embargo, para 206 / 206_P15I y 89 / 206Bio_P15I, no pudimos identificar y ajustar satisfactoriamente una segunda fase de ráfaga. Para comparar los diferentes perfiles, intentamos ajustar los datos sin corregir directamente a un solo exponencial más lineal de estado estacionario (para tener en cuenta un estado estacionario bajo que probablemente refleja la unión del ADN debido a la fuga de la trampa de heparina, ecuación (3), Materiales y métodos) (Figura 3C). Para los perfiles 6 / 206_P15I y 206 / 38_P15I, los gráficos de las diferencias residuales entre los datos ajustados y experimentales mostraron claras desviaciones sistemáticas, particularmente durante la primera fase de ráfaga. Las desviaciones fueron mayores para 6 / 206_P15I, que es más claramente bifásico. Para 206 / 206_P15I y 89 / 206Bio_P15I todavía observamos desviaciones sistemáticas, pero estas eran más pequeñas que los otros sustratos. Dado que no pudimos usar el proceso de deconvolución para estos ADN, usamos la amplitud del ajuste exponencial para estimar el consumo de ATP. La tasa de ATPasa inicial se estimó a partir de un ajuste lineal, como se indicó anteriormente (Materiales y métodos).

Las amplitudes y velocidades determinadas para el ADN más largo se comparan en la Figura 3D. Las tasas observadas de las primeras fases de ráfaga fueron similares para todo el ADN, pero con una amplitud de ráfaga elevada donde los extremos del ADN estaban más alejados del sitio. Por el contrario, las velocidades y amplitudes de ATPasa de la segunda fase de ráfaga variaron notablemente con la posición del sitio. Para 6 / 206_P15I y 206 / 38_P15I, las velocidades de la segunda fase de ráfaga exponencial fueron similares a las medidas para el oligodúplex (Figuras 2C y 3D). Podríamos interpretar esto como una muestra de que la tasa de cambio de un estado de hidrolización de ATP en el sitio a un estado de deslizamiento sin hidrolización es similar en todos estos ADN. Sin embargo, el número de ATP consumidos durante este proceso varía de ∼13 a ∼5, dependiendo de la proximidad de los extremos del ADN. Para 206 / 206_P15I y 89 / 206Bio_P15I consideramos las velocidades y amplitudes de las segundas fases como nominalmente cero en la Figura 3D, aunque observamos que no podemos excluir completamente la hidrólisis de uno o dos ATP después de la primera fase debido a los límites de detección en nuestro ensayo. Estar distante de un extremo de ADN elimina en gran medida el consumo de ATP en la segunda fase. A pesar de no tener un segundo estallido de ATPasa medible, demostramos a continuación que la disociación es tan rápida en 89 / 206Bio_P15I como en el oligodúplex. Por la misma razón, no consideramos que la fase lineal de estado estacionario represente una segunda fase de ATP lenta asociada con una disociación lenta del ADN.

También medimos el cambio en la fluorescencia de triptófano EcoP15I usando 206/206 como sustrato (Figura 4). La cinética se correlaciona estrechamente con la primera explosión de ATPasa, como se vio anteriormente usando el sustrato oligodúplex (4). Estos datos sugieren que la fase única de la actividad ATPasa observada en 206 / 206_P15I y 89 / 206Bio_P15I es suficiente para generar y mantener el cambio conformacional. Parece que la hidrólisis de ATP después del cambio de conformación solo se observa cuando un extremo de ADN corriente abajo está próximo al sitio de reconocimiento.

La cinética de estallido de ATPasa coincide con el cambio en la fluorescencia del triptófano medido utilizando un sustrato de ADN más largo. Comparación del perfil de ATPasa completo (negro) de la Figura 3C con el cambio de fluorescencia de triptófano observado durante la disociación de EcoP15I de 206 / 206_P15I (gris). Para el experimento de fluorescencia de triptófano, las condiciones de reacción finales fueron 206 / 206_P15I 25 nM, EcoP15I 50 nM, ATP 4 mM y heparina 2,5 µM.

La cinética de estallido de ATPasa coincide con el cambio en la fluorescencia del triptófano medido utilizando un sustrato de ADN más largo. Comparación del perfil de ATPasa completo (negro) de la Figura 3C con el cambio de fluorescencia de triptófano observado durante la disociación de EcoP15I de 206 / 206_P15I (gris). Para el experimento de fluorescencia de triptófano, las condiciones de reacción finales fueron 206 / 206_P15I 25 nM, EcoP15I 50 nM, ATP 4 mM y heparina 2,5 µM.

Un ensayo de resonancia de plasmón de superficie para medir la disociación de EcoP15I del ADN sin tapón y tapado

Para correlacionar la ATPasa y la cinética del cambio de conformación en las Figuras 3 y 4 con el inicio del deslizamiento del ADN, desarrollamos un ensayo para seguir la asociación y disociación del ADN compatible con sustratos de ADN más largos (materiales y métodos). Utilizamos un ensayo basado en SPR que permite seguir la disociación del ADN unido a la superficie del chip (a través de un enlace biotina-estreptavidina) en tiempo real y que también permite un intercambio rápido de componentes del tampón (Figura 5A) (17, 18). Las reacciones se corrigieron para la unión de fondo utilizando una superficie de referencia en serie sin ADN (materiales y métodos). En comparación con el ensayo de anisotropía oligodúplex (4), el ensayo SPR tiene la ventaja de que podemos monitorear el ADN lineal de longitudes más largas y que podemos tapar fácilmente el extremo libre del ADN para observar el efecto de solo permitir la endo-disociación. Se preparó un sustrato de ADN con un único sitio EcoP15I (89 / 206Bio_P15I) mediante PCR utilizando un cebador marcado con biotina (Figura 3A) (Materiales y métodos). La unión del ADN a la superficie de estreptavidina / dextrano del chip cubre un extremo del ADN, evitando la disociación durante el deslizamiento a través de este extremo, el extremo opuesto estaba destapado o cubierto con una proteína (ver más abajo). Tras el inicio del deslizamiento por hidrólisis de ATP, la exo-disociación del 89 / 206Bio_P15I sin tapar tardaría & lt3 ms (4, 10). Por lo tanto, todavía podemos usar la tasa de disociación del ADN a través de un extremo como proxy de la tasa de liberación del sitio en el deslizamiento. En otras palabras, cualquier diferencia observada entre las tasas de disociación de 6 / 38_P15I en comparación con 89 / 206Bio_P15I sin límite reflejaría diferentes eventos en el sitio, en lugar de diferencias en la vida útil deslizante.

El ensayo de resonancia de plasmón de superficie para medir la asociación y disociación del ADN por enzimas de modificación de restricción de tipo III. (A) Dibujo de los pasos del ensayo. El ADN utilizado fue 89 / 206Bio_P15I. (B) Cambios representativos en las unidades de respuesta (RU) durante la asociación y disociación de proteínas. Los bloques de colores muestran la inyección continua de enzimas (gris), ATP (4 mM, rojo) o NaCl (verde).

El ensayo de resonancia de plasmón de superficie para medir la asociación y disociación del ADN por enzimas de modificación de restricción de tipo III. (A) Dibujo de los pasos del ensayo. El ADN utilizado fue 89 / 206Bio_P15I. (B) Cambios representativos en las unidades de respuesta (RU) durante la asociación y disociación de proteínas. Los bloques de colores muestran la inyección continua de enzimas (gris), ATP (4 mM, rojo) o NaCl (verde).

En un experimento típico (Figura 5A, Panel superior), se inyectó enzima sobre el chip para unir el ADN. El flujo del tampón fue continuo, lo que permitió la disociación y el equilibrio de la unión a un estado estable. Después de una etapa de lavado, la disociación se inicia mediante la inyección de nucleótidos como ATP (a 4 mM). Finalmente, el chip de ADN se regenera usando NaCl y se pueden realizar más experimentos. Para medir la disociación del ADN protegido (Figura 5A, panel inferior), también incluimos un mutante de helicasa de la enzima de procesamiento final AddAB (AddA H B), en el que se ha mutado el motivo Walker A de AddA (K36A) para evitar la hidrólisis de ATP (Materiales y métodos) (11, 19). Agrega un H B se une estrecha y específicamente a los extremos del ADN y no se ve afectado por el ATP (11, 19). La disociación de EcoP15I de este ADN debe realizarse mediante endo-disociación.

Los perfiles de SPR sin procesar representativos representados como unidades de respuesta frente al tiempo se muestran en la Figura 5B (los intentos de repetir ensayos similares con EcoPI no tuvieron éxito debido al aumento del ruido de fondo y la baja señal de respuesta):

Asociación y disociación de EcoP15I del ADN sin tapón. La inyección de EcoP15I provocó un aumento en las unidades de respuesta correspondientes a la unión específica del ADN en el sitio de reconocimiento. El complejo proteína-ADN formado fue relativamente estable durante el transcurso del tiempo de la reacción. La inyección posterior de ATP 4 mM durante 180 s provocó una disociación rápida y casi completa del ADN en aproximadamente 60 s. La adición del nucleótido provocó un desplazamiento del índice de refracción reproducible en las unidades de respuesta, lo que sugiere una diferencia en la respuesta de fondo para las superficies de referencia y reacción. Las enzimas que permanecieron asociadas con el ADN y / o el chip se eliminaron mediante el lavado con sal, lo que permitió que se repitiera la reacción (nuevamente, observe la caída observada en las unidades de respuesta durante la inyección de sal debido a una anomalía de corrección del índice de refracción).

Unión estable de AddA H B al ADN en presencia de ATP. Inyección de AddA H B provocó un aumento en las unidades de respuesta correspondientes a la unión al ADN. Se observó una pequeña ráfaga de disociación que condujo a un estado estable después del cambio a tampón solo. Aunque la inyección de ATP dio como resultado un cambio en el índice de refracción, después del cambio de regreso al búfer, el nivel de AddA H La unión de B fue casi constante. Agrega un H La asociación B con el ADN podría revertirse posteriormente mediante el lavado con sal.

Asociación y disociación de EcoP15I del ADN protegido. Inyección simultánea de EcoP15I y AddA H B provocó un aumento elevado en las unidades de respuesta correspondientes a la unión del ADN por ambas enzimas (y equivalente a la suma de los cambios en las unidades de respuesta para inyecciones de enzimas consecutivas). Después del cambio a tampón de funcionamiento, se observó un pequeño reequilibrio debido a AddA H B disociación. La inyección posterior de ATP provocó una disociación de la proteína del ADN significativamente más lenta, de acuerdo con una endo-disociación más lenta de EcoP15I (4, 20). El porcentaje real de ADN unido podría corregirse restando las unidades de respuesta correspondientes a AddA H B. Cualquier enzima que quede unida al final de la reacción podría disociarse usando el lavado con sal.

El perfil de disociación del ADN descubierto medido usando el ensayo SPR podría ajustarse a una única desintegración exponencial, con una constante de velocidad de ~ 0,08 / s (Figura 6A). Este valor apareció más lento que el medido usando el ensayo de anisotropía (0,15 / s) (4). Como uno de los socios de unión debe estar inmovilizado, las mediciones de SPR pueden verse afectadas por el efecto de transferencia de masa (21-23). Para unir el ligando inmovilizado, el analito primero tiene que transferirse de la solución a granel a la superficie del chip mediante difusión y convección. Cuando esta transferencia es más lenta que la tasa de asociación analito-ligando, y la tasa de disociación es lenta, la solución cerca de la superficie de interacción puede agotar el analito libre. Esto puede limitar las tasas de activación y desactivación observadas. Para probar si nuestras mediciones se vieron afectadas por la transferencia de masa, medimos la disociación de EcoP15I a velocidades de flujo entre 5 y 100 μl / min (datos no mostrados). La transferencia de masa está influenciada por la velocidad de flujo, mientras que la velocidad de reacción intrínseca no lo está. Para todas las mediciones en este trabajo, aplicamos una tasa de flujo de 30 μl / min donde la tasa de apagado se saturó. Además, razonamos que la tasa observada puede ser más lenta porque después de la adición de ATP y la disociación del ADN, las enzimas se volvieron a asociar con el ADN inmovilizado. Para contrarrestar esto, agregamos heparina en el tampón de funcionamiento para atrapar la enzima disociada. En consecuencia, la disociación observada tuvo una única tasa exponencial muy similar a la del ensayo de anisotropía (Figura 6A). Desafortunadamente, descubrimos que la adición de la trampa de heparina causó problemas importantes en la reproducibilidad entre análisis. Por lo tanto, las reacciones posteriores se llevaron a cabo sin heparina a menos que se indique lo contrario y, por lo tanto, deben compararse con la velocidad de disociación aparente más lenta.

Disociación de EcoP15I del ADN medido usando el ensayo de resonancia de plasmón de superficie. (A) (Gráfico principal) Disociación de EcoP15I-ADN impulsada por la inyección de 180 s de ATP en presencia o ausencia de heparina. Las líneas de trazos grises y las constantes de velocidad asociadas son ajustes exponenciales simples a los datos. (Recuadro) Comparación de la disociación medida por el ensayo SPR en presencia de heparina con la disociación medida a partir de 6 / 38_P15I marcado con hexaclorofluoresceína usando el ensayo de anisotropía (datos de (4)). La línea discontinua gris y la constante de velocidad asociada son un único ajuste exponencial a los datos de anisotropía. (B) Comparación de la disociación de EcoP15I-ADN del ADN sin tapar o tapado en diferentes condiciones. Los tiempos de inyección fueron de 180 s (ATP en ADN sin tapar) o 600 s. (C) Comparación de la disociación de EcoP15I-ADN de ADN sin tapón (U, línea continua) o ADN con tapón (C, línea discontinua) tras la inyección de AMP-PNP o ADP durante 1600 s.

Disociación de EcoP15I del ADN medido usando el ensayo de resonancia de plasmón de superficie. (A) (Gráfico principal) Disociación de EcoP15I-ADN impulsada por la inyección de 180 s de ATP en presencia o ausencia de heparina. Las líneas de trazos grises y las constantes de velocidad asociadas son ajustes exponenciales simples a los datos. (Recuadro) Comparación de la disociación medida por el ensayo SPR en presencia de heparina con la disociación medida a partir de 6 / 38_P15I marcado con hexaclorofluoresceína usando el ensayo de anisotropía (datos de (4)). La línea discontinua gris y la constante de velocidad asociada son un único ajuste exponencial a los datos de anisotropía. (B) Comparación de la disociación de EcoP15I-ADN del ADN sin tapar o tapado en diferentes condiciones. Los tiempos de inyección fueron 180 s (ATP en ADN sin tapar) o 600 s. (C) Comparación de la disociación de EcoP15I-ADN de ADN sin tapón (U, línea continua) o ADN con tapón (C, línea discontinua) tras la inyección de AMP-PNP o ADP durante 1600 s.

La similitud en la cinética de disociación entre el ADN largo y corto (Figura 6A) descarta que las diferencias observadas entre los parámetros cinéticos del segundo estallido de ATPasa en las Figuras 2C y 3D estén correlacionadas con cambios en la tasa de disociación. es decir, la cinética de liberación del sitio es la misma para ambos ADN. En cambio, parecería que la segunda fase de la hidrólisis de ATP está completamente desacoplada del proceso de disociación, y puede ser simplemente un artefacto de la proximidad de los extremos del ADN en el oligodúplex (ver Discusión).

Medimos la disociación del ADN sin taponar y tapado con un rango de nucleótidos (Figura 6B y C) como antes (4). Con ATP, la disociación del ADN protegido mostró un pequeño estallido rápido, seguido de una disociación lenta con una vida media superior a 600 s. Los ensayos de molécula única y de conjunto han sugerido una vida útil de endo-disociación para EcoP15I y EcoPI de ~ 200 s (4, 20). La vida útil más larga observada aquí probablemente refleja eventos de reagrupación dependientes del transporte de masa en ausencia de heparina. La pequeña explosión rápida puede deberse a un subconjunto de enzimas que se disocian directamente del sitio de una manera dependiente de ATP. En el ensayo de molécula única también se observó una disociación directa dependiente de ATP sin un deslizamiento extenso del ADN (4).

La inyección de ADP o del análogo de ATP no hidrolizable AMP-PNP produjo cinéticas de disociación similares a las observadas previamente con el ensayo de anisotropía y usando oligodúplex 6 / 38_P15I (Figura 6C) (4). La cinética de los ADN cubiertos y descubiertos fue similar en cada caso, lo que sugiere que los eventos de endo-disociación predominan con estos nucleótidos. Para AMP-PNP, esto es más probable porque no ocurre deslizamiento y la disociación ocurre directamente desde el sitio. Por el contrario, el ADP puede soportar el deslizamiento de ADN de larga duración (4). Aunque el deslizamiento de ADP es más lento que el deslizamiento de ATP (∼0,5 × 10 6 pasos aleatorios de un solo nucleótido por segundo), EcoP15I debería haber alcanzado el final de 89 / 206Bio_P15I sin tapar en decenas de milisegundos. La disociación lenta observada puede deberse a que el estado de deslizamiento del ADP se une estrechamente a los extremos del ADN, lo que favorece la salida por endo-disociación con una velocidad similar a la del ADN protegido.

Un segundo de hidrólisis de ATP es suficiente para la disociación del ADN durante al menos 20 segundos.

Dado que el ensayo SPR se realizó en condiciones de flujo continuo, nos permitió introducir un reactivo de forma transitoria y luego lavarlo casi instantáneamente con tampón de reacción. La fase inicial de ATPasa y el cambio conformacional se completan en ∼1 s (Figuras 2E, 3B y 4) (4). Dentro de los límites del instrumento Biacore T200, el ATP también se puede inyectar hasta un tiempo de incubación de ∼1 s (materiales y métodos). Por lo tanto, podríamos introducir ATP de forma transitoria para permitir que se complete la mayor parte de la primera fase, cambiar instantáneamente a un búfer de funcionamiento sin ATP para evitar cualquier cambio adicional de ATP y observar el efecto sobre la disociación. Este ensayo modificado también probó si el deslizamiento requiere hidrólisis de ATP, ya que la disociación rápida del ADN no tapado unido a la superficie requería que la enzima viajara por difusión 1D hasta el extremo del ADN libre único (utilizando millones de pasos de pares de bases únicos aleatorizados).

En la Figura 7A se muestra la disociación del ADN sin tapar inducida por un pulso de ATP de 1 s seguido de tampón libre de nucleótidos.La disociación durante el pulso de 1s está enmascarada por la anomalía del índice de refracción (ver arriba), pero puede medirse a partir del porcentaje de unión después del cambio a tampón de reacción. Aunque & lt4% de las enzimas se disociaron durante el pulso de ATP, otro tercio de las enzimas se liberaron de su ADN durante la fase libre de nucleótidos. La disociación en ausencia de ATP siguió una sola exponencial (línea de trazos ajustados en la Figura 7A), con una constante de velocidad similar a la de la presencia de ATP (Figura 6A). Por tanto, la disociación puede continuar al mismo ritmo a pesar de la ausencia de ATP.

El efecto de la introducción transitoria de ATP sobre la disociación de EcoP15I del ADN. (A) La disociación de EcoP15I-ADN medida en el ensayo SPR se inició mediante la inyección de ATP durante 1 s (bloque rojo) seguido de Tampón R + sin nucleótido. La línea discontinua muestra un ajuste a una única función exponencial con disociación incompleta. (B) Comparación de la disociación con variaciones en los tiempos de inyección de ATP. Las líneas discontinuas son ajustes de la tasa de disociación a una sola función exponencial después de volver a Buffer R +. (C) Porcentaje de ADN unido después del pulso de ATP, en función de la duración del pulso de ATP. Los colores son como en el panel B. Los datos se pueden ajustar con una sola función exponencial debido a la cinética del proceso de disociación subyacente. (D) Constantes cinéticas determinadas a partir de ajustes exponenciales simples a los datos del panel B. (Gráfico de la izquierda) La fracción de enzimas que permanecen unidas después del pulso de ATP y que posteriormente se disocian durante el período libre de ATP. (Gráfico de la derecha) La constante de velocidad para la disociación después del regreso a condiciones libres de ATP (Buffer R +).

El efecto de la introducción transitoria de ATP sobre la disociación de EcoP15I del ADN. (A) La disociación de EcoP15I-ADN medida en el ensayo SPR se inició mediante la inyección de ATP durante 1 s (bloque rojo) seguido de Tampón R + sin nucleótido. La línea discontinua muestra un ajuste a una única función exponencial con disociación incompleta. (B) Comparación de la disociación con variaciones en los tiempos de inyección de ATP. Las líneas discontinuas son ajustes de la tasa de disociación a una sola función exponencial después de volver a Buffer R +. (C) Porcentaje de ADN unido después del pulso de ATP, en función de la duración del pulso de ATP. Los colores son como en el panel B. Los datos se pueden ajustar con una sola función exponencial debido a la cinética del proceso de disociación subyacente. (D) Constantes cinéticas determinadas a partir de ajustes exponenciales simples a los datos del panel B. (Gráfico de la izquierda) La fracción de enzimas que permanecen unidas después del pulso de ATP y que posteriormente se disocian durante el período libre de ATP. (Gráfico de la derecha) La constante de velocidad para la disociación después del regreso a condiciones libres de ATP (Buffer R +).

La reacción se repitió con tiempos de pulso de ATP variables (Figura 7B). Aunque los perfiles de disociación durante los pulsos de ATP de 4, 8 o 16 s podrían ajustarse directamente a un exponencial y claramente superponerse entre sí en la Figura 7B, la disociación durante los pulsos más cortos fue demasiado baja para ajustarse con precisión (datos no mostrados). En su lugar, representamos el porcentaje de ADN unido inmediatamente después de cada pulso de ATP frente al tiempo de duración del pulso (Figura 7C). Los datos combinados siguen una sola caída exponencial con una constante cinética consistente con la tasa de disociación esperada. Por lo tanto, cambiar el tiempo del pulso no ha afectado la cinética de disociación observada en presencia de ATP.

Los perfiles de disociación en condiciones libres de nucleótidos que siguen a cada pulso de ATP se ajustaron individualmente a un solo decaimiento exponencial (líneas de puntos en la Figura 7A). Las amplitudes y constantes de velocidad de los ajustes se presentan en la Figura 7D. Independientemente del tiempo de exposición al ATP, EcoP15I continuó disociando el ADN casi al mismo ritmo una vez que se eliminó el ATP. Como se señaló anteriormente para el pulso de 1 s, la tasa de disociación en condiciones libres de nucleótidos fue muy similar a la observada cuando el ATP estaba disponible durante todo el proceso de disociación. La pequeña disminución relativa en la fracción de enzimas que se disociaron después del pulso de 16 s sugirió que las enzimas que permanecen unidas al ADN durante más tiempo en presencia de ATP pueden tener una mayor probabilidad de entrar en un estado de inhibición irreversible.

En los experimentos anteriores, la disociación no se completó. Una razón podría haber sido el reenlace del sitio de reconocimiento durante el proceso de deslizamiento. La unión se observó por primera vez en experimentos de una sola molécula (4). Los eventos fueron reversibles, pero el ATP estuvo presente a lo largo de estas reacciones. Si se requiriera la unión y / o hidrólisis de ATP para escapar del estado de rebote y volver al estado de deslizamiento, entonces la falta de ATP disponible después de los pulsos en la Figura 7 puede haber evitado un regreso al estado de deslizamiento. Una razón alternativa para la disociación incompleta es que después de la liberación del ADN original, el transporte masivo provocó la unión al nuevo ADN. Esto puede haber sido ineficiente ya que tenemos evidencia de que las enzimas EcoP15I liberadas de un extremo del ADN se encuentran en un estado estructural que no puede asociarse con el ADN y que este estado tiene una vida útil de decenas de segundos (4). Para explorar más la disociación incompleta, observamos los efectos de pulsos repetidos de un segundo de ATP intercalados con tampón de funcionamiento (Figura 8A).

El efecto de las adiciones consecutivas de nucleótidos sobre la asociación y disociación del ADN por EcoP15I. (A) La disociación de EcoP15I-ADN medida en el ensayo SPR se inició mediante inyecciones consecutivas de ATP durante 1 s (flechas) seguidas en cada caso por Tampón R + sin nucleótido. (B) Las constantes cinéticas se muestran a partir de los ajustes de los perfiles de disociación del ADN de EcoP15I después de cada pulso de ATP en el panel A a una función exponencial única de compensación. El cambio en la amplitud en función del tiempo total de reacción parece aproximadamente lineal. (C) La disociación de EcoP15I-ADN medida en el ensayo SPR se inició mediante inyecciones consecutivas de: ATP durante 1 s (flecha) seguido de Tampón R + AMP-PNP durante 180 s (bloque gris) seguido de Tampón R + ADP durante 180 s (bloque gris) seguido de Buffer R + y ATP durante 1 s (flecha) seguido de Buffer R +. Las constantes de velocidad cinética y las amplitudes fraccionarias se muestran para la disociación exponencial única producida por cada pulso de ATP.

El efecto de las adiciones consecutivas de nucleótidos sobre la asociación y disociación del ADN por EcoP15I. (A) La disociación de EcoP15I-ADN medida en el ensayo SPR se inició mediante inyecciones consecutivas de ATP durante 1 s (flechas) seguidas en cada caso por Tampón R + sin nucleótido. (B) Las constantes cinéticas se muestran a partir de los ajustes de los perfiles de disociación del ADN de EcoP15I después de cada pulso de ATP en el panel A a una función exponencial única de compensación. El cambio en la amplitud en función del tiempo total de reacción parece aproximadamente lineal. (C) La disociación de EcoP15I-ADN medida en el ensayo SPR se inició mediante inyecciones consecutivas de: ATP durante 1 s (flecha) seguido de Tampón R + AMP-PNP durante 180 s (bloque gris) seguido de Tampón R + ADP durante 180 s (bloque gris) seguido de Buffer R + y ATP durante 1 s (flecha) seguido de Buffer R +. Las constantes de velocidad cinética y las amplitudes fraccionarias se muestran para la disociación exponencial única producida por cada pulso de ATP.

Las ráfagas de disociación consecutivas podrían iniciarse con constantes de tasa exponencial única similares cada vez (Figura 8B, panel izquierdo). Esto sugiere que al menos un subconjunto de enzimas ha rebotado en un sitio (ya sea en el ADN original o en un ADN nuevo) y la disociación puede reiniciarse mediante la introducción de ATP. Sin embargo, la fracción de enzimas que se disociaron disminuyó con cada inyección sucesiva (Figura 8B, panel derecho), lo que sugiere que algunas de las enzimas se acumularon en un estado inhibido irreversiblemente, ya sea en el ADN o en la superficie. Esta inhibición no parece seguir una simple relación exponencial con el tiempo. Para probar si la unión de otros nucleótidos podría reiniciar el deslizamiento por las enzimas de rebote, introdujimos un pulso de ATP de 1 s, permitimos el equilibrio a un estado estable y luego seguimos con pulsos de 180 s de AMP-PNP y ADP (Figura 8C ). Cada nucleótido produjo una cinética de disociación similar a la observada para EcoP15I unido al ADN sin haber visto ATP (Figura 6C). Para ambos nucleótidos, la disociación se detuvo tan pronto como terminó la inyección. Un segundo pulso de 1 s de ATP produjo la cinética de disociación esperada (Figura 8C).


Biología: equilibrio y metabolismo

Las reacciones químicas del metabolismo son reversibles y también alcanzarían el equilibrio si ocurrieran en el aislamiento de un tubo de ensayo. Debido a que los sistemas en equilibrio tienen un mínimo de G y no pueden funcionar, una célula que ha alcanzado el equilibrio metabólico está muerta.

Una célula de nuestro cuerpo no está en equilibrio. El flujo constante de materiales dentro y fuera de la célula evita que las vías metabólicas alcancen el equilibrio, y la célula continúa trabajando durante toda su vida. Este principio está ilustrado por el sistema hidroeléctrico abierto (y más realista).

Un sistema hidroeléctrico cerrado: El agua que fluye cuesta abajo hace girar una turbina que impulsa un generador que proporciona electricidad a una bombilla, pero solo hasta que el sistema alcanza el equilibrio.

Un sistema hidroeléctrico abierto: El agua que fluye sigue impulsando el generador porque la entrada y salida de agua evitan que el sistema alcance el equilibrio.

Un sistema hidroeléctrico abierto de varios pasos: La respiración celular es análoga a este sistema: la glucosa se descompone en una serie de reacciones exergónicas que impulsan el trabajo de la célula. El producto de cada reacción se convierte en el reactivo de la siguiente, por lo que ninguna reacción alcanza el equilibrio.

El ATP potencia el trabajo celular al acoplar las reacciones exergónicas a las reacciones endergónicas:

Trabajo mecánico, como el latido de los cilios, la contracción de las células musculares y el movimiento de los cromosomas durante la respiración celular.

Trabajo de transporte, el bombeo de sustancias a través de las membranas en contra de la dirección del movimiento espontáneo.

Trabajo químico, el empuje de reacciones endergónicas, que no ocurrirían espontáneamente, como la síntesis de polímeros a partir de monómeros.

Acoplamiento de energía: El uso de un proceso exergónico para impulsar uno endergónico. El ATP es responsable de mediar la mayoría de los acoplamientos de energía en las células y, en la mayoría de los casos, actúa como la fuente inmediata de energía que impulsa el trabajo celular.

La estructura y la hidrólisis del ATP:

El ATP contiene el azúcar ribosa, con la base nitrogenada adenina y una cadena de tres grupos fosfato unidos a ella. Puede romperse por hidrólisis. Cuando se rompe el enlace fosfato terminado, una molécula de fosfato inorgánico abandona el ATP, que se convierte en difosfato de adenosina o ADP.

Si el DG de un alcance endergónico es menor que la cantidad de energía liberada por la hidrólisis de ATP, entonces las dos reacciones pueden acoplarse de modo que, en general, las reacciones acopladas sean exergónicas. Debido a que su hidrólisis libera energía, los enlaces fosfato del ATP a veces se denominan enlaces fosfato de alta energía.

Los enlaces fosfato del ATP no suelen ser enlaces fuertes, ya que "alta energía" puede implicar más bien que la propia molécula tiene una alta energía en relación con la de los productos (ATP y P). Las liberaciones de ATP al hidrolizar un grupo fosfato son algo mayores que la energía que la mayoría de las otras moléculas podrían entregar. La cola de trifosfato de ATP es el equivalente químico de un resorte comprimido.

Cómo funciona el ATP:

Cuando el ATP se hidroliza en un tubo de ensayo, la liberación de energía libre simplemente calienta el agua circundante. Los escalofríos utilizan la hidrólisis de ATP durante la contracción muscular para generar calor y calentar el cuerpo. Con la ayuda de enzimas específicas, la célula puede acoplar la energía de la hidrólisis del ATP directamente a los procesos endergónicos mediante la transferencia de un grupo fosfato del ATP a alguna otra molécula, como el reactivo.

Entonces se dice que el receptor del grupo fosfato es fosforilado. La clave para acoplar reacciones exergónicas y endergónicas es la formación de este intermedio fosforilado, que es más reactivo (menos estable) que la molécula no fosforilada original.

La regeneración de ATP:

Un organismo en el trabajo usa ATP continuamente, pero el ATP es un recurso renovable que puede regenerarse mediante la adición de fosfato al ADP. El transporte de fosfato inorgánico y energía se denomina ciclo de ATP y acopla los procesos de producción de energía de la célula (exergónico) con los de consumo de energía (endergónicos).

Debido a que la formación de ATP para ADP y P no es espontánea, se debe gastar energía libre para que ocurra. Las vías catabólicas (exergónicas), especialmente la respiración celular, proporcionan la energía para el proceso endergónico de producir ATP.

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Autor: William Anderson (Equipo editorial de Schoolworkhelper)

Tutor y escritor autónomo. Profesora de Ciencias y Amante de los Ensayos. Artículo revisado por última vez: 2020 | Institución St. Rosemary © 2010-2021 | Creative Commons 4.0


Ver el vídeo: ATP hydrolysis: Gibbs free energy. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (Octubre 2022).